Спосіб визначення концентрації с-реактивного білка експрес-методом

Спосіб визначення концентрації Среактивного білка експрес-методом за допомогою латексного діагностикуму, який відрізняється тим, що використовують полістирольний карбоксильований латекс із розміром частинок 0,80,81мкм, на який наносять попередньо сенсибілізовані антитіла до С-реактивного білка. (19) (21) u200810068 (22) 04.08.2008 (24) 26.01.2009 (46) 26.01.2009, Бюл.№ 2, 2009 р. (72) КОЗАР ВАЛЕНТИНА ВІКТОРІВН А, U A, КУДРЯ МАРІЯ ЯКІВН А, UA (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ЕНДОКРИННОЇ ПАТОЛОГІЇ ІМ. В.Я. ДАНИЛЕВСЬКОГО" АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ Н АУК УКРАЇНИ, UA 3 38911 сироватку, що має аглютинацію при розведенні 1:20 [6]. Відомий спосіб одержання латексного діагностикуму, що полягає у використанні в якості носія суспензії профарбованих поліакролеїнових частин розміром 0,3-2,0мкм, які оброблені розчином білка, активовані зшиваючим агентом та сенсибілізовані антибактеріальними імуноглобулінами в фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) при рН 7,2-7,4 [1]. На теперішній час багатьма фірмами випускаються тест-системи для визначення концентрації СРБ, які засновані на методі латексної аглютинації. Ці тести дозволяють оперативно одержувати інформацію - час проведення аналізу складає 3 хвилини. Але чутливість таких тест-систем становить >6мг/л, тобто за їх допомогою неможливо визначати концентрації СРБ нижче 6мг/л. Однак, для стратифікації ризику серцевосудинних захворювань значимим є рівень СРБ нижче 6мг/л, тому актуальною на сьогодні є розробка тест-системи на основі латексної аглютинації саме з таким рівнем чутливості. Задача корисної моделі - розробка чутливого специфічного способу для напівкількісного визначення концентрації СРБ за допомогою латексного діагностикуму. Поставлена задача вирішується тим, що використовують полістирольний карбоксильований латекс із розміром частинок 0,8-0,81мкм та попередньо сенсибілізовані антитіла до СРБ. Частинки латекса сенсибілізують антитілами методом фізичної адсорбції. Водне середовище, в якому суспендують сенсибілізований анитілами носій, представляє собою гліциновий буфер рН 8,2. В якості стабілізатора використовують бичачий сироватковий альбумін (БСА). Консервантом є азид натрію. Приготовлений діагностикум може зберігатися протягом 1 року при температурі 4°С. Технічний результат - підвищення чутливості, стандартизація методу, що дозволяє використовувати його для визначення концентрації СРБ від 2мг/л. Запропонований спосіб здійснюється таким чином. Готують забуферений 0,15М розчином натрію хлориду гліциновий буфер шляхом доведення 0,1М розчину гліцину до рН 8,2 1N розчином NaOH та додаванням 8,5г натрію хлориду на 1л. Готовий буферний розчин містить 0,1% БСА та 0,03% азиду натрію. Реагент одержують шляхом розведення латексу та антисироватки у буферному розчині. Кількість антитіл, які використовують для сенсибілізації латексу, залежить від їх виду (поліклональні чи моноклональні) та концентрації білка, що визначається експериментальне. Кінцева концентрація латексу у суспензії знаходиться у межах 0,5% - 0,8%. Реагенти змішують у співвідношенні 1:1. Навантаження латексу здійснюють при 37°С 2 години при постійному помішуванні. Відмивання від надлишку антитіл проводять двічі гліциновим буфером шляхом центрифугування при 3000об/хв протягом 15 хвилин. Відновлюють попередній об'єм реагенту та проводять дослідження із стандартними зразками та сироватками людей і тварин. 4 Процедура визначення концентрації СРБ у досліджуваних зразках складається із наступних етапів. Діагностикум та досліджувані зразки підігрівають до кімнатної температури. Поміщають на слайд або скло по 20мкл реагенту та проб, перемішують скляною паличкою. Помішують пластини чи скло протягом 2-3 хвилин, після чого проводять облік реакції. Розвиток аглютинації свідчить про наявність у пробі СРБ. Сироватки, які показали позитивний результат, розводять гліциновим буфером. Найбільше розведення сироваток, які дали позитивний результат, є титром сироватки. Про рівень СРБ судять по останньому розведенню, при якому була виявлена аглютинація. Для напівкількісного визначення концентрації СРБ необхідно помножити титр сироватки, при якому спостерігалася аглютинація, на межу чутли вості діагностикуму (2мг/л). Чутливість діагностикуму визначалася за допомогою стандартного зразку, який містить відому кількість СРБ. Негативний контроль містить менше 2мг/л СРБ. Специфічність визначалася із стандартними зразками, що містять відому концентрацію ДНК, ревматоїдного фактору, і які можуть впливати на визначення СРБ. Приклад 1. Для оцінки чутливості використана стандартна сироватка (СРБ-стандарт) із вмістом СРБ 32г/л («Біохімтест», Росія), яка була розведена спочатку фізіологічним розчином (1 ампула в 1мл), а потім гліциновим буфером так, що останнє розведення містило 1мг/л СРБ. Латексний діагностикум давав позитивний результат лише із зразком, який містив СРБ 2мг/л і більше. Приклад 2. За допомогою діагностикуму були перевірені дві сироватки, які за даними комерційних діагностикумів містили 6мг/л СРБ. Із розробленим діагностикумом сироватка давала позитивну реакцію нерозведеною та у розведенні 1:2, при розведенні 1:4 аглютинація була відсутня. Таким чином, завдяки заявленому способу вдалося отримати більш чутливий реагент для напівкількісного визначення СРБ. Джерела інформації: 1. А.с. 1596926 СССР, МКИ G01N33/544, С12N1/00. Способ получения антительного диагностикума /Е.П.Ерохин, С.В.Прозоровский, И.С.Тартаковский [и др.] (СССР); заявитель научно-исследовательский інститут єпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, інститут биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Новоросийская противочумная станция (СССР) №4652164/31-13; заявл. 24.02.89. -8с. 2. Полевщиков А.В., Назаров П.Г., Галкина Е.В., Косицкая Л.С., Берестовая Л.К., Чмелев В.М. Влияние белков пентраксинового семейства на первичный иммунный ответ //Иммунол. - 1999. - № 3. -С.32-35 3. Титов В.Н., Близнюков О.П. С-реактивный белок: физико-химические свойства, методы определения и диагностическое значение. 4. Goodman L. Hard-hearted CRP //J. Clin Invest. -2004. -V113, N 9. - P.1244-1245. 5 38911 5. Paul A., Kerry W.S. Ко, Lan Li, Yechoor V., McCrory M. A., Szalai A. J., Chan L. C-Reactive Protein Accelerates the Progression of Atherosclerosis in Apolipoprotein E-Deficient Mice //Circulation. -2004. V109. P.647-655. Комп’ютерна в ерстка C.Литв иненко 6 6. Singer J.V., Plotz C. M., Elster S.K. The LatexFixation Test. III. Agglutination Test for C-Reactive Protein and Comparison with the Precipiti Method //Am. J. Clin. Pathol. -1957. -V.28, N5. -P.611 – 617. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601