Спосіб виявлення рнк вірусу сказу за допомогою зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції
Номер патенту: 52924
Опубліковано: 10.09.2010
Автори: Дерябін Олег Миколайович, Головко Максим Анатолійович, Бабкін Михайло Валерійович, Ушкалов Валерій Олександрович
Формула / Реферат
Спосіб виявлення РНК вірусу сказу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (РНК) за допомогою "гніздового" варіанта зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР), який відрізняється тим, що для проведення ПЛР на першому етапі використовують штучно синтезовані олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю нуклеотидів:
Rb-1F 5'-TGCCGACAAGATTGTATTC-3',
Rb-9R 5'-ATGCTCAGGGACAGTGG-3',
довжина фрагмента, що синтезується, - 406 н. з.,
на другому етапі використовують штучно синтезовані вироджені олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю нуклеотидів:
Rb-MF 5'-TTGAAGCCTGARATTATMGT-3',
Rb-6R 5'-ATAGCTGGTCCAGTCTTCCG-3',
де: R=A/G, M=A/C,
довжина фрагмента, що синтезується, - 231 н. з.
Текст
Спосіб виявлення РНК вірусу сказу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (РНК) за допомогою "гніздового" варіанта зворотно 3 52924 теж відносяться до генотипа 1, вказані праймери не реагують [6]. В зв'язку з цим, актуальним питанням є розробка ефективного, специфічного і швидкого методу детекції збудника. Правильний вибір олігонуклеотидних праймерів визначає специфічність і відтворюваність ЗТ-ПЛР. Задача: створити новий спосіб виявлення вірусу сказу в об'єктах зовнішнього середовища та при проведенні прижиттєвої (зразки біологічного матеріалу) та постмортальної (мозок) діагностики сказу. Завдання досягається тим, що в досліджуваних зразках виявляють специфічні фрагменти нуклеїнових кислот (РНК) за допомогою «гніздового» варіанту зворотно-транскриптазної полімеразної 4 ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) - ферментативної реакції і чотирьох штучно синтезованих олігонуклеотидів (праймерів), які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки кДНК інфекційного агенту при температурних і часових параметрах та кількості циклів наведених в таблицях 1 та 2: Для проведення першої реакції використовують дві пари штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: Rb-1F-5'-TGCCGACAAGATTGTATTC-3' Rb-9R-5'-ATGCTCAGGGACAGTGG-S' Праймери Rb-1F та Rb-9R специфічні консервативній ділянці гена нуклеопротеїну (N) вірусу сказу і забезпечують синтез фрагменту ДНК розміром 406 н. з. Таблиця 1 № циклу 1 2 3 4 Температура 95°С 95°С 60°С 72°С 72°С 10°С Для проведення другої реакції використовують дві пари штучно синтезованих вироджених олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: Rb-MF-5'-TTGAAGCCTGARATTATMGT-3' Rb-6R-5'-ATAGCTGGTCCAGTCTTCCG-3', де: R=A/G, M=A/C. Час 4 хв. 0,5 хв. 0,5 хв. 0,5 хв. 4 хв. Зберігання Кількість циклів 1 35 1 Праймери Rb-MF та Rb-6R специфічні консервативній ділянці гена нуклеопротеїну (N) вірусу сказу і забезпечують синтез фрагменту ДНК розміром 231 н.з. Виродженість олігонуклеотидних праймерів підвищує специфічність реакції оскільки враховує відмінності нуклеотидного складу гена нуклеопротеїну вірусу сказу різних генотипів. Таблиця 2 № циклу 1 2 3 4 Температура 95° С 95° С 60° С 72° С 72° С 10° С Приклад: пробу ( гомогенат патологічного матеріалу, тощо) (1г) поміщають у пластикову пробірку ємністю 1,5 см3 і додають 0,5 см3 деіонізованої води. Суміш струшують і центрифугують, після чого проводять виділення РНК набором реагентів для виділення РНК. З виділеної РНК за допомогою реакції зворотної транскрипції синтезують кДНК. Отриману кДНК (0,003 см3) поміщають у пробірку ємністю 0,5 см3 в якій знаходиться попередньо підготовлена суміш наступного складу: 0,005 см3 (5Х) ПЛР-буфера, що містить 15 мМ сульфата магнію; 0,001см3 dNTP, по 0,00015 см3 праймерів Rb-1F та Rb-9R, 0,0005 см3 Taq-полімерази, 0,00152 см3 ДЕПС-води та 1 крапля мінерального масла. Пробірку переносять в термоциклер з активною регуляцією температури, наприклад "Тер Час 4 хв. 0,5 хв. 0,5 хв. 0,5 хв. 4хв Зберігання Кількість циклів 1 35 1 цик" (Росія), якому задають вищевказану програму (таблиця 1). Після закінчення першої реакції 0,003 см3 ампліфікату переносять у пробірку ємністю 0,5 см3 в якій знаходиться попередньо підготовлена суміш наступного складу: 0,005 см3 (5Х) ПЛР-буфера, що містить 15 мМ сульфата магнію; 0,001см3 dNTP, по 0,00015 см3 праймерів - Rb-MF та Rb-6R, 0,0005 см3 Taq-полімерази, 0,00152 см3 ДЕПС-води та 1 крапля мінерального масла. Пробірку переносять в термоциклер з активною регуляцією температури, наприклад "Терцик" (Росія), якому задають вищевказану програму (таблиця 2). Аналіз результату ЗТ-ПЛР проводять в 1,5% гелі агарози з барвником -бромистим етидієм. В лунки агарозного гелю вносять 0,01 см3 ампліфікованої суміші. Після проведення електрофорезу 5 52924 фрагменти ДНК виявляють під ультрафіолетовим світлом. Результат ЗТ-ПЛР може бути оцінено візуально по наявності смужок, що відповідають продуктам реакції. Промислове застосування - для виявлення вірусу сказу з родини Rhabdoviridae роду Lyssavirus в об'єктах зовнішнього середовища та при проведенні прижиттєвої (зразки біологічного матеріалу) та постмортальної (мозок) діагностики сказу. Використана література 1. Tordo N. The rabies virus genome: an overview. Tordo N., Kouknetzoff A. - Vet Res, 1994. Vol.67, P. 45-49. 2. Сюрин B.H. Вирусные болезни животных. / Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. -М., 1998. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 6 3. Bourhy Н. Molecular diversity of the lyssavirus genus. / Bourhy H., Kissi В., Tordo, N. -Virology ,1993. -Vol.194, P.70-81. 4. Kulonen, I. Differentiation of two rabies strains in Estonia with Reference to recent finnish isolates / Kulonen, I. Boldina A. - Journal of Wildlife Diseases. 29 (2)-1993-P. 209-213. 5. D.David Antemortem detection and virus characterization of three human rabies fatalities in Israel between 1996-1997. / D. David, С E. Rupprecht, J. S. Smith. -Israel journal of veterinary medicine, 1999. Vol.53 (4). - P.20-32. 6. Гришок Л.П. Вивчення молекулярногенетичних варіантів вуличного вірусу сказу на території України. / Гришок Л.П., Іванов М.Ю., Дерябін О.М. -Ветеринарна медицина України, 2010 № 2. - С.17-19. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethod for detecting rna of rabies virus by reverse transcriptase polymerase chain reaction
Автори англійськоюDeriabin Oleh Mykolaiovych, Holovko Maksym Anatoliiovych, Babkin Mykhailo Valeriiovych, Ushkalov Valerii Oleksandrovych
Назва патенту російськоюСпособ выявления рнк вируса бешенства с помощью обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции
Автори російськоюДерябин Олег Николаевич, Головко Максим Анатольевич, Бабкин Михаил Валерьевич, Ушкалов Валерий Александрович
МПК / Мітки
МПК: A61K 39/205
Мітки: реакції, ланцюгової, спосіб, вірусу, рнк, сказу, полімеразної, виявлення, допомогою, зворотно-транскриптазної
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/3-52924-sposib-viyavlennya-rnk-virusu-skazu-za-dopomogoyu-zvorotno-transkriptazno-polimerazno-lancyugovo-reakci.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб виявлення рнк вірусу сказу за допомогою зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції</a>
Попередній патент: Дозатор
Наступний патент: Спосіб патогенетичного лікування хворих на бронхіальну астму
Випадковий патент: Спосіб розріджування крохмалю