Спосіб визначення рівня антитіл до нативної днк експрес-методом

Спосіб визначення рівня антитіл до нативної ДНК експрес-методом, який характеризується тим, що визначення проводять в плазмі крові за допомогою діагностикуму, який готують з карбоксильованого полістирольного латексу із розміром частинок 0,77 - 0,83 мкм. (19) (21) u201102080 (22) 22.02.2011 (24) 26.09.2011 (46) 26.09.2011, Бюл.№ 18, 2011 р. (72) ГОРБЕНКО НАТАЛІЯ ІВАНІВНА, КОЗАР ВАЛЕНТИНА ВІКТОРІВНА, ІВАНОВА ОЛЬГА ВОЛОДИМИРІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ЕНДОКРИННОЇ ПАТОЛОГІЇ ІМ. В.Я. ДАНИ 3 воді нативною ДНК («Sigma», USA) методом адсорбції. Кількість ДНК, яку використовують для сенсибілізації латексу, залежить від концентрації, що визначають експериментально. Інкубують суміш 2 години при 37 °С, після чого суспензію відмивають розчином гліцинового буферу і доводять концентрацію до 0,5 % - 0,8 % по сухому залишку латекса за допомогою гліцинового буфера, pH 8,2. Гліциновий буфер готують шляхом доведення 0,1 М розчину гліцину до pH 8,2 1М розчином NaOH та додаванням 8,5 г натрію хлориду на 1 л. Приготовлений діагностикум може зберігатися протягом 1 року при температурі 4 °С. З отриманим діагностикумом ставлять реакцію аглютинації латексу. Як негативний контроль застосовують гліциновий буфер. Перед початком процедури усі реагенти необхідно прогріти до кімнатної температури. Латексний реагент старанно перемішати. Для визначення рівня антитіл до нативної ДНК в плазмі крові нанести на скляну пластинку чи лунки тестового слайду по 20 мкл реагенту, потім в кожну лунку внести по 20 мкл нерозведеної плазми крові, перемішати скляною чи пластиковою паличкою, рівноміpно розподіляючи суміш по всій поверхні лунки. Проінкубувати 2 хвилини, повільно похитуючи скло чи слайд, після чого одразу ж провести облік результатів. Відсутність аглютинації вказує на негативний результат (відсутність антитіл). Якщо досліджувана плазма дала позитивну реакцію, вона підлягає додатковому дослідженню з використанням титрування. Для цього проводять двократні розведення (в 2, 4, 8, 16, 32 і т.д. разів) досліджуваної проби гліциновим буфером. Останнє розведення, яке призвело до розвитку аглютинації, є титром плазми крові, на основі якого судять про титр антитіл до нативної ДНК. Цей тест дозволяє оперативно одержати інформацію - час проведення аналізу складає 2-3 хвилини. Приклад Досліджували плазму крові інтактних та оваріектомованих щурів самиць (через 10 тижнів після операції). Показано, що інтактні тварини мали в середньому титр антитіл до нативної ДНК 26,3 (min 16÷max 32), тоді як у оваріектомованих щурів відповідно 64,0 (min 64÷max 64) (р < 0,05). Релевантність розробленого методу підтверджується тим, що отримані значення нормальних рівнів аутоантитіл співпадають з даними літератури. Прийнято вважати, що в нормі рівень антитіл та аутоантитіл не перевищує титр 1:16-1:32 [1]. Комп’ютерна верстка Мацело В. 63006 4 За умов дефіциту естрогенів, внаслідок активації процесів апоптозу [5], в кровоток надходить надлишок фосфоліпідних компонентів мембран, фрагментів ядеpної ДНК відмираючих клітин, про що свідчить зростання рівня аутоантитіл та аутоімунної патології в період постменопаузи. Таким чином, зафіксоване нами зростання антитіл до нативної ДНК у оваріектомованих щурів свідчить про адекватність та чутливість приготовленого діагностикуму. Таким чином, розроблений спосіб є адекватним до поставленого завдання і здатен виявляти аутоантитіла до ДНК, що підтверджує його специфічність і достатню чутливість. Джерела інформації: 1. Прикладная иммунология /Под ред. А.А. Сохина, Е.Ф. ЧеpHушенко. - К. : Здоров'я, 1984. 320 с.) 2. Cohen I.R., Young D.B. Autoimmunity, micribial immunity and immunological homusculus // Immunol. Today. - 1991. -N. 12. - P. 105-110. 3. Darzynkiewicz Z., Zhao H. Detection of DNA strand breaks in apoptotic cells by flow- and imagecytometry // Methods. Моl. Biol. - 2011 .-Vol. 682, N. 1. - P. 91-101. 4. Gameiro C, Romao F. Changes in the immune system during menopause and aging // Front. Biosci. - 2010. - N. 2. - P. 299-303. 5. Howell A., Howell S.J., Clarke R., Anderson E. Where do selective estrogen receptor modulators (SERMs) and aromatase inhibitors (AIs) now fit into breast cancer treatment algorithms? // J. Steroid. Biochem. Моl. Biol. - 2001. - Vol. 79,N. 1-5.-P. 227237. 6. Plotz C, Singer J. The Latex - Fixation Test. II. Results in Rheumatoid Artritis // Am. J. Med. -1956. -V. 21, N 8. - P. 893-897. 7. Sebastian W., Roy A., Kini U., Mullick S. Correlation of antinuclear antibody immunofluorescence patterns with immune profile using line immunoassay in the Indian scenario // Indian. J. Pathol. Microbiol. - 2010. - Vol. 53,N. 3.- P. 427-432. 8. Seitz M. Which Clinical Symptoms Suggest Distinct Autoantibody Measurements? // Praxis.- 2010 - Vol. 99, N. 23. - P. 1429-1434. 9. Zhang B, Angelidou A, Alysandratos KD, Vasiadi M, Francis K, Asadi S, Theoharides A, Sideri K, Lykouras L, Kalogeromitros D, Theoharides TC. Mitochondrial DNA and anti-mitochondrial antibodies in serum of autistic children // J. Neuroinflammation. 2010. - Vol. 7, N. 1. - P. 80-84. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601