Спосіб визначення мітохондріальних гаплотипів свиней

Спосіб визначення мітохондріальних гаплотипів свиней, який передбачає рестриктний аналіз фрагмента мітохондріального геному свині, попередньо ампліфікованого за допомогою полімеразної реакції, який відрізняється тим, що для полі меразної ланцюгової' реакції використовуються праймери, що складаються з таких послідовностей: 5'-САТ АСА ААТ АТО TGA ССС САА А-3' (MITPRO2F), 5'-GTG AGC ATG GGC TGA TTA GTC-3' (MITPROR), які дозволяють ампліфікувати фрагмент мітохондріального гену тРНК , що в поєднанні з рестриктним аналізом Sse 91 { і aatt) або ЇЇ аналогом дозволяє визначати 16 мітохондріальних гаплотипів, що характеризують певні породи свиней. Пропонована корисна модель відноситься до молекулярної' біології, біотехнології та генетики. Вона може бути використана при розведенні, удосконаленні існуючих та створенні нових порід, типів, родин свиней, для захисту інтелектуальної власності селекціонерів, а також при дослідженні бюрізноманітності виду Sus scrofa. В 2000 році Giuffa E., et al. [1] шляхом секвенції, визначили нуклеотидні послідовності фрагменту мітохондріального гену тРНК р 0 . В нуклеотидних послідовностях ряду європейських та азійських порід домашніх і популяцій диких свиней було знайдено однонуклеотидний поліморфізм. В 2001 році Okumura N. et al. [2], а в 2002 році Kim KI. et al. доповнили одержані результати [3]. Існує альтернативний секвенції спосіб визначення однонуклеотидного поліморфізму нуклеїнових кислот, заснований на поліморфізмі довжин рестриктних фрагментів ампліфікованих у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР-ПДРФ). ПЛР-ПДРФ - цей спосіб об'єднує два методи: ПЛР та ПДРФ. ПЛР - це циклічний процес, кожний цикл якого складається з трьох етапів: 1) денатурація нуклеїнової кислоти, що досліджується; 2) ренатурація нуклеїнової кислоти з олігонуклеотидними праймерами, що обмежують ампліфіковану ділянку; 3) синтез обмеженої ділянки ДНК до рівня виявлення. Тривалість циклу 1,5-3 хвилини, а число циклів, залежно від кількості вихідного матеріалу - від ЗО до 40. Ключовим параметром, що визначає спе цифічність та чутливість ПЛР є "якість" праймерів: ступінь їх гомології з ДНК матрицею, відсутність взаємної та неспецифічної ренатурації. ПДРФ метод дослідження нуклеїнових кислот, який полягає у специфічному ферментативному розщепленні досліджуваної ДНК ендонуклеазою з наступним електрофоретичним розділенням фрагментів ДНК. Необхідною умовою для застосування ПДРФ є наявність нуклеотидного поліморфізму ділянки ДНК, що досліджується. Існує ПЛР-ПДРФ система для диференціації видів родини порожнисторогих, через визначення ПЛР-ПДРФ мітохондріального гену цитохрому b [4]. Недоліком системи, що вказана, є неможливість дослідження виду Sus scrofa. В основу корисної моделі, що передбачається, поставлено завдання створити ПЛР-ПДРФ систему для диференціації порід свиней. Поставлена задача вирішується тим, що як і в способі для диференціації видів родини порожнисторогих де передбачено рестриктний аналіз фрагменту мітохондріального геному, попередньо одержаного за допомогою ПЛР. Створення ПЛР-ПДРФ системи для диференціації порід свиней передбачав пошук ділянки мітохондріального геному свині з наявністю поліморфних сайтів рестрикції, характерних для певних порід та зручних для електрофоретичної детекціі. Для аналізу з бази даних [5], були обрані наступні первинні послідовності мітохондріального геному свині: AF136555, AF136556, О о (О 6400 AF136557, AF136558, AF136559, AF136560, AF136561, AF136562, AF136563, AF136564, AF136565, AF136566, AF136567, AF136568, AF182446, AB015067, AB015069, AB015070, AB015071, AB015072, AB015074, AB015075, AB015077, AB015079, AB015080, AB015082, ABO15083, AB015090, АВ0150Э4, AB015095, D42171. Для конструювання системи праймерів за термодинамічними характеристиками використовували віртуальну комп'ютерну програму [61. Згідно з корисною моделлю, для ПЛР використовуються праймери, що складаються з таких послідовностей: 5'-САТ АСА ААТ ATG TGA ССС 1 САА А-3 (MITPRO2F), 5'-GTG AGC ATG GGC TGA 1 TTA GTC-3 (MITPROR). Фрагмент мітохондріального геному має один мономорфний та чотири поліморфних сайти рестрикції ендонуклеази Sse 91, або її аналога ( і aatt). Це дозволяє визначати 16 потенційно можливих мітохондріальних гаплотипів, деякі з яких характеризують наступні породи свиней: А - дюрок (європейський тип), мангалицька; С - гемпшир, уельс (азійський тип), дика свиня (Польща), G - уельс (європейський тип), дика свиня (Італія), І - ландрас {європейський тип), J мейшан, дика свиня (острів Ryukyu), L - велика біла (європейський тип), М - дюрок (азійський тип), N - беркшир, велика біла (азійський тип), дика свиня (південна Японія), О - ландрас (азійський тип), дика свиня (Ізраїль), Р - дика свиня (південний Китай). Комп'ютернаверстка А. Крулевський Пропонований спосіб визначення мітохондріальних гаплотипів свиней має наступні переваги: підвищення інформативності визначення мітохондріальних гаплотипів свиней (з 2 до 16 ), значне зниження затрат часу та реактивів. Джерела інформації: 1. The Origin of the Domestic Pig: Independent Domestication and Subsequent Introgression / E. Giuffra, J.M.H. Kijas, V. Amarger, O. Carlborg, J.-T. Jeon, L. Andersson // Genetics, 2000, v. 154, p. 1785-1791. 2. Genetic relationship amongst the major noncoding regions of mitochondria! DNAs in wild boars and several breeds of domesticated pigs / N. Okumura, Y. Kurosawa, E. Kobayashi, T. Watanobe, N. Ishiguro, H. Yasue, T. Mitsuhashi // Animal Genetics. 2001, v. 32, p. 139-47. 3. Phylogenetic relationship of Asian and European pig breeds determined by mitochondria! DNA D-loop sequence polymorphism / K-l. Kim, J-H. Lee Li K., Y-P. Zhang, J. Gongora, C. Moran // Animal Genetics, 2002, v.33, p. 19-25. 4. Species determination using speciesdiscriminating PCR-RFLP of ancient DNA from prehistoric skeletal remains / J. Burger, R. Schoon, B. Zeike at al. // Ancient Biomolecules, 2002, vol.4, p. 19-230. 5. GenBank (версія 00.2000 року). 6. Virtual Genome Center (http.//alsec/med/umn/edu/VGC.html). Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Украі'на ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м Київ - 42, 01601