Спосіб лікування розсіяного склерозу з використанням клітин алогенного ембріонального мозку

Корисна модель, що заявляється, стосується медицини, точніше нейрохірургії, і призначена для лікування розсіяного склерозу (PC) у дорослих шляхом використання ін'єкцій клітин алогенного ембріонального мозку. PC - це прогресуюче автоімунне захворювання нервової системи невідомої етіології, в ініціюванні якого важливу роль відіграють вірусна інфекція, спадкова схильність, що реалізується полігенною системою, відповідальною за формування імунної відповіді, і особливості типу метаболізму, а також досі невідомі географічні фактори [1]. Характерним для PC є наявність у хворих ознак антигенспецифічних реакцій до білків ЦНС. Важливим ланцюгом патогенезу PC є аксональне ураження [2]. У численних дослідженнях висувалось припущення, що в репаративний процес при PC включається загальний попередник усіх клітин нервової тканини - нейрогенні стовбурові клітини, дефіцит яких є визначальною ознакою PC. Це й зумовило застосування для лікуванні PC клітин ранніх термінів гестації, бо в ці терміни розвитку ембріон містить багато стовбурових клітин. На сьогодні одним з підходів до лікування PC є застосування клітин, отриманих з тканини мозку ембріону. Цей підхід є ефективним з тієї точки зору, що клітини-попередники мають високий відновлювальний потенціал і можуть інтегруватися в ЦНС реципієнта, поповнюючи кількісний склад клітин нервової системи та забезпечуючи тим самим умови для ремієлінізації аксонів і зменшення моторного дефіциту у хворих на PC. Одним з обмежень, які стримують використання вищеописаного підходу до лікування хворих на PC, є те, що лікування проводять шляхом ендоназального введення клітин алогенної нервової тканини [3]. При такому способі введення частина клітин може не досягти тканини ЦНС через перегородку решітчастої кістки, це зменшує лікувальний ефект способу. Найближчим аналогом (прототипом) способу лікування PC, що заявляється, є спосіб, який передбачає використання стовбурови х клітин, в якості яких застосовують клітини алогенного ембріонального мозку, і який включає заготівлю, кріоконсервування, ін'єкційне ендолюмбальне введення таких клітин в кількості 30-40млн. за одну трансплантацію, яких може бути 1-3 на курс лікування [4]. Описаний спосіб дозволяє дещо збільшити обсяг відновлення неврологічних функцій і, за рахунок цього, досягти певного лікувального ефекту у хворих на PC. Разом з тим у частини пацієнтів не вдається скільки-небудь суттєво вплинути на рухові порушення. При аналізі результатів лікування цих хворих з використанням показників, що характеризують обсяг відновлення неврологічних функцій [5], клінічний ефект характеризувався тільки як незначне покращення, а обсяг відновлення неврологічних функцій в середньому не перевищував 0,5 бала за шкалою EDSS. Завдання, яке вирішує корисна модель, що заявляється, полягає в підвищенні ефективності лікування PC шляхом оптимізації лікувального ефекту клітин алогенного ембріонального мозку, яка досягається за рахунок додаткових ендолюмбальних ін'єкцій екстракту тканини ембріонального мозку. Це може впливати на процеси аксонального ураження, зменшуючи його. Технічний результат, що досягається корисною моделлю, буде полягати у створенні передумов для посилення локомоторної активності хворих на PC і, як результат, у збільшенні обсягу відновлення неврологічних функцій у хворих. Поставлене завдання досягається тим, що у відомому способі лікування PC з використанням клітин алогенного ембріонального мозку, який включає заготівлю, кріоконсервування, ін'єкційне ендолюмбальне введення таких клітин в кількості 30-40млн. за одну трансплантацію, яких може бути 1-3 на курс лікування, згідно корисної моделі, хворому попередньо, за тиждень до власне лікування, ендолюмбально вводять екстракт тканини ембріонального мозку з молекулярною масою більше 5кДа і менше 120кДа і концентрацією білку 150мкг/мл у кількості 5,0мл за одну ін'єкцію, яких, за умови відсутності фебрильної реакції, всього може бути до 3 з інтервалом 2-3 доби. Відмінною особливістю способу, що заявляється, є те, що хворому на PC до власне лікування проводять ендолюмбальні ін'єкції екстракту тканини ембріонального мозку, а вже потім трансплантують клітини алогенного ембріонального мозку - і все це протягом одного курсу лікування. Нейрохірургічний підхід - ендолюмбальне введення (у лікворні простори та паренхіму ЦНС хворого на PC) спочатку екстракту тканини ембріонального мозку, а потім клітин алогенного ембріонального мозку - забезпечує доставку необхідних клітинних субстанцій і біологічно активних макромолекул у місця руйнування тканини ЦНС, суттєво знижує небажані втрати лікувального ефекту, пов'язані з можливим швидким розпадом біологічних факторів та загибеллю стовбурови х клітин, які становлять більшість серед клітин ембріонального мозку данного терміну гестації. Це дозволяє суттєво покращити результати лікування рухови х порушень у хвори х на PC, зменшити ступінь рухового де фіциту, покращити зір, поновити інші втрачені функції. За відомими літературними даними такий спосіб лікування PC не відомий. Запропонований спосіб лікування здійснюється наступним чином. Забір мозку ембріону людини проводять під час переривання фізіологічної 7-9 тижневої вагітності з дотриманням вимог чинного законодавства України та міжнародних правових норм. Тканину закладки кори ембріонального мозку суспендують фізичним методом. Одну частину клітин використовують для кріоконсервування, а другу частину обстежують на вірусну та бактеріологічну інфікованість. Перед використанням суспензії клітин мозку ембріону визначають їх фізико-хімічні властивості, концентрацію клітин, життєздатність, морфологічні показники, функціональну повноцінність, адгезивний потенціал. Отримання екстракту тканини ембріонального мозку проводять наступним чином. Мозок ембріону, кріоконсервований у рідкому азоті, безпосередньо перед використанням розморожують, гомогенізують з додаванням фізіологічного розчину до кінцевої концентрації 10% в/о, центрифугують при 4000g. За допомогою мембранних фільтрів виділяють біологічно активну фракцію з молекулярною масою більше 5кДа і менше 120кДа, в отриманому фільтраті виміряють концентрацію білку (за Лоурі) та фізіологічним розчином доводять концентрацію білку до 150мкг/мл. Стерилізують отриманий препарат з використанням фільтрів "Мілліпор" з розміром пор 22мкм, розливають в ампули по 5мл і зберігають при температурі, нижчій за -18°С. Перед використанням препарату проводять тестування його біологічної активності. Препарат з підтвердженою біологічною активністю вводять хворому на PC. Під місцевим знеболюванням Sol. Lidocaini 0,5% 2,0мл в проміжку між 3 та 4 остистими виростами поперекових хребців проводять пункцію субарахноїдального простору. Після отримання та забору під контролем мандрена 1мл прозорого ліквору для клінічних досліджень вводять 5мл екстракту ембріонального мозку. Пункційну голку витягають. Накладають асептичну пов'язку. Таких ендолюмбальних ін'єкцій екстракту на курс лікування може бути 1-3 в залежності від індивідуальної реакції. Через 2-3 дні після проведення останньої ендолюмбальної ін'єкції екстракту ембріонального мозку починають власне лікування PC. Хворому під місцевим знеболюванням Sol. Lidocaini 0,5% 2,0мл в проміжку між 3 та 4 остистими виростами поперекових хребців знову проводять пункцію субарахноїдального простору. Після забору під контролем мандрена 1мл прозорого ліквору для клінічних досліджень вводять 1мл (30-40´106) ембріональних нейроклітин у вигляді суспензії. Введення менше ніж 30´106 ембріональних клітин є малоефективним, а застосування більшої кількості клітин може супроводжуватися негативними побічними явищами. Пункційну голку витягають. Накладають асептичну пов'язку. В горизонтальному положенні з опущеним головним кінцем ліжка хворий знаходиться 2 години. Таких ендолюмбальних трансплантацій ембріональних клітин на курс лікування може бути 1-3 в залежності від індивідуальної реакції. Перевагами застосування екстракту мозку ембріону в комбінації з алогенними ембріональними нейроклітинами є те, що у цьому препараті зберігається нативна структура біологічно активних макромолекул ембріонального мозку, препарат має властивості збільшувати активність ацетилхолінестерази в культурі нервових клітин кори головного мозку людини, містить білки з молекулярною масою більше 5кД і менше 120кД [6]. Таким чином, при комбінованому застосуванні цього екстракту та клітин алогенного ембріонального мозку створюються умови для більш ефективного відновного впливу на р ухові функції хворого. Трансплантовані клітини можуть функціонувати в ЦНС хворого на тлі значного збільшення в лікворі факторів, які позитивно впливають на нервові клітини, активують їх функціональний стан, зменшують аксональну дегенерацію. Одночасно в лікворі збільшується кількість факторів, що можуть чинити опосередкований відновний вплив за рахунок потенціювання лікувального ефекту трансплантованих клітин алогенного ембріонального мозку. Такі умови можуть сприяти більш активній інтеграції нейроклітин в ЦНС реципієнта, замісному ефекту, поповненню кількісного складу клітинпопередників, забезпечуючи тим самим кращі умови для ремієлінізації аксонів, відновлення нервової тканини і зменшення моторного дефіциту у хворих на PC. Конкретний приклад втілення. Хворий І-ко С.М., № історії хвороби 3044, поступив у відділення відновної нейрохірургії Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України 20.05.2004 з діагнозом PC, цереброспинальна форма, вториннопрогредієнтний тип перебігу, 4-ий ступінь тяжкості. На МРТ в білій речовині перивентрикулярно в ділянці бокових шлуночків мозку виявлено вогнища демієлінізації приблизно 0,5-0,7см в діаметрі. Нижній спастичний парапарез, протягом 2 років хворий практично не ходить. Оцінка ступеня неврологічного дефіциту по шкалі EDSS - 7,0 балів. Медикаментозне лікування не ефективне. Під місцевим знеболюванням Sol. Lidocaini 0,5% 2,0мл в проміжку між 3 та 4 остистими виростами поперекових хребців проведено пункцію субарахноїдального простору. Отримано прозорий ліквор. Лікворний тиск 120мм в. ст. Ендолюмбально введено 5,0мл препарату з ембріонального мозку. На шкіру накладено асептичну пов'язку. Через добу після маніпуляції стан хворого задовільний, скарг немає, температура 36,7°С. Через 2 доби хворому проведено ендолюмбальне введення суспензії нейроклітин ембріону. Протокол операції. Назва операції - ендолюмбальне введення суспензії нейроклітин ембріону. Нейроклітини ембріону людини розморожено згідно інструкції (температура води 38-40°С). Під місцевим знеболюванням Sol. Lidocaini 0,5% 2,0мл в проміжку між 3 та 4 остистими виростами поперекових хребців проведено пункцію субарахноїдального простору. Отримано прозорий ліквор. Лікворний тиск 120мм в. ст. Ендолюмбально введено 1мл суспензії ембріональних нейроклітин (30х106). Голка витягнена. На шкіру накладено асептичну пов'язку. Через добу після маніпуляції стан хворого задовільний, скарг немає, температура 36,7°С. Хворого виписано у задовільному стані. 16.05.2005 хворий поступив для чергового курсу лікування. 12 місяців тому пройшов курс лікування ендолюмбальним введенням екстракту ембріонального мозку та наступною трансплантацією алогенних ембріональних нейроклітин. Обстеження хворого засвідчило помірне (обсяг відновлення неврологічних функцій 1,0 бал) зменшення рухового дефіциту, зменшилася слабкість та еластичність в нижніх кінцівках, хворий пересувається за допомогою палочки, по квартирі ходить, тримаючись за стіни. Ефект лікування зберігається протягом 12 місяців. При огляді - черепно-мозкові нерви без патології. М'язова сила у кінцівках 4 бали. Спастичний нижній парапарез. Симптоми Бабінського з обох боків. Черевні рефлекси відсутні. Оцінка за шкалою EDSS - 6,0 балів. Хворому проведено черговий курс лікування шляхом ендолюмбального введення екстракту ембріонального мозку та трансплантації алогенних ембріональних нейроклітин. Спостереження триває. За період з 2004 по 2006 рік в клініці відновної нейрохірургії Інституту нейрохірургії імені акад. А.П. Ромоданова АМН України проліковано 24 хворих на PC з використанням алогенних ембріональних нейроклітин. 7 з цих хворих лікувалися комбінованим методом із застосуванням на першому етапі екстракту ембріонального мозку, а на другому етапі - трансплантації алогенних ембріональних нейроклітин. Результати лікування приведені в таблиці 1. Табли ця 1. Ефект ендол юмбал ьного застос ування нейрок літин ембріо ну людин и в комбін ації з попере днім введен ням екстра кту тканин и ембріо нально го мозку у хворих на PC О б с я г в і д н К О о і б в л с л ьС К тк е е х нл і ж е ні с е мя н т н а і ь і нч лен с х і ви п в к рй о о уо с р т в ле і а оф е нг е р н ні к е а ячт ж е н P и н C х ь ф у н к ц і й , б а л и Е Х н в д о о р л і ю м н б а а л P ь C н , е л і к о в а н і в в е д е0 н, н6 я( 0 к 1 е, л 7 м0 і бт р1 и і, н о5 а н) м а и л ь а н л и о х г е н н е н й о р г о о к л і т и н Е1 н, д5 о3 л( ю 0 м, б5 ал2 м ь, о н0 з е) Р к у в< в0 е м б р і о н а л ь н о г7 о Н е з н а ч н е п о к р а щ е н н я П о м і р н е т а з н а ч н е, д0 е5 н н я е к с т р а к т у т к а н и н и е м б р і о н а л ь н о г о м о з к у т а е м б р і о н а л ь н и х н е й р о е п о к р а щ е н н я к л і т и н Як засвідчують ви щенаведені дані, у хворих після комбінованого застосування екстракту ембріонального мозку та наступної трансплантації алогенних ембріональних нейроклітин мало місце помірне та значне покращення неврологічного стану (без попереднього ендолюмбального введення екстракту ембріонального мозку лікувальний ефект було оцінено як незначне покращення). Таким чином, запропонований метод дозволив збільшити ефективність лікування хворих на PC, про що свідчило достовірне збільшення обсягу відновлення неврологічних функцій з одночасним покращанням рухови х функцій. Список літератури. 1. Гусев Е.И., Демина Т.Л., Бойко А.Н. Рассеянный склероз. // Москва. -1997-463с. 2. Завалишин И.А., За харова М.Н. Рассеянный склероз : основные аспекты патогенеза. // В кн. Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания. Под ред. Е.И. Гусева, И.А. Завалишина, А.Н. Бойко.«Миклош».- 2004. - 526с. 3. Миронов Н.В., Шмырев В.И., Миронов И.Н. Интраназальный метод лечения неврологических больных введением фетальных клеток человека. // Пат. №2002103547 RU Опубл. 2004-04-20; 4. Цимбалюк B.I., Маркова О.В., Пічкур Л.Д., Вотякова І.А. Спосіб лікування розсіяного склерозу з використанням стовбурових клітин // Пат. № 15356 (UA).- Оп убл. 15.06.2006.- Бюл. №6. - 6с. 5. Мяловицька О.А., Колендо О.О. Спосіб оцінки ефективності імуносупресивної терапії у разі лікування розсіяного склерозу. // Пат. №60109 UA. -Промислова власність. Офіційний бюлетень №9, 2003.- с.174-178. 6. Цимбалюк B.I., Васильєва І.Г. Спосіб отримання лікарського препарату з ембріонального мозку. //Пат. №34141 UA. -Оп убл. 15.02.2001.