Спосіб екстракції днк з тканин тваринного походження для генетичного аналізу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб екстракції ДНК з тканин тваринного походження для генетичного аналізу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає ферментативний метод дезінтеграції тканин, який відрізняється тим, що для протеолітичної обробки використовують розчин трипсину, фільтрують клітини від грубих механічних домішок, лізують клітини гуанідином тіоціанатом, сорбцію ДНК проводять на діоксиді кремнію та дворазово відмивають діоксид кремнію 70 % етанолом. (19) (21) u201015453 (22) 21.12.2010 (24) 12.09.2011 (46) 12.09.2011, Бюл.№ 17, 2011 р. (72) ГЕРІЛОВИЧ АНТОН ПАВЛОВИЧ, СОЛОДЯНКІН ОЛЕКСІЙ СЕРГІЙОВИЧ, СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, САПКО СВІТЛАНА АНАТОЛІЇВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ" 3 62609 матеріалу (м'язи, кістковий мозок, біопсія внутрішніх органів тощо), додають 1000 мкл розчину для гомогенізації тканин та інкубують у шейкеріінкубаторі за температури 65°С протягом однієї години. Після інкубації вміст пробірки фільтрують через фільтр грубої очистки (наприклад стерильна марля). Відфільтровану рідину центрифугують при 3000 g та обережно видаляють супернатант. До осаду додають 400 мкл лізуючого розчину і ретельно перемішують на вортексі. Після чого інкубують пробірки на твердотільному термостаті за температури 65°С протягом п'яти хвилин. Після інкубації додають по 25 мкл сорбенту, ретельно перемішують на вортексі, інкубують 10 хв. при кімнатній температурі періодично струшуючи на вортексі. Потім центрифугують пробірки при 5000 g протягом 1 хв., видаляють надосадову рідину та додають по 500 мкл розчину для відмивання і ретельно ресуспендують сорбент на вортексі. Цей процес повторюють двічі з кінцевим відмиванням сорбенту. Для підсушування сорбенту пробірки центрифугують при 12000 g протягом 30 сек., видаляють надосадову рідину, інкубують в твердотільному термостаті з відкритими кришками за температури 65°С (5-10 хв.). Для елюювання ДНК додають по 50 мкл ТЕбуферу, ретельно ресуспендують сорбент на вортексі, інкубують в твердотільному термостаті за температури 65°С протягом 10 хв., періодично струшуючи на вортексі. Після цього центрифугують пробірки при 12000 g протягом 60 сек. Та оде 4 ржують надосадову рідину, яка містить очищену ДНК. Ефективність способу розкривається в прикладах. Приклад 1. Для екстракції ДНК брали культури клітин та тканини курей і виконували як зазначено вище Після екстракції ДНК була поставлена ПЛР з праймерами INFprom, що фланкують ділянку довжиною 725 пар нуклеотидів промоторної області гена інтерферону. За результатами проведеного електрофорезу зафіксовано наявність специфічного фрагменту довжиною 725 пар нуклеотидів, що свідчило про наявність геномної ДНК курей в досліджених ДНК-екстрактах. Приклад 2. Для визначення ефективності екстракції за чутливістю досліджували проби селезінок від свиней у кількості (15 голів), одні з них містили другі не містили ДНК вірусу хвороби Ауєскі та реагували і не реагували на «Аулергін ІЕКВМ» для прижиттєвого виявлення свиней-вірусоносіїв. Результати досліджень наведені в таблиці. Дослідження були проведені триразово, при повтореннях результати відтворені, що свідчило про ефективність способу. Таким чином, був розроблений спосіб екстракції ДНК з тканин тваринного походження, який дозволяє ефективно проводити пробопідготовку різних тканин при дослідженнях матеріалу за допомогою ПЛР. Спосіб може успішно використовуватись у практиці молекулярно-генетичних лабораторій. Таблиця Спосіб екстракції ДНК з тканин тваринного походження для генетичного аналізу за допомогою ПЛР Метод дослідження Алергічна проба ПЛР Позитивно реагуючі тварини (гол.) 15 16 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Підписне Негативно реагуючі тварини (гол.) 15 16 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601