Спосіб відновлення та заповнення дефектів хряща

Спосіб відновлення та заповнення дефектів хряща, який включає застосування тканинних клітин, який відрізняється тим, що як клітинну бластему використовують мезенхімальні клітини, культивовані в агарі, які фіксують у дефекті хряща медичним клеєм Винахід відноситься до біотехнологм, а саме до культивування клітинних культур і тканин, і може бути використаний в КЛІНІЧНІЙ експериментальній ортопедії та травматології Відомий "Спосіб виготовлення протеза для заміщення суглобового хряща з алогенного або ксеногенного матеріалу", патент Великобританії, заявка №2175506, ИСМ, 1986, 16.С42, A61F1/00 УДК 615 47, опубл 08 12 1986, №49 Відомий також "Спосіб заповнення дефектів хряща у тварин за допомогою складу, до якого входить матриця, що біологічно розкладається", патент США №5206023, ИСМ, 1994, 22-24, С 105 A61F2/02, A61L37/22, C07L15/06, С09НЗ/02, опубл 27 04 93 Т1149№4 Проте ефективність даного способу низька, тому що ксеногенний матеріал відторгається організмом тварин Найбільш близьким за технічною сутністю є "Спосіб заповнення дефектів хряща за допомогою фібрино-клітинної суспензії", WO9603160А1 (US) 26 07 95, 08 02 96 A61L25/00, ИСМ, 1996, 24, С 13 Е Vacant Charles A , Randolf Mork A , Sims С Derek Butler Peter E M Для регенерації використовують хрящові клітини в суміші з фібріногеном, який утворює згустки при контакті з тромбіном або іншою сериновою естеразою У кращому варіанті хрящові клітини і фібриноген є аутолопчними, отриманими за допомогою біопсії і кріогенної обробки плазми Проте ефективність даного способу низька, тому що необхідно проводити біопсію аутолопчної тканини даного видутварини В основу винаходу поставлена задача - удосконалити спосіб відновлення та заповнення де фектів хряща, який дозволив би оптимізувати регенерацію дефектів суглобового хряща, що дасть можливість підвищити ефективність лікування Поставлена задача вирішується тим, що у способі відновлення та заповнення дефектів хряща, який включає застосування тканинних клітин, згідно винаходу, в якості клітинної бластеми використовують мезенхімальні клітини, культивовані в агарі, і фіксують у дефекті хряща медичним клеєм Мезенхімальні клітини, культивовані в агарі, отримані з зачатків КІНЦІВОК курячих ембріонів, можуть бути використані в якості клітинної бластеми для регенерації поверхневих дефектів суглобного хряща Істотними ВІДМІННОСТЯМИ запропонованого способу є вибір спеціальних клітин для одержання культури клітин із хрящовою цитодеференціровкою У якості субстрату для культивування використано (обрано) агаровий гель, що дозволило одержати об'ємну культуру При культивуванні ж мезенхімальних клітин зачатків КІНЦІВОК та ізольованих хондроцитів у вигляді моношару на склі, останні втрачають здатність до хрящової цитодеференціровки, а хондроцити метаплазують у фібропласт Приклад конкретного виконання Спосіб здійснюється таким чином Клітини З зачатків КІНЦІВОК ембріонів курки виділяють за методикою Handhary G Суспензію клітини (кінцева концентрація 200000кл/мл середовища) змішують у співвідношенні 1 1 із 0,6% агаром і наносять на приготовлену агарову підложку в 60мл чашках Петрі Після загуснення агару з клітинами до чашки Петрі вносять 1,5-2см3 живильного середовища 199, що містить 20% ембріона 00 о (О 60872 льної сироватки телят, яка містить антибіотики (пеніцилін і стрептоміцин) Інкубацію проводять при температурі 37° в атмосфері 5% СОг і 95% повітря (на відміну від звичайного культивування клітин) протягом 5 днів При культивуванні в агарі хондроцити формують скупчення округлих клітин - колоній При мікроскопічному дослідженні КІЛЬКІСТЬ клітин у колоніях на 5-й день культивування складає від ЗО до 50 Характерним було виражене диференціювання клітин у напрямку мезенхімальні -> хондробластоподібні -> хондроцит Навколо хондроцитів виявляються капсули, клітини мають ппоі гіперхромні ядра і бувають оточені невеликою КІЛЬКІСТЮ базофільної цитоплазми Між клітинами виявляють матрикс, який складається з волокон і альціанпозитивного субстрату Отриману структуру мезенхімальних клітин із хрящовою цитодиференціровкою використовують при вивченні можливості її застосування в якості клітинної бластеми, для репаративної регенерації суглобового хряща Експерименти по вивченню регенерації хрящової тканини були проведені на ЗО статевозрілих кроликах породи Шиншила річного віку в двох серіях експерименту Тваринам в умовах операційної під анестезією тюпенталу натрію за допомогою зуболікарського бура (діаметр 1мм ) відтворювали дефекти (на 1/2 товщини суглобового хряща) у міжвиростковій зоні дистального відділу стегнової КІСТКИ У ДОСЛІДНІЙ серії у дефект суглобового хряща імплантували агарові блоки з мезенхімальними клітинами нирок КІНЦІВОК курячих ембріонів, які культивували протягом 5 діб Агаровий блок попередньо обробляли в середовищі, що містить тромбш Для закріплення агарового блока в дефекті поверх наносили медичний клей КМ-3, що складається з 2,7 частини клейової субстанції і 0,3 частини отверджувача У контрольній групі №1 - дефект у суглобовому хрящі нічим не заповнювали Комп'ютерна верстка М Мацело У контрольній групі №2 - дефект у суглобовому хрящі заповнювали агаром без клітин Про результати регенерації судили через 3 і 6 МІСЯЦІВ після операції Тварини були виведені з досліду шляхом введення повітря до вушної вени Використано ГІСТОЛОГІЧНІ методи дослідження з морфометричною оцінкою зони регенерату Голівки стегнових кісток кролів фіксували в суміші спирт +10% нейтральний формалін (4 1), зневоднювали в спиртах зростаючої МІЦНОСТІ Й укладали у парафін Зрізи товщиною 3-5мкм були пофарбовані гематоксиліном і еозіном, толуїдиновим синім і пікросіріусом червоним і досліджені у світловому мікроскопі "Rathenov" При вивченні головок стегнових кісток тварин контрольної серії №1 і №2 установлено, що через З МІСЯЦІ після операції зона дефекту чітко визначалася і була заповнена бурими масами Мікроскопічно у зоні дефекту виявили поля пухкої сполучної волокнистої тканини Краї суглобного хряща, звернені до дефекту, були нерівними, узурованими з осередками фібриляції У суглобовому хрящі поблизу дефекту визначали безклітинні ділянки, осередки демаскованих колагенових волокон Суглобовий хрящ віддалених від дефекту ділянок характеризувався вираженим порушенням цитоархітектоніки, великими безклітинними полями, осередками розволокнення матрикса і гіперплазії хондроцитів у крайових відділах У ДОСЛІДНІЙ серії при макроскопічному дослідженні голівки стегнової кістки дефект у суглобному хрящі визначали з трудом у вигляді невеличкого поглиблення, заповненого білястою тканиною Мікроскопічно зона дефекту була виконана паліновою хрящовою тканиною, що не має характерної позиційної специфічності Використання способу відновлення та заповнення дефектів хряща дозволяє реставрувати дефекти суглобового хряща різного генезу посттравматичних, дистрофічних (остеоартричних і кістозних порожнин) і тим самим підвищує ефективність лікування Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119