Спосіб виявлення специфічних антитіл до вірусу грипу коней методом імуноферментного аналізу

Спосіб виявлення специфічних антитіл до вірусу грипу коней методом імуноферментного 3 - контроль робочої дози антигену. В п'ять лунок планшета, за виключенням першої, вносять по 3 0,05 см ФБР, у першу й другу лунки вносять по 3 0,05 см робочого розведення відповідного антигену. Після змішування із другої лунки переносять 3 0,05 см рідини в третю і т.д., із п'ятої лунки 0,05 3 см рідини видаляють. Далі, в усі лунки додають по 3 0,05 см 1 % суспензії курячих еритроцитів; - контроль негативної сироватки. Контрольну (негативну) сироватку розводять від 1:20 до 1:160 і титрують з антигенами, що входять до набору. Облік результатів. Діагностичним титром сироваток, що досліджуються у РГГА, вважають розведення 1:40. Реакція гальмування гемаглютинації недостатньо чутлива, трудомістка при масових серологічних дослідженнях, недостатньо об'єктивний візуальний облік результату реакції. В основу корисної моделі, що передбачається поставлено задачу розробити спосіб шляхом розроблення набору діагностикумів для виявлення специфічних антитіл до вірусу грипу коней методом імуноферментного аналізу, який дасть можливість уникнути перелічених недоліків найближчого аналога. Поставлена задача вирішується завдяки тому, що для постановки експресного методу (2-3 години) імуноферментного аналізу використовується культуральний хроматографічно очищений і концентрований грипозний антиген. За даними параметрами рішення, що заявляється відповідає критерію "суттєві ознаки". Суть корисної моделі полягає в тому, що до набору входить грипозний антиген, одержаний при одночасному культивуванні на курячих ембріонах і концентрування якого проводили, використовуючи адсорбційну та молекулярно-ситову хроматографію на макропористих сорбентах (МПС). Висока чутливість і специфічність способу з використанням методу імуноферментного аналізу (ІФА) досягається при використанні очищених від сторонніх білків концентрованих антигенів, правильно підібраних параметрів тест-системи, а саме: сенсибілізуючої дози антигену, рН інкубаційного буферного розчину, часу та температури адсорбції антигену на твердофазному носії. Набір містить полістироловий мікропланшет, сенсибілізований очищеним антигеном вірусу грипу коней, сироватку крові позитивну до вірусу грипу коней, сироватку крові негативну, антивидовий Комп’ютерна верстка Л. Купенко 64513 4 імунопероксидазний кон'югат та індикаторну систему (ортофенілендіамін). Використання набору для виявлення антитіл до вірусу грипу коней методом імуноферментного аналізу. У лунки планшету, що сенсибілізований грипозним антигеном (ряд А) вносять по 0,1 мл позитивної, (ряд В) негативної до грипу та у (ряди С,В,Е,Р,0,Н) дослідної сироватки крові коней. Потім Їх розтитровують методом подвійних розведень, інкубують у термостаті 1 годину при температурі 37 °С. Після цього планшет відмивають твін-фосфатно-буферним розчином (ТФБР) та вносять по 0,1 мл антивидового імунопероксидазного кон'югату, знову інкубують 1 годину при 37 °С і знову відмивають ТФБР та вносять субстратний розчин (ортофенілендіамін), спостерігають за забарвленням ферментативної реакції. При досягненні забарвлення позитивного контролю реакцію зупиняють додаванням до кожної лунки по 30-35 мкл 1М HCL, після чого проводять облік реакції за допомогою автоматичного спектрофотометра або візуально по інтенсивності забарвлення ферментативної реакції. При обліку реакції ІФА на спектрофотометрі, якщо показник оптичної щільності вище 0,17 - реакція позитивна. Експериментальні дослідження, які проведені з використанням більше 600 проб сироваток крові коней, показали, що при використанні розробленого способу з набором діагностикумів для ІФА є високочутливим, специфічним, тривалість дослідження 2-3 години; використання набору дає можливість проводити масові обстеження конярських господарств з лікувально-профілактичною метою. Спосіб постановки реакції з використанням набору автоматизований, мало трудомісткий. Таким чином розроблений спосіб виявлення специфічних антитіл до вірусу грипу коней методом імуноферментного аналізу, з використанням розробленого набору діагностикумів, дає можливість за 2-3 години провести діагностику захворювання тварин на грип, реакція високочутлива, специфічна, облік реакції автоматизований, може застосовуватись при масових діагностичних обстеженнях господарств. Корисна модель знайде застосування у виробничих лабораторіях ветеринарної медицини, та науково-дослідних установах, при проведені оздоровчих заходів від грипу коней. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601