Спосіб екстракції днк з матеріалу рослинного походження для генетичного аналізу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб екстракції ДНК з матеріалу рослинного походження для генетичного аналізу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає лізис клітин бромистим цетилтриметиламонієм, сорбцію ДНК на діоксид кремнію, дворазове відмивання діоксиду кремнію 70 % етанолом, який відрізняється тим, що на кінцевій стадії відмивання використовують хлороформ з ізопропанолом. (19) (21) u201015456 (22) 21.12.2010 (24) 12.09.2011 (46) 12.09.2011, Бюл.№ 17, 2011 р. (72) ГЕРІЛОВИЧ АНТОН ПАВЛОВИЧ, СОЛОДЯНКІН ОЛЕКСІЙ СЕРГІЙОВИЧ, СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, САПКО СВІТЛАНА АНАТОЛІЇВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕ 3 Для приготування розчину для відмивання (70 %-ий розчин етанолу з додаванням NaCl) змішують 95 %-й розчин етанолу, розчин NaCl і доводять об'єм дистильованою водою, вільної від нуклеаз. Для приготування сорбенту роблять водний розчин діоксиду кремнію. Для приготування розчину для кінцевого відмивання змішують ізопропанол і хлороформ. Екстракцію ДНК з матеріалу рослинного походження проводять наступним чином. У пробірки типу епендорф вносять по 150 мг досліджуваного матеріалу, додають 500 мкл лізуючого розчину і ретельно перемішують на вортексі. Після чого інкубують пробірки на твердотільному термостаті за температури 37С протягом однієї години. Потім центрифугують пробірки при 12000 g протягом 10 хв., надосадову рідину переносять у нові пробірки та додають по 25 мкл сорбенту, ретельно перемішують на вортексі, інкубують 10 хв. при кімнатній температурі періодично струшуючи на вортексі. Пробірки знову центрифугують при 12000 g протягом 30 рек., видаляють надосадову рідину, додають по 500 мкл розчину для відмивання і ретельно ресуспендують сорбент на вортексі. Цей процес повторюють двічі з кінцевим відмиванням сорбенту. Для підсушування сорбенту пробірки центрифугують при 12000 g протягом 30 сек., видаляють надосадову рідину, інкубують в твердотільному термостаті з відкритими кришками за температури 65С (5-10 хв.). Для елювання ДНК додають по 50 мкл ТЕбуферу, ретельно ресуспендують сорбент на вортексі, інкубують в твердотільному термостаті за температури 65 С протягом 10 хв., періодично струшуючи на вортексі. Після цього центрифугують пробірки при 12000 g протягом 60 сек. Та одержують надосадову рідину, яка містить очищену ДНК. Комп’ютерна верстка А. Крулевський 62611 4 Ефективність способу розкривається в прикладах. Приклад 1. Для аналізу брали базовий комбікорм для курей. Після екстракції ДНК була поставлена ПЛР з праймерами nos Term f (5'gcatgacgttatttatgagatggg3') i nos Term r (5'gacaccgcgcgcgataatttatcc3'), що фланкують ділянку довжиною 118 пар нуклеотидів NOS термінатора. За результатами проведенного електрофорезу зафіксовано наявність специфічного фрагменту довжиною 118 пар нуклеотидів, що свідчило про наявность ГМО в складі комбікорму. Приклад 2. Для проведення ПЛР-скринігу на наявність ГМО були відібрані проби сої. В якості позитивного контролю використовували референтний зразок ERM-BF410d, що містить 1% генномодифікованої сої (референс-лабораторія з контролю ГМО, м. Іспра, Італія). Після екстракції ДНК була поставлена ПЛР з праймерами nos Term f (5'gcatgacgttatttatgagatggg3') i nos Term r (5'gacaccgcgcgcgataatttatcc3'), що фланкують ділянку довжиною 118 пар нуклеотидів NOS термінатора. За результатами проведеного електрофоретичного аналізу в досліджуваних зразках утворення ампліконів не зафіксовано, тоді як в позитивному контролі синтезувався специфічний фрагмент довжиною 118 пар нуклеотидів, що було свідченням про відсутність ГМО в матеріалі, що досліджувався. Таким чином, був розроблений метод експресекстракції ДНК, який дозволяє скоротити трудові витрати та час при дослідженнях матеріалу рослинного походження за допомогою ПЛР. Спосіб може успішно використовуватись у практиці контролю продукції рослинного походження щодо наявності ГМО методом ПЛР у молекулярногенетичних лабораторіях. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601