Спосіб детекції babesia canis у біологічних зразках за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб детекції Babesia canis у біологічних зразках за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає проведення ПЛР, підготовку буфера, ампліфікацію, детекцію ампліфікаційної ДНК, який відрізняється тим, що використовують хромосомальний ген 18S rRNA, що складається з таких послідовностей пар праймерів: ' S18-R 5 -caatcctgacacagggaggt, ' S16-L 5 -ccgtcaacgcaaaaatacaa, ' S18-Rin 5 -gcaacaagtttaatatacgctattgg, S18-Lin 5'-gaatgatggtgacccaaacc, для виявлення ДНК Babesia canis. (19) (21) u200910524 (22) 16.10.2009 (24) 10.03.2010 (46) 10.03.2010, Бюл.№ 5, 2010 р. (72) ПРИХОДЬКО ЮРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, НІКІФОРОВА ОЛЬГА ВАСИЛІВНА, СИМОНЕНКО ВАСИЛЬ ІВАНОВИЧ, КУЛЬШИН ВОЛОДИМИР ЄВГЕНОВИЧ, РЕШЕТИЛО ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ, ІЛЬКІВ ЛІДІЯ МИКОЛАЇВНА, ШУШВАЛ ВІКТОРІЯ ВАСИЛІВНА (73) ПРИХОДЬКО ЮРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, НІКІФОРОВА ОЛЬГА ВАСИЛІВНА, СИМОНЕНКО ВАСИЛЬ ІВАНОВИЧ, КУЛЬШИН ВОЛОДИМИР ЄВГЕНОВИЧ, РЕШЕТИЛО ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ, 3 48336 ку буферу, ампліфікацію, детекцію ампліфікаційної ДНК шляхом використання хромосомального гену 18S rRNA, що складається з таких послідовностей пар праймерів: S18-R 5` - caatcctgacacagggaggt S16-L 5`-ccgtcaacgcaaaaatacaa S18-Rin 5` - gcaacaagtttaatatacgctattgg S18-Lin 5` - gaatgatggtgacccaaacc для виявлення ДНК Babesia canis, щоб забезпечити ефективність способу детекції Babesia canis. Спосіб виконується таким чином. Приклад 1. Проведення ПЛР 1. ДНК праймери для гена-мішені 18S рРНК, були підібрані з використанням програми GeneRunner v.3.0 і синтезовані фірмою «Літех» (Росія). Послідовності пар праймерів для гена 18S рРНК: S18-R 5` - caatcctgacacagggaggt S16-L 5` - ccgtcaacgcaaaaatacaa S18-Rin 5` - gcaacaagtttaatatacgctattgg S18-Lin 5` - gaatgatggtgacccaaacc Розміри продуктів ПЛР 414 та 120 нуклеотидів відповідно. 2. Виділення ДНК із зразків здійснювали за допомогою набору для виділення ДНК фірми «Мініпреп» (Сілекс М, Росія). 3. Буфер для ампліфікації містив 10мМ Трис НСl (р 8,3), 50мМ KСl, 0,01% альбуміну і по 200мкМ дезоксинуклеозид трифосфатів (dATP, dTTP, dCTP, dGTP). На 50мкл реакційної суміші додавали 50пмоль кожного праймера і 1од. Tagполімерази. Для проведення ПЛР із різними праймерами були необхідні наступні додаткові умови: для пар праймерів - 18S-R/L - 1,5мМ MgCl2 та для 18S-Rin/Lin - 2,5мМ. Виділену із проб ДНК додавали в кількості 5мкл. Для запобігання випару реакційної суміші зверху нашаровували 50мкл мінерального олії. 4. Ампліфікацію проводили з використанням наступних програм: Для пар праймерів 18S-R/L та 18S-Rin/Lin 4 94°С 3хв (1 цикл) 94°С 10 сек 59°С 10 сек 72°С 10 сек (10 циклів для зовнішньої пари праймерів і 30 для внутрішньої пари). 5. Детекцію ампліфіційної ДНК здійснювали з використанням електрофорезу в 1,5% агарозному гелі в ТБЕ - буфері. Для цього 10мкл ампліфіційного зразка наносили в лунку агарозного гелю, і витримували при 20мвт/см протягом 15хв. Забарвлення гелю здійснювали 0,1% розчином етидія броміду протягом 5хв. Приклад 2. Порівняльна оцінка чутливості розробленого способу для виявлення ДНК Babesia canis. (Табл.). Аналіз чутливості розробленого способу, при дослідженні ДНК виділеної із крові хворих тварин, проводили в порівнянні з мікроскопічним методом. Збіг результатів тестування за допомогою мікроскопії і розробленого нами способу було відзначено в в 204 (92,72%) з 220 випадків. Також цим способом було виявлено позитивних проб на 15 більше, що свідчить про вищу чутливість даного способу виявлення збудника. Детекція специфічної ДНК В. canis за допомогою ПЛР, яка спрямована на пряме виявлення збудника в біологічних зразках, є простим високочутливим і високоспецифічним способом для діагностики бабезіозу на різних стадіях захворювання. Використання в тест-системі варіанта з використанням однієї пари праймерів до гена-мішені (Nested-ПЛР), дозволяє підвищити чутливість виявлення ДНК В. Canis при встановленні ураженості кліща. Таблиця Мікроскопія «+» n=78 «-» n=142 Пропонований спосіб «+» «-» 77 1 15 27 • «+» - позитивні, «-» - негативні зразки Комп’ютерна верстка М. Ломалова Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601