Спосіб ідентифікації giardia intestinalis у популяції собак за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб ідентифікації Giardia intestinalis у популяції собак за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає проведення ПЛР, пробопідготовку, ампліфікацію, детекцію ампліфікаційної ДНК, який відрізняється тим, що використовують ДНК ген бетагіардину, який складається з таких послідовностей пар праймерів: 5'-CAGCGCGTCAGCAGGTTCCA 5'-GGGCCTCCTTCCTGAGGGCT. (19) (21) u201004623 (22) 19.04.2010 (24) 11.10.2010 (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) ПРИХОДЬКО ЮРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ПОНОМАРЕНКО ВОЛОДИМИР ЯКОВИЧ, КУЛЬШИН ВОЛОДИМИР ЄВГЕНОВИЧ, БУЛАВІНА ВІКТОРІЯ СЕРГІЇВНА (73) ПРИХОДЬКО ЮРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ПОНОМАРЕНКО ВОЛОДИМИР ЯКОВИЧ, КУЛЬШИН 3 5'-CAGCGCGTCAGCAGGTTCCA 5'-GGGCCTCCTTCCTGAGGGCT. Ампліфікацію проводять в об'ємі 25 мкл реакційної суміші з використанням набору для проведення ПЛР (Сілекс М, Росія). Реакція продовжувалася протягом 35 ампліфікаційних циклів, по наступній програмі: 95С-15 сек. 59С-10 сек. 72С-10 сек. Буфер для ампліфікації містив 10мМ Трис НС1 (р 8,3), 50 мМ КСl, 0,01% альбуміну і по 200мкМ дезоксинуклеозид трифосфатів (dATP, dTTP, dCTP, dGTP). На 50мкл реакційної суміші додають 50пмоль кожного праймеру і 1од. Tag-полімерази. Виділену із проб ДНК додають в кількості 5мкл. Для запобігання випару реакційної суміші зверху нашаровують 50мкл мінеральної олії. Детекцію ампліфіційної ДНК здійснюють з використанням електрофорезу в 1,5% агарозному гелі в ТБЕ- буфері. Для цього 10мкл ампліфіційного зразку наносять в лунку агарозного гелю, і витримують при 20мвт/см протягом 15хв. Забарвлення гелю здійснюють 0,1% розчином етидію броміду протягом 5хв. Розмір специфічного продукту складав 348п.н. 53593 4 Приклад Порівняльна оцінка чутливості розробленого способу для ідентифікації ДНК Giardia intestinalis. (Табл.). Аналіз чутливості розробленого способу, при дослідженні ДНК виділеної з фекалій хворих тварин, проводили в порівнянні з методами копроскопії. Було відзначено, що коефіцієнт збігу за методами копроскопії і ПЛР склав 53,84%. При одночасному обстеженні собак за допомогою копроскопії та ПЛР встановлено, що за даними дослідження фекалій екстенсивність інвазії складала 30,43%, за даними ПЛР - 56,52%. Результати дослідження фекалій за допомогою ПЛР на наявність антигенів Giardia intestinalis та Cryptosporidium parvum вказують на поширення цих найпростіших серед обстежених тварин. Серед 83 обстежених собак встановлено 29 (34,93%) позитивних проб на Giardia intestinalis та 18 (21,68%) на Cryptosporidium parvum, змішане ураження собак Giardia intestinalis + Cryptosporidium parvum складало 10 випадків (12,04%). Таким чином ПЛР є сучасним та більш достовірним способом діагностики гіардіозу тварин та може використовуватись в лабораторіях ветеринарії і медицини. Таблиця Спосіб ідентифікації Giardia intestinalis у популяції собак за допомогою полімеразної ланцюгової реакції № проби 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Дані копроскопічних досліджень (кількість цист у полі зору) 2-3 3-4 2-3 1-3 1-2 3-5 2-6 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Підписне Дані ПЛР Giardia intestinalis + + + + + + + + + + + + + Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601