Спосіб визначення проникності і перекисного гемолізу еритроцитів в одній пробі крові

1. Спосіб визначення проникності і перекисного гемолізу еритроцитів в одній пробі крові, що включає проведення біохімічного дослідження периферичної крові, визначення функціонального стану клітинних мембран за показником проникності еритроцитарних мембран (ПЕМ), який відрізняється тим, що додатково визначають структурний стан клітинних мембран за показником перекисного гемолізу еритроцитів (ПГЕ), при цьому дослідження проводять в одній пробі крові, для визначення перекисного гемолізу еритроцитів в залишковий після виміру проникності еритроцитарних мембран осад додають розчини, що різняться за концентрацією (сечовини і натрію хлориду), суміш піддають термостатуванню протягом 16±0,25 годин при температурі t=37±0,1°С, ступінь перекисного гемолізу виражають у відсотках оптичної щільності кожної проби по відношенню до оптичної щільності еталону 100% ПГЕ, при цьому вимір оптичної щільності проб проводять при дов U 2 (11) 1 3 20618 органів. Тому актуальним і необхідним є удосконалення способів оцінки стану мембранного апарату організму. Відомий "Способ определения резистентности эритроцитов" [Е. И. Слобожанина, В.В. Севастьянов, Н.М. Козлова и Е. А. Черницкий, а.с. №1469464, СССР, МКИ G 01 N 33/49, 1989г.// Бюл. №12, Госкомитет по изобретениям и открытиям при ГННТ СССР]. Суть способу полягає в інкубації проби крові (у контрольну додають детергент - Тритон Х-100, дослідну - фіз. розчин) при t=48-50±0,1°С протягом 10±1хв, наступному центрифугуванні 5хв при 3000g і вимірюванні оптичної щільності гемолізату еритроцитів при довжині хвилі (l)=540нм. Оптичну щільність контрольної проби приймають за 100%. Ступінь гемолізу виражають у відсотках оптичної щільності кожної проби по відношенню до оптичної щільності еталону 100% гемолізу і розраховують за формулою. І якщо значення гемолізу становить 5-9%, судять про помірне зниження резистентності еритроцитів, якщо значення гемолізу більш, ніж 10%, судять про виражений ступінь зниження резистентності еритроцитів. Недоліком способу є те, що дослідження дозволяють виявляти тільки ступінь стійкості клітинних мембран до перекисного окислення (резистентність еритроцитів) і не дає можливості визначити функціональний стан цих клітин - їхньої проникності для іонів та інших речовин. Відомий також спосіб «Определение перекисной резистентности эритроцитов» [Бахова А.К., Лазарева С.А., Редеева Е.М. Патент. №2134420 Россия, МКИ G01N 33/50 //МРЖ, ч.І, №2, 2000, 1096 П.] Суть способу полягає в наступному. Проба свіжої крові (0,1мл) вноситься у центрифужну пробірку, що містить 7,5мл охолодженої буферної суміші, центрифугується, виділяється осад, що розводиться ще раз 7,5мл буфера і по 1мл цієї суспензії еритроцитів розливають у дві пробірки, що містять по 4мл буфер у й одну з 4мл дистильованої води (контрольна проба - абсолютний гемоліз). Усі проби піддаються термостатуванню при t=37±0,1°C протягом 4±0,25 годин, після чого центрифугують при 1500об/хв, протягом 10хв і вимірюють оптичну щільність надосадової рідини на фотоелектроколориметрі - ФЕК (540нм, кювети 10мм). Величина гемолізу у відсотках розраховується за формулою: ( екстинкція проби 1 + екстинкція проби 2) х 100% 2 екстинкції контр. проби де: екстинкція - це оптична щільність досліджуваної або контрольної проби; Недоліком способу є недостатня чутливість лабораторних досліджень через багаторазове розведення та малу кількість еритроцитів на виході. Найближчим до корисної моделі аналогом, за суттю та результатом, що обраний нами за прототип, є спосіб визначення проникності еритроцитарних мембран (ПЕМ) [див. Колмаков В. Н., Радченко В.Г. Значение определения проницаемости 4 эритроцитарных мембран в диагностике хронических заболеваний печени// Тер. архив. - Том XXIV 1982. - №2. - С.59-62]. Суть способу-прототипу. Принцип методу визначення ПЕМ - гемоліз у суміші ізотонічних розчинів сечовини і хлористого натрію, що обумовлений здібністю сечовини швидко дифундува ти через клітинну мембрану і, створюючи гіперосмолярну концентрацію у еритроциті, викликати його набухання з подальшим гемолізом. При поміщенні суспензії еритроцитів у ізотонічні розчини з різним вмістом сечовини відбувається підвищення проникності еритроцитарних мембран (ПЕМ), що визначається як посиленням процесів пасивної фільтрації іонів, так і компенсаторним посиленням процесів активного транспорту. Термостатуванню розчини не піддають. Показник ПЕМ залежить від концентрації сечовини в розчині і виміряється за 6ма її параметрами. Недоліком прототипу є те, що він відображає тільки показники проникності еритроцитарних мембран при різному ступені навантаження одновалентними аніонами, але не дає можливості судити про їхню резистентність, тобто, стійкість до факторів, що викликають гемоліз. В основу корисної моделі поставлена задача створення інформативного способу визначення в одній пробі крові проникності і перекисного гемолізу еритроцитів (ПГЕ), що сприятиме здійсненню комплексної оцінки стану клітинних мембран - їхніх функціональних і структурних змін та дозволить оцінювати стан мембранного апарату організму при різних формах патології, зокрема, при впливі на організм несприятливих факторів навколишнього середовища, у тому числі шкідливих виробничих факторів. Задача вирішується у корисній моделі, яка включає проведення біохімічного дослідження периферичної крові, визначення функціонального стану клітинних мембран за показником проникності еритроцитарних мембран. Ознаками, що відрізняють корисну модель від прототипу є такі: - додатково визначають структурний стан клітинних мембран за показником перекисного гемолізу еритроцитів (ПГЕ); - при цьому дослідження проводять в одній пробі крові; - для визначення перекисного гемолізу еритроцитів в залишковий після виміру проникності еритроцитарних мембран осад додають розчини, що різняться за концентрацією (сечовини і натрію хлориду), суміш піддають термостатуванню протягом 16±0,25 годин при температурі t=37±0,1°С; - ступінь перекисного гемолізу виражають у відсотках оптичної щільності кожної проби по відношенню до оптичної щільності еталону 100% ПГЕ, при цьому вимір оптичної щільності проб проводять при довжині хвилі 540нм; - обчислення ПГЕ здійснюють при низьких, середніх і високих концентраціях сечовини за формулою: % ПГЕ=(D37°С´100)/D100%, де: D37°С - величина оптичної щільності досліджуваної проби, 5 20618 D100% - величина оптичної щільності контрольної проби, 100 - для вираження результатів у відсотках, - ступінь ПГЕ інтерпретують як помірний при значенні ПГЕ 8-10%, як підвищений - при значенні ПГЕ більш, ніж 10%. Додатковими ознаками є такі: здійснюють комплексну оцінку стану клітинних мембран за визначеними показниками ПЕМ та ПГЕ, значення яких відображують графічно (Фіг.1, Фіг.2) у вигляді кривої, форма якої, у цілому, відображає характер змін у функції та структурі мембран еритроцитів, при цьому діагностична значущість результатів залежить від тієї частини кривої, де реєструються відхилення від нормальних значень, а саме: - відхилення у нижній частині кривої (особливо 1 пробірка) - розцінюють як порушення стійкості мембран, що обумовлене ступенем розвитку запальної реакції в організмі (помірний до 8-10% і понад 10% - підвищений), - відхилення у середній частині кривої (2-4 пробірка) - розцінюють як зміни адаптаційнопристосувального характеру (помірний до 10-15% і понад 15% - підвищений), - відхилення у вер хній частині кривої (5-6 пробірка) - розцінюють як зміни, що обумовлені глибокою перебудовою структури клітинних мембран (помірний до 8-10% і понад 10%- підвищений). Графічні зображення: На Фіг.1. Розподіл показників проникності еритроцитів у осіб контрольної групи, робітників ливарного виробництва (ЛВ) і користувачів ВДТ (КВДТ). На Фіг.2 - Розподіл показників перекисного гемолізу еритроцитів у осіб контрольної групи, робітників ЛВ і користувачів ВДТ. На Фіг.3 - Розподіл показників проникності еритроцитів у осіб контрольної групи, робітників вібронебезпечних професій (РВНП) і користувачів ВДТ. На Фіг.4 - Розподіл показників перекисного гемолізу еритроцитів у осіб контрольної групи, РВНП і користувачів ВДТ. Визначення в одній пробі периферичної крові показників проникності еритроцитарних мембран (НЕМ) і перекисного гемолізу еритроцитів (ПГЕ), здійснення комплексної оцінки стану клітинних мембран - їхніх функціональних і структурних змін (за даними власних оригінальних (НДР) досліджень) дозволяє оцінити стан мембранного апарату організму при різних формах патології, зокрема, при впливі на організм несприятливих факторів навколишнього середовища, у тому числі шкідливих виробничих факторів, що підтверджується у подальшому наведеними у описі корисної моделі клінічними прикладами. Дослідження, згідно корисної моделі, для визначення показників НЕМ та ПГЕ в одній пробі крові проведені на прикладі робітників машинобудівного виробництва м. Харкова (75 чоловіків та 15 жінок) та користувачів ВДТ (33 чоловіка та 28 жінок) на групі порівняння (52 чоловіка). Відтворюваність корисної моделі - 95%. Спосіб здійснюють таким чином. 1. Проводять біохімічні дослідження периферичної крові. Відомим методом, що наведений у 6 описі суті прототипу (стор.3), визначають функціональний стан клітинних мембран за показником проникності еритроцитарних мембран (ПЕМ). [див. Колмаков В.Н., Радченко В.Г. Значение определения проницаемости эритроцитарных мембран в диагностике хронических заболеваний печени// Тер. архив. - Том XX IV -1982. - №2. - С.59-62]. 2. Згідно корисної моделі, додатково визначають структурний стан клітинних мембран за показником перекисного гемолізу еритроцитів (ПГЕ); при цьому дослідження проводять в одній пробі крові. Для цього в осад еритроцитів кожної з одержаних проб крові повторно додають розчини, що відрізняються за концентрацією (сечовини і натрію хлориду), вміст усі х 7 пробірок ретельно перемішують і піддають термостатуванню протягом 16±0,25 годин при температурі t=37±0,1°С. Далі проводять повторне центрифугування і вимір ступеня наростання оптичної щільності розчинів, тобто визначають температурний (перекисний) гемоліз еритроцитів при низьких, середніх і високих концентраціях сечовини. 3. Оптичну щільність контрольної проби (7-ої пробірки) приймають за 100%. Результати виміру розраховують за формулою, наведеної на стор.4 опису. 4. Здійснюють комплексну оцінку стан у клітинних мембран за визначеними показниками ПЕМ та ПГЕ, значення яких відображують графічно (див. Фіг.1, Фіг.2, Фіг.3, Фіг.4), у вигляді кривої, форма якої, у цілому, відображає характер змін у функції та стр уктурі мембран еритроцитів. 5. При цьому діагностична значущість результатів залежить від тієї частини кривої, де реєструються відхилення від нормальних значень, а саме для ПГЕ: - у нижній частині кривої (особливо 1 пробірка) - порушення стійкості мембран, обумовлене ступенем розвитку запальної реакції в організмі (помірний до 8-10% і понад 10% - підвищений) - у середній частині кривої (2-4 пробірка) - зміни адаптаційно-пристосувального характеру (помірний до 10-15% і понад 15% - підвищений), - у верхній частині кривої (5-6 пробірка) - зміни, обумовлені глибокою перебудовою структури клітинних мембран (помірний до 8-10% і понад 10% підвищений). У підсумку для характеристики проникності і перекисного гемолізу еритроцитів одержують по 6 показників, тобто усього 12 показників на кожного обстежуваного. Можливість виявлення змін у стані еритроцитарних мембран простежена на контингентах працюючих у несприятливих умовах праці, що дозволило відобразити різний характер впливу на організм робітників, що відбивається на стані мембран клітин крові. Приклад 1. Досліджують показники проникності і перекисного гемолізу еритроцитів у група х працюючих, що значно розрізняються за комплексом несприятливих факторів, що впливають на них. Перша з них - робітники ливарного виробництва (РЛВ) одного з машинобудівних заводів міста Харкова. Це представники основних професій, що 7 20618 піддаються впливу комплексу несприятливих виробничих факторів - дрібнодисперсного пилу (8590% часток не перевищують 2мкм) з високим вмістом вільного двоокису кремнію (від 10 до 70%) у концентраціях, що перевищують гранично припустимі рівні (ГПР - 1мг/м 3) у 2-10 і більш разів. Повітряне середовище в залежності від виду лиття може містити також газо- і пароподібні токсичні речовини. Крім цього, параметри інших шкідливих факторів ливарного виробництва - шум у, вібрації, мікроклімату, мікроклімату, що нагріває, присутність алергенів, наявність окислів металів у пилу, також найчастіше перевищували ГПР. Усього обстежено 86 осіб, що працюють у різних цеха х ЛВ. Друга гр упа - це користувачі відео дисплейних терміналів (КВДТ), які під час трудової діяльності 8 піддаються впливу комплексу факторів фізичної природи малої інтенсивності: електромагнітні поля (ЕМП) за електричною та магнітною складовими, статична електрика, м'яке рентгенівське випромінювання, ультрафіолетове випромінювання, а також порушення аероіонного складу у повітрі робочої зони, тривала статична напруга, напруга зорового аналізатора, нервова напруга. Обидві групи зіставлені за показниками проникності і перекисного гемолізу еритроцитів периферичної крові з особами контрольної групи, яку склали 52 особи, що не були в контакті зі шкідливими факторами виробництва. Дані наведені в таблиці 1, та графічно - у виді кривих, у даному випадку - на Фіг.1 та 2. Таблиця 1 ПЕМ: 1 2 1 4 5 6 ΠГЕ: 1 2 3 4 5 6 Робітники ливарного виробництва ЛВ n=86 Користувачі ВДТ n=52 № проби 2,50±0,21 4,12±0,33 18,80±1,45 65,78±4,30 79,89±4,91 94,22±2,31 1,73±0,20* 3,06±0,48 12,68±2,63* 38,91±5,72* 63,59±5,87* 77,07±5,46* 493±0,88* 23,12±1,97* 42,22±2,85* 78,57±2, 31* 89,63±1,09* 94,98±0,83 4,39±1,67 7,92±2,18 13,16±1,31 10,83±2,66 8,51±0,91 5,11±1,33 10,46±1,60* 16,06±1,43* 15,58±4,57 12,99±4,12 11,97±3,90 7,93±2,30 8,99±2,38* 18,37±6,88* 17,37±2,17* 9,93±2,30 3,57±0,85* 0,17±1,78* Контроль n=60 * - зрушення достовірне у зрівнянні з групою контролю. (*) - зрушення близько до достовірного Як видно з Таблиці 1 і Фіг.1, прийняті до вивчення контингенти працюючих значно розрізняються за показниками ПГЕ. У користувачів ВДТ, і у робітників ЛВ спостерігається підвищення перекисного гемолізу еритроцитів й обидві групи працюючих за цими показниками значно перевищують цифри контролю. Ці дані, особливо точки 2 (в обох групах) і 5 (у РЛВ), які перевищують границі норми, дозволяють припустити про небезпечну дію факторів виробничого середовища на організм робітників. Приклад 2. Досліджують показники перекисного гемолізу еритроцитів у гр упах працюючих, певною мірою близьких за комплексом несприятливих факторів, що впливають на них. Передбачалося, що в цьому випадку фігури кривих можуть мати визначені риси подібності. З цією метою були зіставлені особи, що піддаються виробничим факторам фізичної природи. Це користувачі ВДТ, а також група робітників ЛВ вібронебезпечних професій (РВНП - обрубники, наждачники, формувальники, чистильники, вибивальники виливків). Дані приведені в Таблиці 2, а також у Фіг.3, 4. Таблиця 2 ПГЕ 1 2 3 4 Робітники вібронебезпечних професій n=33 Користувачі ВДТ n=52 № проби 2,50±0,21 1,85±0,17* 4,93±0,88* 4,12±0,33 18,80±1,45 65,78±4,30 2,79±0,27* 11,90±1,63* 36,32±3,53* 23,12±1,97* 42,22±2,8* 78,57±12,31* Контроль n=60 9 20618 10 Продовження таблиці 2 5 6 ПГЕ 1 2 3 4 5 6 79,89±4,91 94,22±2,31 64,81±3,46* 79,30±3,98* 89,63±1,09* 94,98±0,83 4,39±1,67 11,13±1,33* 8,99±2,38* 7,92±2,18 13,16±1,31 10,83±2,66 8,51±0,91 5,11±1 33 20,10±4,86* 18,23±3,03 13,53±1,88 11,60±1.50(*) 8,21±1,32 18,37±6,88* 17,37±2,17 9,93±2,30 3,57±0,85* 0,17±1,78* * - зрушення достовірне у зрівнянні з групою контролю. (*) – зрушення близько до достовірного Як видно з Таблиці 2, а також Фіг.3, 4, у робітників вібронебезпечних професій, як і у всі х робітників ЛВ, відрізняються криві зміни значень перекисного гемолізу еритроцитів в обох гр упах працюючих (вібронебезпечних професій і користувачів ВДТ) і практично йдуть паралельно в першій половині кривої, тобто мають виразно загальні риси у динаміці змін показників ПГЕ. Висновки: Наведені приклади підтверджують, що використання на практиці запропонованого способу визначення проникності і перекисного гемолізу еритроцитів в одній пробі крові дає великий обсяг інформації про стан клітинних мембран еритроцитів, простий у виконанні, не потребує використання дорогих реактивів і складної апаратури, може бути виконаний у будь-якій, навіть мало оснащеній лабораторії. Технічний результат: Використання корисної моделі у медичній практиці сприятиме здійсненню комплексної оцінки стану клітинних мембран - їхніх функціональних і структурних змін та дозволить оцінювати стан мембранного апарату організму при різних формах патології, зокрема, при впливі на організм несприятливих факторів навколишнього середовища, у тому числі шкідливих виробничих факторів. 11 Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 20618 Підписне 12 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601