Спосіб визначення трансгенної лінії ga21 кукурудзи за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб детекції мутантного гена 5-енолпірувіл шікімат-3-фосфат синтази кукурудзи (Zea mays L.) у генетично модифікованій рослині методом полімеразної ланцюгової реакції, для здійснення якої проводять термальну денатурацію рослинної ДНК; циклічну ампліфікацію, де кожен цикл включає 3 61602 1. проводять денатурацію рослинної ДНК протягом 4 хв. при 94 °C; 2. проводять 35 циклів, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30сек. при 94°C, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 30 сек. при 55°C, синтез фрагментів цільових генів протягом 15 сек. при 72°C; 3. проводять синтез фрагментів цільових генів протягом 10 хв. при 72°C. Для проведення ПЛР використовують праймери наступних нуклеотидних послідовностей, комплементарні до відповідних генів: (для ампліфікації подіє специфічного фрагменту ДНК); (для ампліфікації фрагмента ДНК специфічного до генетичної конструкції); (для ампліфікації фрагмента гену зеїну). У ПЛР використовують різні пари праймерів у залежності від особливостей експерименту. Продукти ПЛР являють собою фрагменти цільових генів, які мають характерну довжину, що дозволяє розрізнити їх після електрофоретичного розділення в агарозному гелі: 112 пар основ (п.о.) для подіє-специфічного фрагменту ДНК гена 5енолпірувіл шікімат-3-фосфат синтази кукурудзи; 133п.о. для ампліфікації фрагмента ДНК специфічного до генетичної конструкції; 277п.о. для ампліфікації фрагмента гена зеїну. Результатом здійснення запропонованої корисної моделі є ампліфікація фрагментів цільових Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 4 послідовностей з рослинної ДНК, що дозволяє визначити присутність у геномі рослини перенесеного мутантного гена 5-енолпірувіл шікімат-3фосфат синтази кукурудзи, засвідчити наявність ядерної ДНК кукурудзи у препараті та придатність препарату ДНК для проведення ПЛР. Бажаний результат досягають внаслідок використання для ПЛР розробленого набору праймерів та підібраних умов для ампліфікації фрагментів цільових генів. Запропоновану корисну модель було здійснено для визначення мутантного гена 5-енолпірувіл шікімат-3-фосфат синтази кукурудзи при проведенні моніторингу селекційних зразків насіння кукурудзи місцевого походження на наявність спонтанно занесених трансгенних подій, які зареєстровані у Європейському союзі. Запропонований спосіб визначення трансгенної лінії GA21, яка містить мутантний ген 5енолпірувіл шікімат-3-фосфат синтази кукурудзи у комплексному препараті ДНК рослин методом полімеразної ланцюгової реакції має переваги у значній економії затрат часу та можливості детекції у комплексних препаратах ДНК. Джерела інформації: [1] Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia/RK Saiki, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich, and N Arnheim // Science,1985, v.230, p.1350-1354. [2] Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / БІК Saiki, DH Gelfand, S Stoffel, SJ Scharf, R Higuchi, GT Horn, KB Mullis, and HA Erlich // Science,1988, v.239, p.487-491. [3] Deletion screening of the Duchenne muscular distrophy locus via multiplex PCR amplification/Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier Je, Nguyen PN, Caskey CT// Nucleic Acid Res., 1988, v.16 ,p.11141-11156. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601