Спосіб отримання ізольованих клітин з мікроядрами із епітелію шкіри

Спосіб отримання ізольованих клітин з мікроядрами із епітелію шкіри, що включає фіксування матеріалу у розчині формаліну, лужну дисоціацію досліджуваного матеріалу, відокремлення епітелію, витримування у дистильованій воді, суспензування, центрифугування, виготовлення мазків з подальшим їх фарбуванням, який відрізняється тим, що лужну дисоціацію проводять протягом 1314 годин при температурі 18-19°С, а центрифугування - протягом 9-10хв. (19) (21) u201004852 (22) 22.04.2010 (24) 25.10.2010 (46) 25.10.2010, Бюл.№ 20, 2010 р. (72) ЧЕРНИЧЕНКО ІГОР ОЛЕКСІЙОВИЧ, БАЛЕНКО НІНА ВАСИЛІВНА, ОСТАШ ОЛЬГА МИХАЙЛІВНА, СОВЕРТКОВА ЛАРИСА СТЕПАНІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ГІГІЄНИ ТА МЕДИЧНОЇ ЕКОЛОГІЇ ІМ. О.М.МАРЗЄЄВА АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ" 3 54040 виготовлення мазків із суспензії клітин з подальшим їх фарбуванням, згідно із запропонованим рішенням, лужну дисоціацію проводять протягом 13-14 годин при температурі 18-19°С, а центрифугування протягом 9-10хв. Спосіб дозволяє досягти повної дисоціації епітелію шкіри із отриманням якісної суспензії, яка містить цілі, неушкоджені ізольовані клітини, кількість яких складає 80-90%, та знижує ризик отримання зруйнованих клітин («голі» ядра) до 10-20%. Спосіб здійснюється наступним чином: Шматочок шкіри, зафіксований у розчині формаліну промивають у дистильованій воді, після чого піддають лужній дисоціації шляхом обробки 50% КОН протягом 13-14 годин при температурі 18-19°С у центрифужній пробірці. Зливають розчин лугу і додають у пробірку дистильовану воду. Виймають шматочок шкіри, закріплюють його спеціальною голкою на піноспластовій поверхні та обережно зіскоблюють скальпелем клітини епітелію шкури у мікропробірку з дистильованою водою і витримують 2 години при температурі 20-21°С. Суспензування проводять обережним піпетуванням суміші. Подальше центрифугування здійснюють протягом 9-10хв. при 1500об/хв. Процедуру повторюють двічі. Надосадову рідину видаляють, краплю суспензії наносять на поверхню предметного скла для виготовлення мазків з подальшим їх фарбуванням. Приклад здійснення способу: Ділянку шкіри миші, яку умертвляли шляхом декапітації, вирізали на місці аплікацій досліджуваної речовини у розмірі 5×15мм), промивали та фіксували у 10% розчині формаліну протягом 2-х тижнів Зафіксований шматочок шкіри промивали у проточній воді 8 годин. Відмиту від формаліну шкіру переносили у центрифужні пробірки, заливали 1,5мл 50% лугу та витримували у ньому 13-14 годин при температурі 18-19°С. Далі лужний розчин Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 4 зливали і додавали у пробірку дистильовану воду. Оброблений таким чином шматочок шкіри виймали та фіксували голками на пінопластиковому столику. Обережно зіскоблювали епітелій шкіри скальпелем у мікропробірку з дистильованою водою та витримували при 20°С протягом 2 годин. Далі проводили дуже обережне піпетування до утворення суспензії, та центрифугування протягом 910хв. при 1500об/хв. Видаляли надосадову рідину та повторно заливали дистильованої водою. Краплю суспензії наносили за допомогою мікропіпетки з пластмасовою насадкою на край сухого, ретельно знежиреного скла. Шліфоване скло підводили до краплі суспензії і робили мазок під кутом 45°. Щільність розташування клітин контролювали під мікроскопом. Препарат занурювали на 10хв. у виготовлену ex tempore суміш етилового спирту та оцтової кислоти (3:1) та висушували у повітрі. Фарбування мазків проводили 2,5% розчином орсеїну при температурі 37°С протягом 1 години. Надалі промивали 45% оцтовою кислотою 5-10сек. та у дистильованій воді двічі по 3-5сек. Цитоплазму клітин дофарбовували 1% спиртовим розчином фарбника світлого зеленого «Lichtgrun SF» протягом 1хв., після чого двічі промивали дистильованою водою та просушували предметне скло у повітрі. Отримані препарати аналізували під мікроскопом за допомогою об'єктива з масляною імерсією при збільшенні 10×90 - 10×100 для виявлення та підрахунку кількості клітин з мікроядрами на кожну 1000 ізольованих клітин. Таким чином, запропонований спосіб характеризується розширенням діапазону видів тканин, які можливо використовувати для оцінки генотоксичності ксенобіотиків мікроядерним методом, зокрема шкіри, при дослідженні речовин переважно місцевої дії та скороченням часу на проведення таких досліджень. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601