Спосіб біохімічної оцінки рівня імунних антитіл в організмі інфікованих тварин

Спосіб біохімічної оцінки рівня імунних антитіл в організмі інфікованих тварин, що включає вста новлення і підтвердження діагнозу за допомогою серологічного методу, який відрізняється тим, що після встановлення діагнозу в реакції гальмування гемаглютинації подальший контроль рівня антитіл проводиться шляхом визначення концентрації молекул середньої маси, які характеризують інтенсивність запального процесу та знаходяться в корелятивному зв'язку з титром антитіл в крові інфікованих тварин Корисна модель відноситься до галузі ветеринарної біохімії та імунологи і може бути використана в роботі наукових та науково-виробничих лабораторій ветеринарної медицини ВІДОМІ способи оцінки рівня імунологічних антитіл шляхом визначенні титру гемаглютинуючих антитіл в сироватці крові в реакції гемаглютинації Ці способи є специфічними і використовуються як діагностичні водночас з фіксуванням КЛІНІЧНИХ ознак захворювання Недоліками вказаних способів є методична складність, вони потребують значного часу, зокрема, для підготовки компонентів реакції Найбільш близьким за технічною суттю до заявліємого способу є метод визначення виявлення гемаглютинуючих антитіл до вірусу грипу коней шляхом реакції гальмування гемаглютинації [1] Для постановки реакції гальмування гемаглютинації необхідно мати - типоспецифічні сироватки до вірусу грипу коней, - досліджувані сироватки, - забуферений фізіологічний розчин (ЗФР) рН 7,2-7,4, - 1%-ва суспензія еритроцитів півня, планшети для імунологічного аналізу, - піпетки на 0,05 та 0,1см3 Приготування 1%-і суспензії курячіх еритроцитів Кров у півня беруть стерильно з підкрильцової вени, змішують з 1%-м розчіном лимоннокислого натрію у співвідношені 1 10 та зберігають при 4°С 2-3 тижня Для отримання 1%-і суспензії еритроцитів, суміш крові з розчіном лимоннокислого натрію, центріфугують Юхв при ЮОд, рідину, що знаходиться над осадом, зливають, а осад еритроцитів ресуспендують у забуференому фізіологічному розчіні та відмивають цим розчіном доти, доки рідина над осадом еритроцитів не стане прозорою При додаванні до 100см3 ЗФР 1см 3 відмитих курячіх еритроцитів, отримують 1%-ю суспензію курячіх еритроцитів, яку зберігають при температурі 4°С 3 доби Визначення наявності та титру антитіл до вірусу грипу коней в зразках сироваток крові тварин та птахів, які підлягають обстеженню, в модифікованій реакції гальмування гемаглютинації (РГГА) Для визначення гемаглютинуючій активності антигену, ставлять реакцію гемаглютинації (РГА), як ПІДГОТОВЧІЙ етап у постановці реакції гальмування гемаглютинації В лунки планшет для імунологічних реакцій вносять по 0,05см3 ЗФР У першу лунку вносять 0,05см3 ВІДПОВІДНОГО Сї ю о а> о антигену (А(кінь)1/Кембрщж/63 або А(кінь)2/Майамі/63) та готують його дворазове розведення від 1 2 до 1 2048 Потім ДО кожної лунки вносимо по 0 05 см 3 1%-і суспензії курячіх еритроцитів Планшету обережно струшують та залишають при 24°С на 20 хвилин Позитивна реакція гемаглютинації оцінюється за формою осаду еритроцитів, які осідають не тільки на дні, але і на стінках, створюючі "парасо о> 10905 льку". Якщо реакція негативна, як і в контролі, еритроцити осідають створюючі на дні лунки диск з рівними боками. Після визначення титру вірусу, ставлять беспосередньо реакцію гальмування гемаглютинації (РГТА), яка базується на здатності специфічних антитіл нейтралізовувати гемаглютинуючу активність антигенів. Для постановки РГТА готують робочі дози обох штамів вірусу грипу коней, 0,05см3 якого містять 4 аглютинуючі одиниці (АО) вірусу. Для цього вихідний вірус розводять ЗФР в стільки разів, скільки отримують від ділення вихідного титру на 4 (якщо титр 1:128, робоче розведення буде 128ч 4=32, тобто у 0,05см3 вірусу, розведеного 1:32, буде міститися 4 АО). Після приготування робочіх доз вірусу, беспосередньо приступають до постановки РГГА. В лунки планшети вносять по 0,05см3 ЗФР. Потім у першу лунку планшети вносять 0,05см3 сироватки в розведенні 1:10 (п.2.2.6) та готують дворазове розведення, починаючи від 1:20 до 1:1280. В кожну лунку вносять по 0,05см3 відповідного антигену в робочьому розведенні, Планшети залишають при кімнатній температурі на 20 хвилин. Потім до кожної лунки вносять по 0,1см3 1%-ї суспензії курячих еритроцитів. Планшету обережно струшують та витримують при 24°С 20 хвилин. РГТА супроводжують таки контролі: - контроль сироваток на неспецифічну гемаглютинацію. В три лунки з 0,05см 3 ЗФР вносять по 0,05см3 сироваток у найменшому розведенні (1:10) та додають по 0,1см3 1%-ї суспензії курячих еритроцитів; - контроль курячих еритроцитів на спонтанну аглютинацію. Для цього у три лунки планшети вносять по 0,05см3 ЗФР та по 0,05см3 1%-ї суспензії курячих еритроцитів; - контрль робочої дози антигену. У п'ять лунок планшети, крім першої, вносять по 0,05см3 ЗФР. У першу та другу лунки вносять по 0,05см3 робочього розведення антигену. Після змішування з другої лунки переносять 0,05см3 рідини у треттю і т.д. З п'ятої лунки 0,05см3 рідини видаляють. Потім до усіх лунок вносять по 0,05см3 1%-ї суспензії курячих еритроцитів; - контроль негативної (контрольної) сироватки. Контрольну (негативну) сироватку титрують та випробовують з антигенами, які використовуються у реакції. Гиперімунну сироватку вважають активною, якщо її титр буде не нижчім за розведення 1:160 та специфічною, якщо вона затримує гемаглютинуючу активністіг тільки гомологічного вірусу. Відповідно, специфічним є антиген, гемаглютинуючу активність якого затримує тільки гомологичну сиворотку. В контролі сироваток та курячих еритроцитів спонтанної гемаглютинації бути не повинно. Якщо робоче розведення антигену вибрано вірно, то у перший, другий та третій лунках, в яких вміст антигену відповідає 4, 2 та 1АО, повинна бути повна аглютинация еритроцитів, у четвертій та п'ятій лунках аглютинація еритроцитів бути не повинна. Контрольна сироватка не повинна затримувати гемаглютинуючу активність, жодного з антигенів. Таким чином, ми встановлюємо наявність агдютинуючих антитіл в. сироватках досліджуваних зразків крові до вірусу грипу коней (тобто проводиться діагностика) та за титром можемо робити висновок щодо напруженості імунітету та вираженості патологічного процесу. Для підтвердження діагнозу та контролю ефективності лікування необхідно проводити описані реакції повторно. Недоліком відомого способу є те, що він потребує досить значного часу для постановки реакції. Крім того, для визначення титрів антитіл необхідна неявність специфічних антигенів, які потребують постійного відновлення (пассажування на курячих ембріонах) для зберігання антигенних властивостей. Внаслідок особливостей процесу відновлення активності антигенів зберігається можливість певної розбіжності цих властивостей. Метою корисної моделі є розробка нового більш точного, універсального та швидкого способу оцінки ефективності лікування грипу коней. Поставлена задача вирішується тим, що після постановки діагнозу з використанням специфічних імунологічних реакцій контроль за рівнем запального процесу в організмі тварини здійснюється за допомогою визначення концентрацій молекул середньої маси (МСМ) в сироватках крові коней. Запропонований спосіб здійснюється наступним чином. Визначення титрів гемаглютинуючих антитіл проводимо за стандартною методикою, як описано вище [1]. В подальшому, після встановлення діагнозу контроль за ефективність лікування проводимо за рівнем молекул середньої маси (МСМ), що визначається біохімічним експрес-методом (2-4) Експрес-метод визначення рівня МСМ в сироватці крові. До сироваток крові добавляють 10 % трихлороцтову кислоту (ТХУ). Співвідношення сироватки до кислоти - 1:0,5. Потім центрифугують при ЗОООд протягом 20 хвилин. Таким чином отримують депротеїзований супернатант, який розводять дистильованою водою (до 0,5мл надоеаду добавляють 4,5мл). Після цього проводять УФспектрофотометрію надоеаду, звільненого від грубодисперсних білків. Довжину хвилі використовують 240нм. За оптичний контроль править розчин ТХУ відповідного розведення. Рівень МСМ виражают в умовних одиницях оптичної щільності (ум.од.) Переваги методики визначення МСМ - швидке виконання аналізу (протягом ЗО хвилин), наочність і інформативність амплітуди коливань показників екстінкції, які визначають спектрофотометричне. Методика дешева, потребує мінімуму реактивів, Крім того, ріст пула МСМ випереджає зміни інших рутинних лабораторних показників, а також клінічні ознаки патології. Зазначимо, що храніаня при 10°С протягом 5-6 діб провидьно приготовленої та 10905 замороженої сироватки крові практично не впливає на оптичну щільність кислоторозчинної фракції сироватки крові. Нашими дослідженнями встановлено наявність позитивної кореляції між титром антитіл та рівнем МСМ в сироватці крові коней, хворих на грип. Кореляційний аналіз проводили з використанням програми Microsoft Excel за формулою Cov(X,Y) ч / рх,у = ,де-1