Спосіб активації ферментів глутатіонзалежної системи детоксикації печінки в експерименті

Спосіб активації ферментів глутаті он залежно і системи детоксикації печінки в експерименті, який включає біохімічне дослідження цитозолю печінки тварин, який відрізняється тим, що здійснюють вплив омега-3 поліненасиченими жирними кислотами в серед ньотерапевтичній дозі безпосередньо на цитозоль печінки Винахід відноситься до галузі медицини і може бути використаний для моделювання активації ферментів глутаті он залежно і системи детоксикації печінки in vitro В патогенезі більшості захворювань важливе місце займають процеси вільнорадикального окислювання Контроль процесу накопичення продуктів перекисного окислення ЛІПІДІВ, а також захист організму від токсичної дії ХІМІЧНИХ речовин самої різної природи належить системі, яка предствлена глутатюнзалежними ферментами глутаті о нтра нефе раза, глутатюнредуктаза, глутатюнпероксидаза Активація ферментів глутаті он залежно і системи детоксикації необхідна для посилення процесів знешкодження токсичних речовин ендогенного та екзогенного походження Відомий спосіб активації ферментів глутаті он залежно і системи детоксикації печінки в експерименті шляхом введення тваринам фенобарбіталу (див Панченко Л Ф , Герасимов А М , Коен Я И , Королева Л Н Повышение активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы печени крыс путем введения фенобарбитала // Фармакология и токсикология 1975 -Т 38-№3 Однак, вказаному способу властиві наступні недоліки - спосіб вимагає значних затрат часу, тому що для отримання моделі, тварини вживали фенобарбітал з питною водою протягом 7 днів, - спосіб не дає можливості визначити механізм, за допомогою якого реалізується активуюча дія фенобарбіталу Найбільш близьким по технологічній сутності до способу, що заявляється, є спосіб активації ферментів глутаті он залежно і системи детоксикації печінки в експерименті шляхом введення ембихшу під шкіру експериментальним тваринам ( див Бойцова ЛВ Роль глутатионовой антипероксидной системы в механизме цитотоксического действия эмбихина // Укр биохим журн - 1997 - Т 69 - №4 - С 99-103), з наступним біохімічним дослідженням цитозолю печінки Однак, даному способу властиві такі недоліки - спосіб вимагає значних затрат часу, через те, що для виявлення впливу ембихшу потрібно 6 годин, - ембихін має цитотоксичну дію, - спосіб дозволяє оцінити тільки загальний функціональний стан ферментної глутаті он залежно і системи і не показує, як діє ембихін на ферменти - безпосередньо чи опосередовано В основу винаходу поставлена задача удосконалити спосіб активації ферментів глутаті он залежно і системи детоксикації печінки в експерименті, в якому шляхом впливу омега-3 поліненасичених жирних кислот (омега-3 ПНЖК) на цитозоль печінки тварин, здійснюється активація ферментів детоксикації глутатюнредуктази та глутатюнпероксидази, що о ю 54022 веде до активації глутаті он залежно і системи детоксикації Поставлене завдання вирішується тим, що у способі активації ферментів глутаті он залежно і системи детоксикації печінки в експерименті, який включає біохімічне дослідження цитозоля печінки тварин, згідно з винаходом, здійснюють вплив омега-3 поліненасиченими жирними кислотами в серед ньотерапевтичній дозі безпосередньо на цитозоль печінки Омега-3 ПНЖК (Теком) - новий лікарський препарат, що являє собою суміш з високим (не менше 43%) вмістом ефірів омега-3 поліненасичених жирних кислот, був розроблений в Інституті фтизіатрії і пульмонології їм Ф Г Яновського АМН України і дозволений до КЛІНІЧНОГО застосування (див Інструкція по медичному застосуванню препарата "Теком", реєстраційний номер Р/98/19А/8, яка затверджена заст міністра охорони здоров'я України, 15 10 98р) Доза омега-3 ПНЖК (Текому) була визначена виходячи з результатів попереднього вивчення фармакокінетики омега-3 ПНЖК, тобто 20мкл/мл цитозолю, що відповідає середньотерапевтичній дозі (див Морозова НА Обгрунтування застосування лікарського препарату Теком при запальних захворюваннях бронхо-легеневої системи та атерогенних дисліпопротещеміях (клініко-експериментальне дослідження) Дис докт мед наук - Київ, 2001 -348с) Спосіб реалізують наступним чином Інтактних тварин забивають під легким ефірним наркозом, цитозоль печінки виділяють диференціальним центрифугуванням Після виділення визначають активність глутатюнредуктази і глутатюнпероксидази в цитозолі Для визначення активності глутатюнредуктази цитозольну фракцію розводять в 10 разів 0,1 М калій-фосфатним буфером Цитозоль добавляють в кювету з інкубаційним середовищем при 37°С (0.06М калій-фосфатний буфер, 0,1 М NaCI, 0,01 М етілендіамштриацетат (ЕДТА)) і через 10 хвилин запускають реакцію додаванням 2мМ окисленного глутатюну і 2,4мМ НАДФН Через ЗО секунд региструють швидкість окислення НАДФН на спектрофатометрі при довжені хвилі 340нм Активність глутатюнредуктази виражають в мікромолях НАДФН на 1г білку за хвилину і вона дорівнює 50,98мкМ/мин г білку Для визначення активності глутатюнпероксидази цитозольну фракцію розводять в 40 разів 0,1 М калій-фосфатним буфером Цитозоль добавляють в кювету з інкубаційним середовищем при 37°С (0,1 М Трис НСІ буфер, 6мМ ЕДТА, 12мМ азид Na, 4,8мМ відновленний глутатюн), через 5 хвилин реакцію зупиняють додаванням 20% трихлороцтової кислоти, супернатант вносять в кювету з 0,1 М трис-НСІ буфером і додають 0,01 М реактив Елмана Через 5 хвилин проби фотометрирують при довжені хвилі 412нм Активність глутатюнпероксидази вираховують в МІЛІМОЛЯХ відновленного глутатюну за одну хвилину на 1г білку і вона дорівнює 12,80мМ/мин г білку З метою активації ферментів цитозоль печінки тварин шкубують з омега-3 ПНЖК в середньотерапевтичній дозі, тобто 20мкл/мл цитозолю, в термостаті при температурі 37°С протягом 1 години, після чого знову проводять вимірювання активності вказаних ферментів Встановлено, що активність глутатюнредуктази зросла з 50,98мкМ/мин г білку до 83,16мкМ/мин г білку, що вказує на активацію фермента на 63 % Активність глутатюнпероксидази зросла з 12,80мМ/мин г білку до 22,10мМ/мин г білку, тобто активація ферменту дорівнює 72% Таким чином, заявлений спосіб дає можливість розшифрувати механізм за допомогою якого реалізується активуюча дія омега-3 ПНЖК на глутаті он залежну систему детоксикації печінки і використовувати його для активації цієї системи при м порушенні, для експериментальної профілактики і терапії отруєнь ХІМІЧНИМИ речовинами, для стимулювання розвитку реакцій адаптації і компенсації при дії ксенобютиків на організм Запропонований спосіб активації ферментів глутаті он залежно і системи детоксикації печінки дозволяє скоротити час дослідження до 1 години і не потребує значних затрат коштів Спосіб простий, доступний і може знайти застосування в біохімії, токсикологи, експериментальній пульмонології ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24