Плазмідний експресуючий вектор ртмра, маючий послідовність днк, відповідаючу за експресію в бактеріях е.coli злитного білка trepanema pallidum

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної інженерії І може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка Trepanema Paliidum І в медицині, для конструювання тест-систем, придатних для виявлення антитіл до Trepanema Pallidum в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресійних векторів типу рЕХ1-3 (Keith К Stanley and Paul Lusio., Construction of a new family of high efflclenty bacterial expression vectors: Identification of cDNA clones for human liver proteins. //EMBO Journel vol 3, N 6, p. 1429 - 1434). ЦІ вектори походять від crolacZ злитних плазмид, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Рr промотору фа гу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить мікробіологічний синтез в Е. coll элитного білка рболонки Trepanema Pallidum. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез элитного білка Trepanema Pallidum. Для цього була створена рекомбінантна плазмида рТтрА, яка містить наступні ІнсерційнІ фрагменти ДНК; фрагмент гену Сrо, розміром 51 п.о., фрагмент Lad, розміром 114 п.о., фрагмент Lac Z, розміром 1050 п.о. І фрагмент ДНК, відповідачки послідовностям білка Trepanema розміром 4104 п.о. Одержаною модифікованою плазмідою трансформували клітини Е. coll., штам Pop-2136. РекомбінантнІ клони Ε. coll нарощували І тестували методом Імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримували антитіла до структурних білків Trepanema pallldum, Плазмида pTmpA-47 кодує гібридний білок молекулярною масою 153,5 кД (1367 амінокислот). Штам - продуцент гібридного білка (ITG-542) одержували трансформацією клітин Е. coll Pop 2136 плазмидою рТтрА (див. креслення). Клітини - продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32-42°С. При рості на м'ясопептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійній І нітратній формах. Клітини ростуть при рН 6,0-8,0. Синтез гібрідного білка відбувається при вирощуванні культури Е. coll ITG-542 при температурі 32-42°С. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібрідний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення І по кількості складає до 10% всього білка клітин, Кликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмидою рТтрА.