Спосіб детекції рекомбінантного гена ацил-ліпідної десатурази, злитої з термостабільною ліхеназою, в генетично модифікованій рослині методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб детекції рекомбінантного гена ацилліпідної десатурази, злитої з термостабільною ліхеназою, в генетично модифікованій рослині методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, для здійснення якого проводять денатурацію рослинної ДНК; цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК, ренатурацію рослинної ДНК з U 2 (19) 1 3 переносяться в рослинну клітину під час трансформації. Найближчим аналогом запропонованої корисної моделі є МПЛР система для визначення найбільш розповсюджених генетичних елементів, які переносяться в різні види рослин, а саме генів aadA, bar, hpt, nptll, pat, uidA [4]. Згідно з цим методом для проведення МПЛР використовують олігонуклеотидні праймери, комплементарні до перерахованих генів, і проводять ампліфікацію за наступних умов: денатурація рослинної ДНК протягом 10хв при 95°С; 40 циклів, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 50сек при 95°С, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 50сек при 59°С, синтез фрагментів цільових генів протягом 50сек при 72°С; синтез фрагментів цільових генів протягом 5хв при 72°С [4]. В літературі не описана МПЛР для визначення генів ацил-ліпідних десатураз ціанобактерій, злитих з термостабільною ліхеназою, перенесених в рослини. Ці гени кодують ферменти, які каталізують утворення подвійних зв'язків в жирних кислотах клітинних мембран, що може призводити до підвищення холодостійкості генетично модифікованих рослин [5]. Для моніторингу експресії перенесених генів використовують рекомбінантні гени десатураз, злиті в одній рамці зчитування з геном термостабільної ліхенази. Цей ген кодує фермент, активність якого можна визначати простим та надійним методом [6]. Об'єктом даної корисної моделі є спосіб детекції в генетично модифікованій рослині рекомбінантного гену ацил-ліпідної десатурази, злитої з термостабільною ліхеназою, методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції. Технічною задачею даної корисної моделі було створення способу одночасної ампліфікації фрагментів цільових генів з рослинної ДНК. Відповідно до даної корисної моделі для здійснення ампліфікації фрагментів цільових генів послідовно виконують наступні дії: 1. проводять денатурацію рослинної ДНК протягом 5хв при 94°С; 2. проводять 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30сек при 94°С, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 45сек при 61°С, синтез фрагментів цільових генів протягом 45сек при 72°С; 3. проводять синтез фрагментів цільових генів протягом 5хв при 72°С. Для проведення МПЛР використовують праймери наступних нуклеотидних послідовностей, комплементарні до відповідних генів: licВМ3-1 GTCGTAAATACGCCTTTTGTTGCA licBM3-2GTTAGGATAGTATTTTACATATTCG (для ампліфікації фрагмента гена liсВМЗ); desA-1 GTTGACACCAACGGTAACGCC desA-2 CCAGTTAAAGGTGCGCTCGTAA (для ампліфікації фрагмента гена desA); desC-1 CCTCAATTGGGGCTTTGTCTTC desC-2 AACTGTACCTTGGCGGCAAGA (для ампліфікації фрагмента гена desC); Actin-1 TTTGCTGGAGATGATGC Actin-2 CTTGAATGGCGACATAC (для ампліфікації фрагмента гена актина); 51842 4 NtGA-1 ACAGTTGCCCTTGCTTATCGC NtGA-2 TTCAACACGAACGGAACAGAC (для ампліфікації фрагмента гена субодиниці GTP-зв'язуючого білка); virD1-1 ATGTCGCAAGGCAGTAAGCCCA virD1-2 GGAGTCTTTCAGCATGGAGCAA (для ампліфікації фрагмента гена virD1 штаму GV3101 Agrobacterium tumefaciens); virE-1 CGAATACATTCTCGTGCGTCAAACG virE-2 TTTCGAGTCATGCATAATGCCTGAC (для ампліфікації фрагмента гена virE штаму AGL0 A. tumefaciens); nptll-l GAACAAGATGGATTGCACGCAGGT nptll-2 TCGTCCAGATCATCCTGATCGACA (для ампліфікації фрагмента гена nptll); Tnos-1 CGATAATTTATCCTAGTTTGCGCG Tnos-2 TGAATCCTGTTGCCGGTCTTC (для ампліфікації фрагмента термінатора гена нопалінсинтази). В МПЛР використовують різні комбінації пар праймерів в залежності від особливостей експерименту (штаму A. tumefaciens та цільових і селективних генів, використаних для трансформації рослин). Продукти МПЛР являють собою фрагменти цільових генів, які мають характерну довжину, що дозволяє розрізнити їх після електрофоретичного розділення в агарозному гелі: 642 пар основ (п.о.) для гена liсВМ3, 949п.о. для гена desA, 777п.о. для гена desC, 351п.о. для гена актина тютюну, 609п.о. для гена -субодиниці GTP-зв'язуючого білка тютюну, 432п.о. для гена virD1, 600п.о. для гена virE, 473п.о. для гена nptll, 188п.о. для термінатора гена нопалінсинтази. Результатом здійснення запропонованої корисної моделі є ампліфікація фрагментів цільових генів з рослинної ДНК, що дозволяє визначити присутність в геномі рослини перенесеного рекомбінантного гену ацил-ліпідної десатурази, злитої з термостабільною ліхеназою, а також підтвердити відсутність забруднення агробактеріями та придатність препарату ДНК для проведення ПЛР. Бажаний результат досягають внаслідок використання для МПЛР розробленого набору праймерів та підібраних умов для одночасної ампліфікації фрагментів цільових генів. Запропоновану корисну модель було здійснено для детекції рекомбінантних генів ацил-ліпідних десатураз, злитих з термостабільною ліхеназою, в генетично модифікованих рослинах тютюну, арабідопсісу, рапсу, салату та картоплі. На Фіг.1 показано результати МПЛР з використанням п'яти пар праймерів desA-1/desA-2, desC1/desC-2, licBM3-1/licBM3-2, Actin-1/Actin-2, virD11/virD1-2 для детекції в рослинах тютюну, трансформованих за допомогою штаму GV3101 A. tumefaciens, перенесених рекомбінантних генів ацилліпідних десатураз desA та desC ціанобактерії Synechocystis sp. РСС 6803 та термостабільної ліхенази liсВМ3 Clostridium thermocellum. На гель було нанесено маркер довжини фрагментів ДНК (М), суміш для МПЛР з ДНК нетрансформованого тютюну (К), з ДНК тютюну, трансформованого гібридним геном desА-liсВМ3 (Т1), з ДНК тютюну, трансформованого гібридним геном desA-liсВМ3 5 та геном desC (T2), з ДНК штаму GV3101 A. tumefaciens (А). Стрілками показано ампліфіковані фрагменти генів desA (949п.о.), desC (777п.о.), liсВМ3 (642п.о.), актину (351п.о.), virD1 (432п.о.) та довжину молекул ДНК в складі маркера. Було показано придатність запропонованих праймерів для ампліфікації фрагментів відповідних генів з ДНК різних видів рослин (тютюн - Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, рапс - Brassica napus, салат - Latuca sativa, картопля - Solanum tuberosum). На Фіг.2 показано результати МПЛР з використанням двох пар праймерів desA-1/desA-2, liсВМ3-1/liсВМ3-2 для детекції в рослинах арабідопсісу перенесеного рекомбінантного гену desAliсВМ3 (М - маркер довжини фрагментів ДНК; А1 ДНК ГМ рослини, А2 - ДНК контрольної нетрансформованої рослини); МПЛР з використанням двох пар праймерів desA-1/desA-2, liсВМ31/liсВМ3-2 для детекції в рослинах рапсу перенесеного рекомбінантного гену desA-liсВМ3 (М - маркер довжини фрагментів ДНК; P1 - ДНК контрольної нетрансформованої рослини, Р2 - ДНК ГМ рослини); МПЛР з використанням трьох пар праймерів desA-1/desA-2, desC-1/desC-2, liсВМ31/liсВМ3-2 для детекції в рослинах салату перенесених рекомбінантних генів desA-licBM3 та desCliсВМ3 (М - маркер довжини фрагментів ДНК; С1 ДНК контрольної нетрансформованої рослини, С2 - ДНК рослини, трансформованої геном desCliсВМ3; С3 - ДНК рослини, трансформованої геном desA-ІісВМ3); МПЛР з використанням чотирьох пар праймерів desA-1/desA-2, liсВМ3-1/lісВМ3-2, nptll1/nptII-2, Tnos-1/Tnos-2 для детекції в рослинах картоплі перенесених генів desА-liсВМ3, nptll та термінатора гена нопалінсинтази (М - маркер довжини фрагментів ДНК; К1 - суміш для МПЛР без ДНК; К2 - ДНК ГМ рослини). Стрілками показано ампліфіковані фрагменти генів desA (949п.о.), desC (777п.о.), liсBM3 (642п.о.), nptll (473п.о.) та 51842 6 термінатора гена нопалінсинтази (188п.о.) та довжину молекул ДНК в складі маркера. Запропонований спосіб детекції рекомбінантного гену ацил-ліпідної десатурази, злитої з термостабільною ліхеназою, в генетично модифікованій рослині методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції має наступні переваги: значне зниження затрат часу та матеріалів; можливість проведення реакції з препаратами ДНК різних видів рослин; можливість детекції забруднення різними штамами A. tumefaciens. [1] Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia / RK Saiki, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich, and N Arnheim // Science, 1985, v. 230, p. 1350-1354. [2] Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / RK Saiki, DH Gelfand, S Stoffel, SJ Scharf, R Higuchi, GT Horn, KB Mullis, and HA Erlich // Science, 1988, v. 239, p. 487-491. [3] Deletion screening of the Duchenne muscular distrophy locus via multiplex PCR amplification / Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier Je, Nguyen PN, Caskey CT // Nucleic Acid Res., 1988, v. 16, p. 11141-11156. [4] Multiplex PCR-based Simultaneous Amplification of Selectable Market and Reporter Genes for the Screening of Genetically Modified Crops / Randhawa GJ, Chhabra R, Singh M // J. Agric. Food Chem., 2009, v. 57, p. 5167-5172. [5] Structure and expression of fatty acid desaturases / Los DA, Murata N // Biochimica et Biophysica Acta, 1998, v. 1394, p. 3-15. [6] A reporter system for prokaryotic and eukaryotic cells based on the thermostable lichenase from Clostridium thermocellum / Piruzian ES, Goldenkova IV, et al. // Моl Genet Genomics, 2002, v. 266, p. 778786. 7 Комп’ютерна верстка М. Ломалова 51842 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601