Штам escherichia coli о157, продукуючий шиготоксин другого типу (stх2)

Штам Escherichia coli О157, продукуючий шиготоксин другого типу (Stx2). Галузь техніки, до якої відноситься винахід: ветеринарна, мікробіологічна, біотехнологічна промисловість. Винахід застосовується в технології виготовлення Вакцини проти пастерельозу, сальмонельозу та колібактеріозу свиней "Пасако" й типоспецифічної діагностичної сироватки. Аналогом технологічного рішення є штами роду Е. coli з антигенними формулами 08, 09, 026 та інші, які використовуються у виробництві вакцинних препаратів, але не продукують шиго токсини [1]. Прототипом технологічного рішення є штам Е.coli О157:К88ас, який не продукує шиго токсини [2]. Escherichia coli продукують 2 антигенно відмінні типи шиготоксинів, які відрізняються рівнем біологічної активності [3]. Штами ешерихій, які продукують шиготоксин другого типу, викликають у свиней розвиток набрякової хвороби. Щеплення препаратами Stx2, похідних від штамів, ізольованих при набряковій хворобі поросят, обумовлює продукування протективних нейтралізуючих антитіл [4]. На даний момент в арсеналі біологічних профілактичних протиешерихіозних препаратів, в складі яких знаходяться антигени Е. coli серогрупи О157, що продукує шиготоксин другого типу в Україні немає. Разом з тим збудник цієї групи мікроорганізмів має домінуюче значення в групі ентерогеморагічних ешерихій, а також часто виділяється від поросят із симтомами діареї [2]. Тому його варто застосовувати при виготовленні профілактичних та діагностичних препаратів. Суть винаходу та його ознаки. Технічна задача. В основу винаходу покладена мета виділити штам Е. соlі з антигенною формулою О157, продукуючий шиготоксин другого типу, який має високу аглютинабельність, токсигенність, імуногенність і котрий можна застосовувати в технології виго товлення діагностичних та профілактичних біопрепаратів. Для досягнення цієї мети досліджені властивості ряду штамів, типованих як Е. coli з антигенною формулою О157, продукуючі шиготоксини. Штам Е. coli з антигенною формулою О157, продукуючий шиготоксин другого типу, виділений з трупу свині в свиногосподарстві Вінницької області в 2000 році. Штам задепонований в колекції мікроорганізмів Державного науково-контрольного інституту біотехнології та штамів мікроорганізмів і має реєстраційний номер 264. Штам Е. coli з антигенною формулою О157, продукуючий шиготоксин другого типу, стабільний і характеризується наступними властивостями: Морфологічні властивості. Штам має характерну для мікроорганізмів даного виду морфологічну характеристику: грамнегативні, короткі із заокругленими кінцями палички товщиною 1,0-1,5мкм, довжиною 3,05,0мкм, спор не утворює. В мазках розташовані поодиноко, попарно або невеликими групами. Культуральні властивості. Штам добре росте на звичайних та елективних (середовище Ендо) живильних середовищах при температурі 37°С. На МПБ утворює рівномірне помутніння з утворенням пристінкового кільця, на МПА-округлі, блискучі, гладенькі, випуклі, сіро-білі колонії, на агарі Ендо - темно-червоні колонії з металевим блиском. Ферментативні властивості. Штам ферментує з утворенням газу лактозу, цукрозу, маніт, мальтозу, не ферментує сорбіт. Утворює індол, не утворює сірководень, не утилізує цитрати, дає позитивну реацію з метилротом. Антигенні властивості. Штам аглютинується типоспецифічною сироваткою О157 в розгорнутій реакції аглютинації в титрі 1:6400 при інтенсивності реакції - 4 хрести. Не експресує відомих для ешерихій фімбріальних адгезинів. Вірулентні властивості. Штам патогенний для білих мишей (при внутрішньоочеревенному введенні в дозі 500млн.м.т.), телят, свиней, кролів, птиці. Токсигенні властивості. Штам продукує ши готоксин другого типу -Stx2. Диференціація виділеного штаму Е. coli з антигенною формулою О157 від інших ешерихій здійснюється за біохімічними, антигенними та токсигенними властивостями. Штам має біохімічні особливості. Його характерною ознакою є нездатність ферментувати сорбіт, у той час як 94% всіх Е. coli ферментують сорбіт на протязі 24 год. Для диференціації штаму за антигенними властивостями застосовують РА (реакцію аглютинації на склі чи в пробірках) за участю сироваток, отриманих на соматичний (О) антиген. Для визначення типу шиготоксинпродукування застосовують реакцію нейтралізації цитотоксичності, яку здійснюють в культурі клітин Vero з використанням антитоксичних сироваток, або полімеразну ланцюгову реакцію з використанням специфічних олігонуклеотидних праймерів. Технічний результат. Приклад 1. Проводили щеплення кролів за описаною нижче методикою. Як антиген використовували формалінізовані та інактивовані кип'ятінням змиви 24-годинних агарових культур Е.соlі О157:Н7, О157:К88ас, О157:НР з вмістом 2млрд м.т./см 3. Кролів щепили 1см 3 суспензією, яка містила 1:1 масляний ад'ювант та інактивовану 0,3% формаліном агарову культуру, дворазове з інтервалом 14 днів, підшкірно. Через 7 днів внутрішньовенне вводили бактерійну суспензію без ад'юванту з інтервалом 3 доби в дозах 0,1 0,2, 0,4 і 0,5см 3. Кров відбирали через 14 днів після останнього введення. З отриманими сироватками ставили пробірочну реакцію аглютинації. Як антигени використовували інактивоваю кип'ятінням і формалінізовані змиви добових агарових культур штамів Е.coli О157:Н7, О157:К88ас, О157:НР з концентрацією 500млн. м.т./см 3. Таблиця 1 Результати досліджень антигенних особливостей штамів Е. соlі. Сироватка Титр антитіл в РА з гомологічними і гетерологічними антигенами О157:Н7 1:6400 1:3200 1:6400 О157:Н7 О157:К88ас О157:НР О157:К88ас 1:3200 1:3200 1:6400 О157:НР 1:6400 1:6400 1:12800 З таблиці видно, що сироватка, отримана на штам О157:НР (патентований) характеризується високою аглютинабельністю у відношенні гетерологічних штамів ешерихій серогрупи О157, а штам характеризується високою імуногенністю. Приклад 2. Підготовка культури клітин. Суспензію клітин Vero засівали в 1,5л матраци (150-200тис. кл./1см 3) використовуючи ростове середовище RPMI 1640 з додаванням до нього 15% прогрітої при 56°С протягом 30хв сироватки крові телят та антибіотиків (бензилпеніцилін 100 од/мл, стрептоміцин 100мкг/мл). Інкубацію посівів здійснювали при 37°С, щоденно досліджуючи стан формування моношару за допомогою мікроскопу. Після формування суцільного шару клітин, його знімали за допомогою розчину версена (0,02%). Моношар формувався на 5-7 добу. С успензію клітин осаджували центрифугуванням - 1000об/хв 5хв і осад ресуспендували в 1/10 об'єм у поживного середовища. Концентрацію клітин підраховували в камері Горяєва за формулою: X=A(4000x2)/3600. Змиті клітини в ростовому поживному середовищі (100тис.кл./мл ) вносили по 1 мл у пробірки. Пробірки клали у штативи й інкубували в термостаті на протязі 1-2-х діб. За допомогою мікроскопу контролювали стан моношару клітин. Ростове середовище зливали, моношар промивали розчином Хенкса для видалення сироваткових антитіл й інгібіторів. В кожну пробірку вносили 0,1мл токсинвміщуючого матеріалу і 1мл середовища Ігла. Пробірки закривали гумовими пробками й інкубували при 37°С. Для кожної проби використовували по 4-5 пробірок з культурою клітин. Контролем служили пробірки в яких ростове середовище змінювали на підтримуюче. Всі пробірки після внесення токсину щодня досліджували під малим збільшенням мікроскопу. Остаточн у оцінку морфологічних змін проводили на 3-й день культивування. Штами досліджували повторно з використанням антитоксичних сироваток ( реакції нейтралізації). Для цього 0,5мл досліджуваного фільтрату інкубували на протязі 30хв при 37°С з 0,5мл антитоксичної сироватки, виготовленої на концентровані токсини Stx1, Stx2. 0,1мл суміші вносили в пробірку з культурою клітин і спостерігали на протязі 3-х днів. На кожну пробу використовували 8 пробірок - по 4 для кожної антитоксичної сироватки. При відсутності цитотоксичних змін у всіх 8 пробірках, штам вважали продуцентом обох типів токсинів, у 4 -продуцентом Stxl або Stx2 (залежно від того, якою антитоксичною сироваткою було оброблено токсичний матеріал). При проведенні серії досліджень ставили контролі з середовищем Ігла або антитоксичною сироваткою без токсинуміщуюючого матеріалу, а також з токсинуміщуючим матеріалом референтного штаму. Підготовка досліджуваної культури Е.coli або зразка матеріалу. Досліджувані культури вирощували при 37°С на протязі 5год в пробірках з 5мл МПБ рН7,5. В пробірки вносили 2,5мкг мітоміцину С (20мкл розчину) й інкубували ще 15 годин. Культури центрифугували (6000xg/15хв) і супернатант фільтрували через 0,22мкм мембранний фільтр. Розведення культуральних фільтратів (1:64, 256, 1024, 4096, 16384) здійснювали на 0,85% розчині NaCl. Таблиця 2 Оцінка цитотоксичної активності штамів - продуцентів шиготоксинів Штам 026 О157:Н7 05 Онт О157-.НР stx-гени stx1 stх1/2 stх2 stх2 stх2 Титр цитотоксичності культуральних фільтратів сироватки до Stx1 без анти сироватки сироватка до Stx1 сироватка до Stx2 і Stx2 1024 10 1024 10 16384 16384 4096 0 4096 4096 10 10 4096 4096 0 0 16384 16384 0 0 Штам Е. coli 057:HP характеризується високим рівнем експресії шиготоксину 2 типу, токсичність для культури клітин Vero повністю нейтралізується антитоксичною сироваткою. Задепонований в ДНЮБШМ штам Е. coli з антигенною формулою О 157 продукуючий шитотоксин 2 типу характеризується високим рівнем продукування шиготоксину 2 тип у й високою О-антигенною імуногенністю. Список використаних джерел 1. Павлов Е.Г., Волынец Л.К., Головко А.Н., Нарожный П.А. Колибактериозы молодняка сельскохозяйственных животных и птицы. - К., 1995. - 181. 2. Зоценко Л.В., Волинець Л.К. Моніторинг штамів Е.coli серогрупи О157 // Ветеринарна біотехнологія. Бюлетень № 2. - Київ, 2002. - С.83-87. 3. V.P.J. Gannon, C.L. Gyles, B.P.Wilcock / Effects of E.coli Shiga-like toxins (Verotoxins) in pigs. - 1989. - V. 53. P.306-312. 4. Construction ofrecombinant Shiga-like toxin-llv and its use in monitoring the the SLT-11v antibody status of pigs / S.Franke, F.Gunser, G.B. Wieler, H.Karch. - Vet.Microbiol. - 1995. - V.43. - P.41-52.