Спосіб детекції іn vitro інтенсивності антитілозалежного клітинно-опосередкованого гемолізу
Номер патенту: 67035
Опубліковано: 25.01.2012
Автори: Дизик Галина Михайлівна, Лавровська Любов Никодимівна, Тимошенко Уляна Василівна, Мироненко Галина Анатоліївна, Аношина Милитина Юріївна
Формула / Реферат
Спосіб детекції in vitro інтенсивності антитілозалежного клітинно-опосередкованого гемолізу шляхом поєднання сенсибілізованих стандартною сироваткою антирезус людських еритроцитів 0(I) групи (клітин-мішеней) та досліджуваних лімфоцитів (клітин-ефекторів), який відрізняється тим, що активність цитотоксичного ефекту оцінюють в залежності від рівня вільного гемоглобіну з лізованих клітин-мішеней і збільшують кількість досліджуваного супернатанту в 10 разів.
Текст
Спосіб детекції in vitro інтенсивності антитілозалежного клітинно-опосередкованого гемолізу шляхом поєднання сенсибілізованих стандартною сироваткою антирезус людських еритроцитів 0(I) групи (клітин-мішеней) та досліджуваних лімфоцитів (клітин-ефекторів), який відрізняється тим, що активність цитотоксичного ефекту оцінюють в залежності від рівня вільного гемоглобіну з лізованих клітин-мішеней і збільшують кількість досліджуваного супернатанту в 10 разів. (19) (21) u201109313 (22) 25.07.2011 (24) 25.01.2012 (46) 25.01.2012, Бюл.№ 2, 2012 р. (72) ДИЗИК ГАЛИНА МИХАЙЛІВНА, МИРОНЕНКО ГАЛИНА АНАТОЛІЇВНА, ТИМОШЕНКО УЛЯНА ВАСИЛІВНА, АНОШИНА МІЛІТІНА ЮРІЇВНА, ЛАВРОВСЬКА ЛЮБОВ НИКОДИМІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ" 3 Найближчим аналогом є спосіб оцінки антитілозалежної цитотоксичності бластних клітин периферичної крові [3]. Принципом даного способу є лізис клітинамиефекторами крові (бластними формами) клітин+ мішеней (донорських еритроцитів 0(I)Rh, сенсибілізованих імунними антитілами IgG стандартної сироватки антирезус в титрі 1:32), з наступним обліком результатів реакції шляхом підрахунку зруйнованих клітин-мішеней. Недоліками описаного методу є складний та кропіткий підрахунок клітин-мішеней, і, як наслідок - відносно суб'єктивна оцінка цитотоксичного ефекту. Задачею заявленого нами способу є збільшення точності визначення рівня вільного гемоглобіну за рахунок підвищення стабільності забарвлення продуктів реакції, заміна високотоксичних реактивів на безпечніші та доступніші. Активність цитотоксичного ефекту оцінюють в залежності від рівня вільного гемоглобіну з лізованих клітинмішеней (сенсибілізованих стандартною сироваткою антирезус людських еритроцитів 0(I) групи) і збільшують кількість досліджуваного супернатанту в 10 разів. В запропонованому нами способі створюється модель in vitro, в якій ефекторами слугують виділені лімфоцити досліджуваної особи, а клітинамимішенями - еритроцити резус-позитивного донора + 0(I)Rh , покриті імунними IgG антитілами анти-D. Лімфоцити виділяють із гепаринізованої периферичної крові в градієнті щільності фікол-урографін 1,078, відмивають, підраховують в камері Горяєва і поєднують з клітинами-мішенями в співвідношенні 10 лімфоцитів на одну мішень. Як клітини-мішені + ми використовуємо еритроцити людини 0(I)I) (групи крові 0(I), резус-позитивні). Як імунні антитіла використовуємо сироватку антирезус, стандартизовану за титром і афінністю, в субаглютинаційному розведенні. Таким чином, анти-D(Rh0) антитіла сироватки поєднуються на мембрані еритроцита з антигеном D(Rh0), покриваючи його IgG антиеритроцитарними антитілами, і в той же час не викликаючи небажаної аглютинації. Інкубуємо 18 год. при температурі 37 °C. Визначення вільного гемоглобіну з лізованих клітин-мішеней здійснюється за допомогою гемі- ціанідного методу. Для розширення меж діапазону визначуваних концентрацій та для підвищення точності вимірювання кількість супернатанту збільшено в 10 разів. Вимірювання оптичної щільності розчину вільного гемоглобіну виконуємо на фотометричному обладнанні при довжині хвилі 540 нм у кварцовій кюветі 10 мм проти холостої проби, за яку використовується дистильована вода. Приклад виконання заявленого способу. Хворий П-в, 69р., діагноз: автоімунна гемолі12 тична анемія, Нb81 г/л, ер - 2,06х10 , ретикулоциКомп’ютерна верстка Мацело В. 67035 4 ти - 35 %о, пряма проба Кумбса позитивна (++++), непряма проба Кумбса виявила аутоантитіла (+++). Тобто у хворого в наявності передумови гемолітичного процесу, але залишається невідомим спрямування його - чи прогресує гемоліз, чи регресує. Визначення активності гемолізу запропонованою методикою і порівняння із такою у здорової людини (у наших дослідженнях - донорів крові) дає нам відповідь на поставлене питання. У донора крові Б-ко, 36 р. взято шляхом венепункції 15 мл крові, з якої виділено лімфоцити, в подальшому, в ході реакції, їх поєднано з еритроцитами інтактного донора 0(I)D+, покритими антиD сироваткою, згідно із запропонованою методикою. Через 18 год. оптичним методом на спектрофотометрі враховано активність комплементнезалежного гемолізу. Установлено: 1. У хворого індекс цитотоксичності становить 5,6 %. 2. У донора індекс цитотоксичності становить 0,6 %. Таким чином, моделювання in vitro процесу гемолізу еритроцитів, покритих аутоантитілами, показало суттєві відмінності між гемолітичним процесом у хворого на аутоімунну гемолітичну анемію і таким у здорової людини. В першому випадку має місце гемоліз, активність якого достовірно перевищує в 9,32 раза даний показник у здорової людини. Повторне дослідження даного показника у хворого допоможе оцінити перебіг хвороби і ефективність лікування. Джерела інформації: 1. Зимин Ю.И. Новый микрометод оценки антителозависимой клеточной цитотоксичности по выходу гемоглобина из лизированных эритроцитов / Зимин Ю.И., Чуканов С.В., Качанов Б.С, Марчук А.И. // Лабораторное дело, 1984. - №9. - С. 556-559. 2. Гордиенко С.М. Нерадиометрические методы оценки естественной цитотоксичности на эритроцитарные клетки-мишени / Гордиенко С.М. // Иммунология.-1984. №1.-С.31-36. 3. С.А.Гусева. Антителозависимая цитотоксичность бластных клеток периферической крови при острых лейкозах / С.А.Гусева, Л.М.Тищенко // Врачебное дело, 1988. - №1. - С. 55-56. 4. Вещества, продукты, производственные процессы и факторы с доказанной для человека канцерогенностью 2.1.4. Бензидин // Перечень веществ, продуктов, производственных процессов, бытовых и природных факторов, канцерогенных для человека, гигиенические нормативы. ГН 1.1.725-98. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethod for detection in vitro of intensity of antibody-dependent cell-induced hemolysis
Автори англійськоюDyzyk Halyna Mykhailivna, Myronenko Halyna Anatoliivna, Tymoshenko Uliana Vasylivna, Anoshyna Militina Yuriivna, Lavrovska Liubov Nykodymivna
Назва патенту російськоюСпособ детектирования in vitro интенсивности антителозависимого клеточно-опосредствованного гемолиза
Автори російськоюДизик Галина Михайловна, Мироненко Галина Анатолиевна, Тимошенко Ульяна Васильевна, Аношина Милитина Юрьевна, Лавровская Любовь Никодимовна
МПК / Мітки
МПК: G01N 33/34
Мітки: гемолізу, клітинно-опосередкованого, детекції, інтенсивності, спосіб, vitro, антитілозалежного
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/2-67035-sposib-detekci-in-vitro-intensivnosti-antitilozalezhnogo-klitinno-oposeredkovanogo-gemolizu.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб детекції іn vitro інтенсивності антитілозалежного клітинно-опосередкованого гемолізу</a>
Попередній патент: Спосіб отримання вірусінактивованого антипротеїназного засобу широкого спектра дії
Наступний патент: Спосіб діагностики подагри
Випадковий патент: Спосіб обробки бурового розчину карбоксиметилцелюлозою