Спосіб виявлення вірусу інфекційного ларинготрахеїту птиці за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб виявлення вірусу інфекційного ларинготрахеїту птиці за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає ампліфікацію гена ТК вірусу ІЛТ як ПЛР-мішені, який відрізняється тим, що використовують праймери ILTV_F (5' GAA ACG GTC GAC TGG ACG TAT TTG') і ILTV_gE_R (5' GGA АСА GTA GCA GTT TCT AAG CAC 3'), за температури відпалу 57 °С, і синтезують фрагмент довжиною 176 п.н. (19) (21) u200712267 (22) 05.11.2007 (24) 25.03.2008 (46) 30.12.1899, Бюл.№ , 1899 р. (72) ГЕРІЛОВИЧ АНТОН ПАВЛОВИЧ, UA, СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, U A (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИН АРНОЇ МЕДИЦИНИ, UA (56) 3 31041 4 допомогою набору для екстракції загальної ДНКнеобхідну кількість розчину буфера ТБЕ так, щоб Сорб-А або ДНК-Сорб-Б (Амплисенс, Москва, він покривав агарозний гель шаром завтовшки 4-5 Росія), або аналогічного. Процедура складається мм. Для нанесення проби відбирають у кількості із лізису клітин та їх детриту, сорбції ДНК на 10 мкл продукту ампліфікації та вносять у сорбенті, дво-триразового відмивання сорбованої відповідну лунку агарозного гелю, під шар буфера ДНК та екстракції ДНК із сорбенту за допомогою ТБЕ так, щоб вміст одного кармана агарозного ТЕ-буферу. гелю не перетікав у інший. Ампліфікація. Готують загальну (для усієї Електрофорез проводять у градієнті напруги 8 кількості проб) суміш реагентів для ампліфікації з В/см. Потім виймають платформу з агарозним розрахунку (на 1 пробу): гелем з електрофоретичної камери, дають рідині 13,0 мкл деіонізованої води; стекти з гелю та промивають агарозний гель 2,0 мкл 50мМ Mg++; дистильованою водою у кількості 200 см 3 2-3 рази. 5,0 мкл реакційного буферу; Агарозний гель вміщують на скло УФ2,5 мкл суміші dNTP; трансілюминатору. Фрагменти аналізованої ДНК по 1 мкл праймерів; виявляються у вигляді смужок жовтогарячого 0,5 мкл Taq-полімерази. кольору при проходженні УФ-випромінювання з Після додавання Taq-полімерази, що довжиною хвилі 310 нм. проводиться в останню чергу, одержану суміш Облік результатів. У негативному ретельно перемішують на вортексі. Після контрольному зразку (К-) смужки відсутні. Поява чого,суміш у дозі 40 мкл вносять в усі пробірки смужки на рівні позитивного контролю свідчить про підготовлені для ампліфікації. Потім додають в усі контамінацію (забруднення) компонентів набору. пробірки по 1 краплі (близько 25 мкл) У позитивних контрольних зразках (К+) одна мінерального масла. Для проведення ампліфікації смужка жовтогарячого кольору розміром 176 у відповідну пробірку з реакційною сумішшю під нуклеотидний залишок (н.з.). шар масла вносять 5 мкл розчину сумарної ДНК Відсутність смужки жовтогарячого кольору на проби. Для негативного контрольного зразку в рівні позитивного контролю (К+) (176 н.з.) свідчить пробірку вносять - 5 мкл деіонізованої води, а в про відсутність вірусу ІЛТ. Наявність смужки, що пробірку для позитивного контрольного зразку - 5 відповідає за електрофоретичною рухливістю мкл розчину ДНК з інактивованої формаліном позитивному контролю (176 п.н.), свідчить про культуральної розплодки вірусу ІЛТ. Пробірки присутність вірусу ІЛТ. Рез ультат аналізу не закривають й центрифугують протягом 3-5 секунд можна вважати достовірним, якщо на доріжці при 2000 об/хв на мікроцентрифузі. Переносять будь-якого негативного контролю виявляється пробірки в нагрітий до температури 95°С специфічна смужка. Необхідно поставити не програмний термостат (ампліфікатор) і проводять менше трьох негативних контролів на етапі ампліфікацію за наступною програмою (табл.): виділення ДНК і стільки ж на етапі постановки ПЛР Після закінчення реакції проводять аналіз для виявлення джерела контамінації. продуктів ПЛР, шляхом поділу фрагментів ДНК в Ефективність способу розкривається в агарозному гелі. Потім проводять прикладах. електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР. Приклад 1. Для оцінки чутливості та Приготування робочого розчину буфера (ТБЕ) відтворюваності способу щодо індикації ДНК для електрофорезу. вірусу ІЛТ досліджували проби, що містили штами У мірну колбу ємністю 1000,0 см 3 вносять ВНИИБП-У та G вірусу ІЛТ з активністю 0,25, 0,5, вміст пакета з буфером для електрофорезу, 1, 2, 4, 6 та 8 ЕID 50/мл. Їх було досліджено з доводять до мітки дистильованою водою та використанням способу прототипу та ретельно перемішують до повного розчинення розробленого способу. Встановлено, що спосіб осаду. прототип придатний до виявлення вірусу ІЛТ лише Приготування агарозного гелю. У конічну штаму ВНИИБП-У з активністю 1, 2, 4, 6 та 8 ЕID колбу ємністю 250 см 3 вносять вміст одного пакета 50/мл. Розроблений спосіб дозволяв детектувати з агарозою, додають 100,0 см 3 робочого розчину ДНК в пробахобох штамів з активністю вірусу 0,5, буфера ТБЕ і ста влять колбу на водяну баню. 1, 2, 4, 6 та 8 ЕID 50/мл. Дослідження були Вміст колби доводять до кипіння, повністю проведені триразове, при повтореннях результати розтоплюють, помішуючи скляною палочкою та відтворені. охолоджують до температури 50-60°С. Отриманий Приклад 2. Для визначення специфічності розчин агарози повинен бути прозорим і не способу було використано 10 проб клінічного вміщувати окремих нерозчинених часток. Після матеріалу від інфікованих курей і 5 - від інтактних. чого у колбу з розчином агарози вносять 50,0 мкл Для контролю специфічності способу розчину броміду етидія. використовували зразки ДНК герпесвірусів Підготовка електрофоретичної камери до індичок, хвороби Марека та інфекційного заливання агарозного гелю. Встановлюють ринотрахеїту ВРХ. гребінку на платформу, розміщуючи її на відстані 3 Після ампліфікації встановлено наявність см одна від одної та заливають у неї охолоджену специфічних смуг різної інтенсивності у всіх 10 до температури 50°С агарозу. Після застигання пробах клінічного матеріалу, а також в треку агарози (приблизно через 25-30 хв.) обережно позитивного контрольного зразку ДНК вірусу ІЛТ витягають гребінку; платформу з агарозним гелем (штам G). З пробами ДНК клінічного матеріалу від переносять до електрофоретичної камери. здорових свиней після ампліфікації не В електрофоретичну камеру заливають утворювалось смуг ампліконів. 5 31041 Проби сумарної ДНК гетерогенних контролів також не утворювали специфічних смуг після реакції за способом, що пропонується. Розроблений спосіб виявлення ДНК вірусу інфекційного ларинготрахеїту за допомогою ПЛР, має більш виражену специфічність, вищу собівартість і може успішно використовуватись у практиці лабораторних досліджень. Таблиця № циклу 1 2 3 Температура Час 95°С 95°С 57°С 72°С 72°С 2 хв 0,5 хв 0,5 хв 0,5 хв 2 хв Кількість циклів 1 40 1 6