Спосіб визначення активності синтази оксиду азоту експрес-методом

Спосіб визначення активності синтази оксиду азоту експрес-методом, що включає визначення сумарної активності синтази оксиду азоту, який відрізняється тим, що додатково окрім сумарної активності одночасно визначають індуцибельну активність синтази оксиду азоту. (19) (21) u200913356 (22) 22.12.2009 (24) 25.05.2010 (46) 25.05.2010, Бюл.№ 10, 2010 р. (72) СКЛЯРОВ ОЛЕКСАНДР ЯКОВИЧ, ФАРТУШОК НАДІЯ ВОЛОДИМИРІВНА, ХАВРОНА ОКСАНА ПАВЛІВНА, ФЕДЕВИЧ ЮРІЙ МИРОНОВИЧ, КУХЛЕНКО ОЛЬГА ЯРОСЛАВІВНА, МЕЛЕХ БОГДАН ЯРОСЛАВОВИЧ 3 визначенням активності синтази оксиду азоту визначають концентрацію гемоглобіну в цьому гемолізаті ціанметгемоглобіновим методом [4]. Зразки тканин відбирають після евтаназії експериментальних тварин під ефірним наркозом. Гомогенат із отриманих зразків тканин готують на Тріс-НСІ буфері рН 7,4, який містить 1мМ MgCI2, у співвідношенні 1:9. Кофермент NADPH+H+ проявляє максимум поглинання при 340нм, що дозволяє використати його як оптичний маркер для визначення активності синтази оксиду азоту спектрофотометричним методом. Сумарну активність синтази оксиду азоту визначають за інтенсивністю використання NADPH+H+ у реакційному середовищі, яке містить 0,6мл 5мМ KН2РO4, 0,6мл 1мМ MgCl2, 0,6мл 10мМ СаСІ2 на Тріс-НСІ буфері рН 7,4, 0,6мл 4мМ водного розчину L-аргініну, 0,4мл 1,0мМ розчину NADPH+H+. Реакцію запускають додаванням 0,3мл дослідного біоптату (гомогенат тканин, гемолізат еритроцитів) до реакційної суміші. Контрольна пробірка містить аналогічний набір реагентів, окрім розчину L-аргініну, замість якого додають 0,6мл дистильованої води. Зниження екстинкції розчинів реєструють при довжині хвилі 340нм. Активність NOS виражають в нмоль NADPH+H+, який окиснюється протягом 1 хвилини на 1мг білка. Розрахунок активності синтази оксиду азоту проводять за формулою: E P n x , 6,22 10 6 a b t 50209 4 де E - зміна оптичної густини проби для довжини хвилі 340нм за час t хв.; P - кінцевий об'єм проби, мл; 6,22 106 - молярний коефіцієнт поглинання відновленої форми піридинових нуклеотидів для довжини хвилі 340нм; а - концентрація білка в пробі, мг/мл; b - кількість внесеного екстракту, мл; n - розведення проби; t - час, хв. Активність індуцибельної NO-синтази (iNOS) визначають аналогічно, за винятком того, що в реакційну суміш замість 0,6мл 10мМ СаСІ2 розчину на Тріс-НСІ буфері (рН 7,4) вносять аналогічний буферний розчин, який не містить хлориду кальцію, оскільки ця ізоформа ферменту не вимагає присутності іонів кальцію. Запропонований експрес - метод визначення активності NO-синтази апробований в серії експериментальних та клінічних досліджень. Ефективність використання цього способу в клініці було підтверджена у дослідженні, в якому взяли участь 12 пацієнтів з черепно-мозковою травмою (ЧМТ) різного ступеня важкості та 12 здорових добровольців. Для досліджень використовували кров декількох груп пацієнтів з ЧМТ легкого, середнього та важкого ступенів важкості та кров здорових осіб. Активність NO-синтази визначали в гемолізаті еритроцитів у гострому періоді ЧМТ на 1 - 2 добу після початку захворювання. Таблиця 1 Активність синтази оксиду азоту (сумарна та активність індуцибельної ізоформи) у гемолізаті еритроцитів пацієнтів з черепно-мозковою травмою різного ступеня важкості та здорових осіб Показники NOS, нмоль NADPH/XB/ мг гемоглоГрупи обстеження біну Контроль, (n=12) 8,14±1,39 12,84±1,77 ЧМТ, легкого та середнього ступеня важкості (n=12) Р 0,01 14,04±1,25 ЧМТ, важкого ступеня (n=12) Р 0,01 iNOS, нмоль NADPH/XB/ мг гемоглобіну 2,11±0,04 3,59±0,35 Р 0,01 4,65±0,58 Р 0,01 Примітка: Р - у порівнянні з контролем. Отримані результати (Табл. 1) засвідчили, що в першу добу після отримання ЧМТ зростає сумарна активність NO-синтази та активність індуцибельної форми ферменту, причому ступінь зростання активності прямопропорційно залежить від ступеня важкості ЧМТ. Так, в групі пацієнтів з ЧМТ легкого та середнього ступенів важкості сумарна активність синтази оксиду азоту становила 12,84±1,77нмоль NADPH /хв./мг гемоглобіну, в групі пацієнтів з важкою ЧМТ - 14,04 і 1,25 нмоль NADPH/хв./мг гемоглобіну, що було достовірно вище у порівнянні з сумарною активністю даного ферменту в групі контролю - 8,14±1,39 нмоль NADPH /хв./мг гемоглобіну (Р 0,01 в порівнянні з контролем у обох групах пацієнтів). Аналогічно змінювалася і активність індуцибельної форми синтази оксиду азоту: найвищою вона була в групі пацієнтів з важкою ЧМТ 4,65±0,58нмоль NADPH /хв./мг гемоглобіну (Р 0,01 у порівнянні з контролем), дещо нижчою в пацієнтів з ЧМТ легкого та середнього ступеня важкості - 3,59±0,35нмоль NADPH /хв./мг гемоглобіну (Р 0,01 у порівнянні з контролем). Дослідження на 5 безпородних щурах-самцях передбачало моделювання експериментального цукрового діабету за допомогою введення стрептозотоцину в дозі 50мг/кг. На 14 день після початку експерименту в тварин після декапітації проводили забір експериментального матеріалу - зразків крові та печінки. Рівень глікемії в експерименталь 5 50209 них тварин коливався в межах 22,1±0,56ммоль/л. Сумарну активність синтази оксиду азоту та активність індуцибельної форми визначали в гомогенаті тканин печінки. Контрольну групу склали 5 інтактних тварин з нормальним рівнем глікемії. Згідно з отриманими результатами, в групі щурів з цукровим діабетом спостерігали достовір 6 не зростання сумарної активності синтази оксиду азоту 23,52±1,19нмоль NADPH/хв./мг білка (Р 0,05) та активності індуцибельної ізоформи ферменту 7,03±0,35нмоль NADPH/хв./мг білка (Р 0,05) (Табл. 2). Таблиця 2 Активність синтази оксиду азоту (сумарна та активність індуцибельної форми) в гомогенаті тканин печінки щурів із стрептозотоциновим діабетом Показники Групи обстеження Контрольна група (n=5) NOS, нмоль NADPH/хв./мг білка iNOS, нмоль NADPH/хв./мг білка 14,61±0,90 23,52±1,19 Р 0,05 4,34±0,41 7,03±0,35 Р 0,05 Дослідна група (n=5) Примітка: P – у порівнянні з контролем. Запропонований спосіб визначення активності NO-синтази простий, дешевий та зручний у клінічному використанні, оскільки дає можливість одночасно визначити як сумарну активність, так і активність індуцибельної ізоформи ферменту. Джерела інформації: 1. Clavier N., Tobin J.R., Kirsch J.R., Izuta M., Traystman R.J. Brain nitric oxide synthase activity in normal, hypertensive, and stroke-prone rats// Stroke. - 1994. - Vol25. - P.1674-1677. 2. Сумбаев В.В., Ясинская И.М. Влияние ДДТ на активность синтазы оксида азота в печени, лег Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська ких и головном мозге крыс // Совр. пробл. токсикологии. - 2000. - №3. - С.3-7. 3. Wada К., Chatzipanteli К., Kraydieh S., Busto R., Dietrich W. D., Rutka J. Т., Ziokovic В., Piepmeier J. M. Inducible nitric oxide synthase expression after traumatic brain injury and neuroprotection with aminoguanidine treatment in rats // Neurosurgesry. 1998. - Vol.43. - P.1427-1436. 4. Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина. - М.: Медицина, 1968. 225с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601