Спосіб виготовлення прямих препаратів метафазних хромосом риб

Спосіб виготовлення прямих препаратів метафазних хромосом риб, який включає підготовку органу для виготовлення препаратів in vivo з сацію сумішшю етанолу - льодяної оцтової кислоти 3 1 і виготовлення препаратів розкапуванням осаду з висоти 15-20 см фарбуванням 2% розчином Гімза, відрізняється тим що в якості органа для виготовлення препаратів використовують лімфоідний орган ппотонізацію ведуть сумішшю 0,3% КСІ і 0,9% цитрату натрію у співвідношенні 1 1 при температурі не нижче 22°С, а суспензію клітин фільтрують через марлю 1 Галузь техніки, до якої належить винахід Винахід належить до сільськогосподарської біологи зокрема, біологи риб, а саме до цитогенетичних способів дослідження риб і може бути застосований в лабораторіях науково-дослідних установ, які займаються селекційною роботою в рибництві 2 Рівень техніки В каріології риб широко ВІДОМІ І використовується в лабораторній практиці для мікроскопічного аналізу хромосом в щільних тканинах слабо давлені препарати (Баршене Я В Методические рекомендации по цитогенетическим исследованиям различных видов рыб в их ареалах В кн Типовые методики исследования продуктивности видов рыб в пределах их ареалов Ч IV - Вилюнюс, 1981 - С 86-95) Однак, отримання постійних давлених препаратів представляє собою досить складну процедуру, оскільки при відокремленні покривного скельця від предметного відбувається пошкодження або втрата клітин Наступні етапи зневоднення препаратів в спирті і заключения в спеціальні середовища, необхідні для запобігання при довготривалому зберіганні та мікроскопи суттєво залежать від попереднього етапу Хоча процедура отримання давлених препаратів далека від досконалості, її використовують в тих дослідженнях, в задачі яких входить мікроскопічний аналіз хромосом в щільних тканинах (нирки, селезінка, зябра, гонади) Для отримання каріотипів риб також використовують ембріональні тканини або зябра і нирки дорослих риб (Васильєв В П , Макеева А П , Рябов И Н О триплоидии отдельных гибридов карпа с другими представителями семейства Cypnnidae - Генетика, 1975, 11, № 8 с 49-56, Мапап Т , Kraznai Z Karyological investigation on Ctenopharyngodon idella and Hipophthalmichthys nobilis and their cross-breeding - Aquaculture Hund , 1978, 1, p 44-50 Marian T , Kraznai Z Comparative karyological studies on Chinese carps - Aquaculture, 1979, 18, p 325-336) Результат застосування цих способів до коропових риб не можна назвати задовільними присутньо дуже багато метафазних пластинок низької якості Відомі також способи виготовлення препаратів хромосом риб з абдомінальної рідини Fan Z , Fox D P A new method for fish chromosome preparation J of Fish Biology, 1990, 37, № 4 - P 553-561 В абдомінальній рідині клітини накопичуються введенням ФГА in vivo протягом 43-48 годин та культивуються короткий час в середовищі з колхіцином Гіпотонічна оборбка здійснюється 0,5% КСІ Даний метод вимагає великих матеріальних витрат на реактиви (ФГА, поживне середовище) та часу Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється» є спосіб виготовлення хромосомних препаратів з нирок, селезінки, зябр з використанням принципів приготування хромосомних препаратів з тканин теплокровних тварин з різноманітними модифікаціями Г Д Бердышев, В В Архипчук Приготовление хромосомных препаратов из тканей растительноядных рыб со < э 34814 Гидробиологический журнал 1985, т 20, № 1 - С 61-65 Незважаючи на різноманітні модифікації, ускладнення або спрощення методик, авторам не завжди вдається досягнути стабільності результатів в отриманні достатньої КІЛЬКОСТІ метафазних пластинок, а також високої якості отриманих препаратів Запропонований нами спосіб усуває недоліки прототипа і забезпечує отримання за досить короткий час якісні препарати метафазних хромосом в достатній для аналізу КІЛЬКОСТІ З Суть винаходу В основу винаходу і покладено завдання розробити зручний у виконанні, швидкий у здійсненні та дешевий спосіб виготовлення високоякісних препаратів метафазних хромосом риб З 1 Суть винаходу і суттєві ознаки Технічний результат досягають шляхом використання для виготовлення препаратів метафазних хромосом лімфоідного органу риб (коропа), підготованого in vivo, його обробки (гомогенізація, ресуспендування, інкубація)' в ГІПОТОНІЧНІЙ суміші 0,3% розчину КСІ та 0,9% розчину цитрату натрію у співвідношенні 1 1, видаленням строми фільтруванням через марлю Спосіб забезпечує одержання достатньої КІЛЬКОСТІ високоякісних метафазних пластинок з добрим розкидом хромосом Це здійснюється завдяки правильно підібраному органу (лімфоідний орган риб, який є джерелом значної КІЛЬКОСТІ спонтанних МІТОЗІВ) для виготовлення препаратів і використанню ппотонізуючоїсуміш» розчинів 0,3% КСІ та 0,9 % цитрату натрію 1 1 Одержання якісних, чистих препаратів, позбавлених залишків строми забезпечується фільтрацією через марлю З 2 ВІДОМОСТІ, ЩО розкривають суть винаходу При проведенні патентного пошуку заявником виявлено технічне рішення (ГД Бердишев ВВ Архипчук Приготовление хромосомных препаратов мз тканей растительноядных рыб // Гидробиологический журнал, т 20, 1985, №1 - С 61-66), в якому є найбільша КІЛЬКІСТЬ суттєвих ознак, загальних із заявленим рішенням 1) підготовка органу, з якого будуть виготовлятися препарати хромосом з використанням розчину колхіцину in vivo, 2) обробка (інкубація, гомогенізація) добутого з черевної порожнини органа ГІПОТОНІЧНИМ розчином, 3) центрифугування, 4) фіксація сумішшю етанол-льодяної оцтової кислоти у співвідношенні З 1 3-х разово, 5) відсмоктування супернатанту, 6) виготовлення препаратів метафазних хромосом розкапуванням осаду на вологі охолоджені предметні скельця з висоти 15-20 см, 7) фарбування препаратів 2% розчином Гімзи Однак наявність зазначених, спільних із прототипом ознак, недостатня для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб Це дозволяє зробити висновок про ВІДПОВІДНІСТЬ заявленого технічного рішення критерію "новизна" В патентній і науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень^ в яких були б описані ВІДОМОСТІ про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату використання за об'єкт виготовлення препаратів метафазних хромосом риб лімфоідного органа коропа, відсутність культивування в поживному середовищі, ресуспендування органу в гіпотонічному розчині, який складається з суміші 0,3% КСІ та 0,9% цитрату натрію у співвідношенні 1 1 при температурі не нижче 22°С, очищення від строми фільтруванням через марлю суспензії клітин Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про його ВІДПОВІДНІСТЬ критерію "винахідницький рівень" Заявлений спосіб належить до сільськогосподарської біологи, зокрема, біологи риб, а саме до цитогенетичних способів дослідження риб і може бути застосований в лабораторіях науководослідних установ, які займаються селекційною роботою в рибництві, а тому відповідає критерію "промислова придатність" Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислово придатним, має винахідницький рівень, тобто, відповідає всім умовам патентоспроможності винаходу ВІДПОВІДНО ДО пункту 6 розділу II "Закону України про охорону прав на винаходи і корисні моделі" № 3687-ХІІ 4 ВІДОМОСТІ, ЩО підтверджують можливість здійснення винаходу Реалізацію заявленого способу здійснюють таким чином 4 1 Порядок здійснення способу 4 11 Рибі в черевну порожнину вводять 0,01% розчин колхіцину з розрахунку 0,5 мл на 100 г маси Через 4-5 годин добувають лімфоідний орган 4 12 Лімфоідний орган переносять у флакон з ГІПОТОНІЧНИМ розчином (0,3% КСІ та 0,9% цитрат натрію у співвідношенні 11), інкубують 20 хвилин при температурі 22°С 4 13 Гомогенізують та ресуспендують лімфоідний орган у СВІЖІЙ порції ГІПОТОНІЧНОГО розчину 4 14 Фільтрують суспензію клітин з метою очищення и від строми 4 15 Інкубують суспензію клітин в гіпотонічному розчині ЗО хвилин при температурі 22°С 4 16 Переносять- суспензію в центрифужні пробірки і центрифугують 7-10 хв при 1,5 тис об/хв 4 17 Супернатант обережно відсмоктують, осад ресуспендують 4 18 Додають фіксуючу суміш етанол-льодяна оцтова кислота у співвідношенні 3 1 4 1 9 Витримують в холодильнику ЗО хвилин, центрифугують, супернатант обережно зливають і додають свіжу порцію фіксатора 4 1 10 Після третьої зміни фіксатора супернатант відсмоктували, лишаючи біля 1 мл осаду 4 111 Препарати метафазних хромосом готують методом розкапування з висоти 15-20 см на знежирені вологі охолоджені предметні скельця Скло підсушують в полум'ї горілки 4 1 12 Препарати фарбують 10 хвилин 2% розчином Гімзи Запропонований нами спосіб дозволяє отримати значну КІЛЬКІСТЬ метафазних пластинок з добрим розкидом хромосом 4 2 Приклад конкретного виконання Ефективність заявленого способу ілюструє наведений нижче приклад конкретного виконання 34814 В ВАТ Львівоблрибкомбінату рибдільниці "Лелехівка" відібрано 12 особів коропа 2-го року життя вагою 200-250 г, довжиною 20-25 см, які поділені шляхом аналогів на 4 групи Із 3-х особів І групи готували препарати метафазних хромосом за відомим способом (ГД Бердышев, В В Архипчук Приготовление хромосомных препаратов из тканей растительноядных рыб - Гидробиологический журнал 1985, т 20, № 1 - С 61-65) з селезінки та печінки Із особів II, III, IV груп - за заявленим способом з л»мфоідного органу коропа Лімфоідні органи, добуті з черевної порожнини риб, описаним в розділі 4 1 методом, обробляли різними гіпотонічними розчинами та їх сумішшю в різних пропорціях II група - 0,3% КСІ при 20°С. III група - 0,3% КСІ 0,9% цитрат Na 3 1 при 22°С, фільтрування IV група - 0,3% КСІ 0,9% цитрат Na 1 1 при 22°С, фільтрування Решта елементів реалізації заявленого способу були однаковими при виготовленні препаратів метафазних хромосом Визначення оптимального співвідношення складових запропонованог гіпотонічної суміші проводили на підставі якості одержаних препаратів Отримані нами результати представ-, лені в таблиці 1 3 таблиці 1 випливає, що найбільш оптимальним розчином для гіпотонічної обробки клітин є суміш 0,3% КСІ та 0,9% цитрату натрію у співвідношенні 1 1 Визначення оптимальної температури для ефективної ди запропонованої гіпотонічної суміші проводили на підставі якості одержаних препаратів Отримані нами результати представлені в таблиці 2 Як видно з таблиці 2, оптимальна температура для ефективної дії гіпотонічної суміші є 22°-23°С Отже, заявлений нами спосіб усуває недоліки прототипу і забезпечує одержання високоякісних препаратів метафазних хромосом при економії часу на виготовлення і використання реактивгв 4 3 Техніко-економічна егірективнгсть винахоДУ Використання заявленого способу дає можливість зменшити витрати реактивів, матеріалів і часу на здійснення способу, а також підняти якість отриманих препаратів хромосом Представляється важливим відзначити, що для отримання препаратів метафазних хромосом коропа використовували лімфоідний орган а також не використовували ніяких поживних середовищ в процесі приготування препаратів Характеристика застосованих способів отримання препаратів хромосом риб Таблиця 1 Група Гіпотонічний розчин КІЛЬКІСТЬ аналізабельних метафаз І 0,56% КСІ 5-Ю них пластинок (на 1 скельце) (прототип) II 0,3% КСІ 10-15 III 0.9% цитрат Na 5-7 IV 0,3% КСІ + 0,9% цитрат Na 1 1 до 100 Таблиця 2 Характеристика застосованих температурних режимів отримання препаратів хромосом риб Група Температура (град. С) Кількість аналізабельних метафазних пластинок (на 1 скельце) І 20°С 5-Ю (прототип) II 21 °С 5-Ю III 22°С до 100 IV 23°С до 100 Тираж 50 екз Вщкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м Ужгород, вул Гагаріна, 101 (03122)3-72-89 (03122)2-57-03