Тест-система для специфічної імуноферментної діагностики протибруцельозних антитіл у біологічних рідинах від тварин “іфа-бруцела ав”

1 Тест-система для специфічної імуноферментної діагностики протибруцельозних антитіл у біологічних рідинах від тварин, яка включає планшет, набір реагентів для імуноферментного аналізу та проявник, яка відрізняється тим, що має імунопероксидазний кон'югат на основі моноклональних антитіл, універсальний розчин для розведення біологічних компонентів та розчин для промивання 2 Тест-система за п 1, яка відрізняється тим, що як проявник використовується хромоген ортофенілендіамш 3 Тест-система за п 1, яка відрізняється тим, що як проявник використовується хромоген тетраметилбензитин 4 Тест-система за п 1, яка відрізняється тим, що як універсальний розчин включає в себе фракцію молока корів, фракцію сироватки крові корів, сечовину (0,5-2,5 %) та розчин Тритон Х-100 (0,051,5%) 5 Тест-система за п 1, яка відрізняється тим, що як розчин для промивання використовується фосфатно-сольовий буфер з 0,05 % Твин-20 6 Тест-система за п 1, яка відрізняється тим, що як планшет використовується суцільний або стриповий планшет Винахід відноситься до ветеринарної медицини, а саме до імуноферментного аналізу для виявлення інфікованості тварин збудниками бруцельозу Бруцельоз - хронічно протікаюча хвороба тварин і людини, що викликається бактеріями, з'єднаними під загальною назвою Brucella Бруцели відносяться до патогенних КЛІНІЧНИЙ перебіг бруцельозу у тварин характеризується поліморфізмом Основною ознакою є аборт, який супроводжується масовим і тривалим виділенням бруцелл з абортованим плодом, навколоплідними водами, плацентою, виділеннями із статевих і родових органів Бруцелли виділяються хворими тваринами також з сечею і молоком Інфікуються шкірні покриви тварин, стійла, підстилка, залишки корму, предмети відходу, приміщення, а також пасовища і місця водопою Крім абортів бруцельоз у тварин може супроводжуватися орхітами, бурситами, ендометритами, маститами Він може протікати також в прихованій формі і виявлятися лише при спеціальному обстеженні мікроорганізмів РІЗНІ ВИДИ ВОЛОДІЮТЬ різною вірулентністю Бруцели відрізняються високою швазивністю, можуть проникати через непошкоджені слизисті покриви, відносяться до внутріклітинних паразитів Бруцелли малостійкі до високої температури В рідкому середовищі при +60°С вони гинуть через ЗО хвилин, при +80-85°С - через 5 хвилин, при кип'ячені вмить Під ДІЄЮ прямих сонячних променів бруцелли гинуть через 4-5 годин, в ґрунті зберігають життєздатність до 100 днів, у воді - до 114 днів Тривало зберігаються в харчових продуктах Володіють великою СТІЙКІСТЮ ДО ДІЇ низьких температур Відома тест-система імуноферментна для діагностики бруцельозних антитіл у сироватках крові людини або великої рогатої худоби (ВРХ), яка включає планшет, набір реагентів для імуноферментного аналізу та проявник В складі якої як кон'югати використовують антивідові антитіла (анти IgM + IgG людини або антитіла 1 CO ^00 Ю 58437 ВРХ, мічені ферментом та включає імуносорбент з внесеними антигенами очищених культур штамів Brucella abortus 1119 та Brucella mehtensis (1) Недоліком цієї тест-системи для ветеринарної медицини є те, що в ній можливо тестувати сироватку крові тільки великої рогатої худоби В основу винаходу поставлена задача розробити тест-систему для специфічної імуноферментної діагностики проти бруцельозних антитіл у біологічних рідинах від тварин "ІФА-БРУЦЕЛА АВ" шляхом виявлення антитіл до Brucella abortus при цьому застосовуючи набор реагентів, що дозволяє підвищити універсальність використання процесу виявлення антитіла до Brucella abortus та підвищити його чутливість та специфічність Поставлена задача вирішується у тест-системі для специфічної імуноферментної діагностики проти бруцельозних антитіл у біологічних рідинах від тварин "ІФА-БРУЦЕЛА АВ", яка включає набір реагентів для імуноферментного аналізу та проявник, ВІДПОВІДНО до винаходу, використовують імунопероксидазний кон'югат на основі моноклональних антитіл, універсальні розчини для розведення біологічних компонентів та розчини для промивання Як проявник використовується хромоген - ортофенілендіамш Як проявник використовується хромоген - тетраметилбензитин Як універсальний розчин включає в себе фракцію молока корів, фракцію, сироватки крові корів, сечовину (0,5-2,5%) та розчин Тритон Х-100 (0,051,5%) Як розчин для промивання використовується фосфатно-сольовий буфер з 0,05% Твин-20 Як планшет використовується суцільний або стриповий планшет Завдяки використанню імунопероксидазного кон'югату на основі моноклональних антитіл, універсального розчину для розведення біологічних компонентів'та розчинів для промивання, а також оригінальній ПІДГОТОВЦІ імуносорбенту тест-система дозволяє без зміни комплектації проводити діагностику бруцельозом різних видів тварин використовуючи різні біологічні проби від цих тварин До складу тест-системи входять слідуючи реагенти Імунопероксидазний кон'югат (кон'югат)світло-солом'яна опалесцентна рідина являє собою - модифіковані моноклональні антитіла до імуноглобулінів класу G великої рогатої худоби, свиней, кіз та овець, пероксидаза хрону, Позитивний контроль (К+) - світло-солом'яна трохи опалесцуюча рідина являє собою сироватку крові імунізованих бруцельозними антигенами тварин, що позитивно реагує у ІФА Негативний контроль (К) - світло-солом'яна трохи опалесцуюча рідина, Хромоген - ортофенілендіамш (ОФД) таблетка білого з сіруватим ВІДТІНКОМ кольору, діаметром 5мм, товщиною 2мм Хромоген - тетраметилбензитин (ТМБ) прозора безбарвна рідина, Стоп-реагент - прозора, безбарвна рідина Універсальні розчини - розчин для промивання (розчин №1) безбарвна опалесцуюча рідина, допускається розшарування та випадіння кристалічного осаду, що розчинюється при температурі (35-37) °С протягом 15-20 хвилин Це фосфатно-сольовий буфер з 0,05% Твин-20 за Aldnch кат №27,432-8 - розчин для розведення сироваток (розчин №3) - фіолетова трохи опалесцуюча рідина Це розчин, що включає в себе фракцію молока корів, фракцію, сироватки крові корів, сечовину (0,52,5%) та розчин Тритон Х-100 (0,05-1,5%) за Aldnch кат №23 472-9 - розчин для розведення кон'югату (розчин №4) - безбарвна трохи опалесцуюча рідина - розчин для приготування проявника (розчин №5) - прозора безбарвна рідина Імуносорбент полістироловий суцільний або стриповий планшет з сорбованими на ньому бруцельозними антигенами Таблетки ОФД розчинюють у 9см 3 очищеної води при 20±2°С при струшуванні протягом 5-10 хвилин Концентрація водневих ІОНІВ (рН) розчинів №1, №3, №4 - 7,3±0,1, а №5 - 5,3±0,1 (при розчиненні 12см3 розчину у 350мл очищеної води) Номінальний об'єм розчинів кон'югат від 0,1 до 0,3см3, позитивний контроль від 0,1 до 0,3см3, негативний контроль від 0,1 до 0,3см3 розчин №1 - 12-5см~ розчин №3 -12-5 см розчин №4- 12-20см , розчин №5 - 3 см 3 , стоп-реагент- 12-6см3, хромоген ТМБ - 12см3 Використовується тест - система слідуючим чином Підготовка до аналіз, суцільний планшет варіант №1 а - використовують хромоген ОФД, варіант №1 б - використовують хромоген ТМБ Перед початком роботи компоненти набору необхідно витримати при температурі від 18 до 22°С протягом ЗО хвилин Приготування розчину для промивання планшета (розчин №1) Вміст флакона концентрату розчина №1 інтенсивно струшують і розводять у 350см3 очищеної води та перемішують Якщо концентрат розчину кристалізований, його нагрівають перед застосуванням при 35-37°С до повного розчинення кристалів Розчин можна зберігати при температурі від 2 до 8°С не довше 5 діб Приготування розчину кон'югату В ампулу з кон'югатом вносять 0,3-0,4мл розчину №4 для розведення кон'югату Після повного розчинення вміст ампули переносять у флакон з розчином №4 Вміст флакона ретельно перемішують, не допускаючи пшоутворення Цю процедуру повторюють тричі з метою повного вилучення кон'югату з ампули Розчин кон'югату готують безпосередньо перед використанням Приготування розчину проявника В чистий флакон пінцетом вносять таблетку хромогену ОФД і додають 9см очищеної води, інтенсивно струшують і залишають флакон у темному МІСЦІ ДО повного розчинення хромогену Безпосередньо перед внесенням у лунки стрипів у флакон з розчином №5 додають розчин хромогену, суміш 58437 інтенсивно струшують Розчин готують безпосередньо перед використанням Розчин проявника необхідно оберігати від попадання світла та контакту з металами або іонами металів Перед використанням розчин проявника повинен бути безбарвним Підготовка до аналізу, стриповий планшет варіант №2а - використовують хромоген ОФД, варіант №26 - використовують хромоген ТМБ Приготування розчину для промивання планшету (розчин №1) Вміст трьох флаконів концентрату розчина №1 інтенсивно струшують і розводять у 450см очищеної води та перемішують Якщо концентрат розчину кристалізований, його нагрівають перед застосуванням при 35-37°С до повного розчинення кристалів Розчин можна зберігати при температурі від 2 до 8°С не довше 5 діб Приготування розчину кон'югату В чистий флакон відбирають 12см розчину №4 В дві з трьох ампул з кон'югатом вносять 0,3-0,4мл розчину № 4 для розведення кон'югату Після повного розчинення вміст ампули переносять у флакон Вміст флакона ретельно перемішують, не допускаючи пшоутворення Цю процедуру повторюють тричі з метою повного вилучення кон'югату з ампули Розчин кон'югату готують безпосередньо перед використанням Приготування розчину проявника В чистий флакон вносять таблетку хромогену ОФД і додають 9см3 очищеної води, інтенсивно струшують і залишають флакон у темному МІСЦІ ДО повного розчинення хромогену Безпосередньо перед внесенням у лунки стрипів у флакон з розчином №5 додають розчин хромогену, суміш інтенсивно струшують Розчин готують безпосередньо перед використанням Підготовка, наприклад, зразків сироваток крові тварин Зразки сироваток, які містять осад необхідно освітлювати центрифугуванням Зразки сироваток зберігають від 2 до 6°С протягом трьох діб Якщо немає можливості провести аналіз в цей термін, зразки необхідно заморозити Процес розморожування зразків сироваток повинен бути не більше 2 разів Зразки з гемолізом та бактеріальним проростом для аналізу не придатні Проведення аналізу Наприклад варіант №№1а, 16 (в розрахунку на один суцільний планшет) Готують розчин №1, як зазначено вище, виймають Імуносорбент з пакувального пакету та вносять в усі лунки по 0,35см3 розчину №1, витримують стрипи залитими 30-40 секунд і видаляють розчин з лунок за допомогою промивача або 8-канальноі піпетки, після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу В кожну лунку вносять по 0,095см розчину №3 для розведення сироваток В лунки планшету вносять по 0,005см3 зразків досліджуваних сироваток, залишивши вільними 5 лунок першого ряду (лунки для контролів), В дві лунки (А1, В1) вносять по 0,005см3 позитивного контролю (К+), а в три ІНШІ (01-Е1) по 0,005см3 негативного контролю (К-) При внесенні контрольних та досліджуваних зразків необхідно обережно піпетувати суміш Під час піпетування відбувається зміна кольору розчину в лунках Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та шкубують при і температурі 37°С 60 хвилин По закінченні інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальноі піпетки та промивають лунки чотири рази розчином №1, після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу Готують розчин кон'югату Як зазначено вище В лунки стрипів вносять по 0,1см3 розчину кон'югату Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та шкубують при 37°С у термостаті ЗО хвилин По закінченні інкубації видаляють розчин кон'югату з лунок за допомогою промивача або 8канальної піпетки та промивають лунки шість разів розчином №1, після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу Готують розчин проявника Вносять в лунки стрипів по 0,1см3 розчину проявника Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та шкубують при 18-22°С в темному МІСЦІ ДО ЗО хвилин Зупиняють кольорову реакцію внесенням до всіх лунок по 0,05см3 розчину стоп-реагенту Не більше як через 1 хвилину після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі (492нм відносно 620нм) Як виняток, ОГ можна визначати в однохвильовому режимі (492нм) відносно порожньої лунки (бланк) Необхідно передбачити порожню лунку при аналізі При роботі в однохвильовому режимі знижується чутливість та точність аналізу Примітка Варіант №1 б відрізняється тільки тим, що вносять в лунки планшету по 0,1см3 розчину хромогена ТМБ Облік результатів аналізу Розраховують середнє значення оптичної густини (ОГ) для лунок негативного контролю (ОГ К-) і для позитивного контролю (ОГ К+) Проведення аналізу вважають коректним, якщо ОГ К- не вище 0,1 оптичної одиниці (00), а ОГ К+ не нижче 0,6 00 Якщо одне з трьох значень ОГ К- більше 0,1 00 або більше ніж в два рази перевищує ОГ К-, його відкидають та ОГ К- розраховують за рештою значень ОГКГраничне значення ОГ (ГЗ) ГЗ розраховують, додаючи константну для кожної серм-наборів величину до значення ОГ К"Сіра зона" - зона значень ОГ, яка простягається від ГЗ до значень менших ГЗ на 10% Результати аналізу вважаються негативними, якщо значення ОГ досліджуваного зразка менше рівня ОГ "сірої зони" Результати аналізу вважаються позитивними, якщо значення ОГ досліджуваного зразка більше ГЗ 58437 Зразки, які мають значення ОГ в межах "сірої зони", вважаються невизначеними Зразки, що, дали позитивний або невизначений результат, необхідно досліджувати повторно не менш як у двох лунках системи Зразки, позитивні в одній або більше лунках, слід вважати позитивними Зразки, негативні в двох або більше лунках, слід вважати негативними В разі отримання позитивного або невизначеного результату у випадку дослідження пулів сироваток необхідно переставити кожний зразок сироватки окремо в розрахунку один зразок - одна лунка Для автоматичного обліку результатів аналізу застосовують обчислювальну програму Порядок програмування автоматичного спектрофотометра (ридера) та користування програмою додається по вимозі користувача В залежності від комплектації тест-система може випускатись в чотирьох варіантах Комп'ютерна верстка О В Кураєв 8 Варіант №1а - суцільний планшет, хромоген ОФД, набір розраховано на проведення 192 аналізів без урахування зразків контрольних сироваток Варіант №16 - суцільний планшет, хромоген ТМБ, набір розраховано на проведення 192 аналізів без урахування зразків контрольних сироваток Варіант №2а - стриповий планшет, хромоген ОФД, набір розраховано на проведення 96 аналізів без урахування зразків контрольних сироваток Варіант №26 - стриповий планшет, хромоген ТМБ, набір розраховано на проведення 96 аналізів без урахування зразків контрольних сироваток Набір зберігають і транспортують при температурі від 2 до 8°С Термін зберігання набору -12 МІСЯЦІВ 1 Джерело інформації патент №48811 А, публ 15 08 02, бюл №8 Підписано до друку 05 08 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна України