Спосіб екстракції днк з крові хребетних для генетичного аналізу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб екстракції ДНК з крові хребетних для генетичного аналізу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає лізис еритроцитів, сорбцію ДНК на діоксид кремнію, центрифугування та відмивання ДНК, який відрізняється тим, що на етапі селективного лізису еритроцитів використовують розчин хлориду амонію, калію гідрокарбонату. (19) (21) u201015454 (22) 21.12.2010 (24) 12.09.2011 (46) 12.09.2011, Бюл.№ 17, 2011 р. (72) ГЕРІЛОВИЧ АНТОН ПАВЛОВИЧ, СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, СОЛОДЯНКІН ОЛЕКСІЙ СЕРГІЙОВИЧ (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕ 3 62610 клеаз. Для приготування розчину для кінцевого відмивання змішують ізопропанол і хлороформ. Екстракцію ДНК з цільної крові походження проводять наступним чином. У пробірки типу епендорф вносять по 100 мкл цільної крові, додають 1000 мкл розчину для селективного лізису еритроцитів, обережно перемішують та інкубують за кімнатної температури протягом 10 хвилин. Після пробірки центрифугують при 3000 g та обережно видаляють супернатант. Знов додають 1000 мкл розчину для селективного лізису еритроцитів обережно перемішують та центрифугують, з подальшим видаленням супернатанту. До осаду додають 200 мкл лізуючого розчину і ретельно перемішують на вортексі. Після чого інкубують пробірки на твердотільному термостаті за температури 65 °С протягом п'яти хвилин. Після інкубації додають по 25 мкл сорбенту, ретельно перемішують на вортексі, інкубують 10 хв. при кімнатній температурі періодично струшуючи на вортексі. Потім додають по 800 мкл розчину для відмивання і ретельно перемішують на вортексі та центрифугують при 5000 g. Видаляють надосадову рідину та додають по 500 мкл розчину для відмивання, ретельно ресуспендують сорбент на вортексі та центрифугують при 10000 g. Для підсушування сорбенту видаляють надосадову рідину, інкубують в твердотільному термостаті з відкритими кришками за температури 65 °С (5-10 хв.). Для елювання ДНК додають по 50 мкл ТЕбуферу, ретельно ресуспендують сорбент на вортексі, інкубують в твердотільному термостаті за температури 65 °С протягом 10 хв., періодично струшуючи на вортексі. Після цього центрифугують пробірки при 12000 g протягом 60 сек. та оде 4 ржують надосадову рідину, яка містить очищену ДНК. Ефективність способу розкривається в прикладах. Приклад 1 Для оцінки чутливості та відтворюваності способу екстракції ДНК використовували проби крові від курей, інфікованих вірусом ІЛТ. Активність збудника в пробах складала 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6 та 8 ЕГО 50/мл. Їх було досліджено з використанням методики - прототипу та розробленої методик. Встановлено, що прототип - методика придатна до виявлення вірусу ІЛТ лише з активністю 1, 2, 4, 6 та 8 ЕГО50/мл. Розроблений спосіб дозволяв детектувати ДНК в пробах з активністю вірусу 0,5, 1, 2, 4, 6 та 8 ЕГО50/мл. Дослідження були проведені триразово, при повтореннях результати відтворені. Приклад 2 Для визначення ефективності екстракції досліджували проби крові від свиней, що містили (20 голів) та не містили (15 голів) ДНК вірусу хвороби Ауєскі та реагували і не реагували на «Аулергін ІЕКВМ» для прижиттєвого виявлення свинейвірусоносіїв. Результати досліджень наведені в таблиці. Дослідження були проведені триразово, при повтореннях результати відтворені, що свідчило про ефективність способу. Таким чином, був розроблений екстракції ДНК з крові хребетних, який дозволяє ефективно проводити пробопідготовку цільної крові при дослідженнях матеріалу за допомогою ПЛР. Спосіб може успішно використовуватись у практиці молекулярно-генетичних лабораторій. Спосіб екстракції ДНК з крові хребетних для генетичного аналізу за допомогою ПЛР Метод дослідження Алергічна проба ПЛР Комп’ютерна верстка А. Крулевський Позитивно реагуючі тварини (гол.) Негативно реагуючі тварини (гол.) 20 15 20 Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601