Спосіб підготовки біологічного матеріалу до тривимірної реконструкції

Винахід відноситься до медицини, зокрема до визначення, вимірювання чи реєстрації з діагностичною ціллю та може бути використаним при лабораторних дослідженнях в нормальній анатомії, гістології то що. Відомий спосіб підготовки біологічного матеріалу для тривимірної реконструкції, що містить виготовлення направляючої площини з направляючими смужками, їх покриття лаком, пошарове парафінування та нарізку біологічного матеріалу, в якому перед нарізкою біологічного матеріалу, перпендикулярно до площини зрізу парафінового блоку прикладають направляючу площину з направляючими смужками, що вкриті лаком [1]. Відоме технічне рішення забезпечує лише проведення реконструкції порожнин і деяких анатомічних структур, але при необхідності отримати більш тонкі результати гістологічних досліджень, переважно компартментів клітин, міокардіальних трабекул то що, його здійснення стримується. Причина, що стримує досягнення очікуваного технічного результату полягає в орієнтуванні всіх зрізів серії на склі в однаковому напрямку, без виявлення нативних ліній досліджуваних зрізів, особливо при однорідності структур досліджуваних матеріалів. Інші об'єкти аналогічного призначення при дослідженні рівня техніки не встановлені. В основу винаходу поставлено задачу розробити такий спосіб підготовки біологічного матеріалу для тривимірної реконструкції, який шляхом адекватного маркірування осей досліджуваних блоків забезпечує підвищення інформативності, точності досліджень та розширює межі використання при здійсненні. Вищезазначений технічний результат досягається тим, що у відомому способі підготовки біологічного матеріалу для тривимірної реконструкції, що містить виготовлення направляючої площини з направляючими смужками, їх покриття лаком, пошарове парафінування та нарізку біологічного матеріалу, у відповідності з винаходом, додатково на біологічний матеріал накладають як маркери нервові волокна, зі зсувом на 2, 10 та 6 годин відносно розташуванню на циферблаті в площинах Χ, Υ, Ζ, відповідно. Причинно-наслідковий зв'язок сукупності істотних ознак з вищезазначеним технічним результатом забезпечується маркіруванням та наступним виявленням нативних ліній досліджуваних тканин за допомогою нервових волокон. Крапковий вигляд маркерних ліній, створених за допомогою останніх, сприяє орієнтуванню гістологічних мікроструктур на предметному склі у трьох ступенях волі, а при великих збільшеннях об'єкта, коли вони не потрапляють до поля зору, отриманню орієнтованих полів стандартної сітки до всіх зрізів досліджуваного об'єкта, завдяки сполучанню маркерних точок. Найбільш оптимальний результат, що зв'язується з підвищенням інформативності, точності досліджень, а також розширенням меж використання об'єкта, особливо при дослідженні компартментів клітин та однорідних за структурою волокон, досягається при зміщенні нервових волокон від центральної вісі зразка на 2, 10 та 6 годин відносно розташуванню на циферблаті в площинах Χ, Υ, Ζ, відповідно. Тож, отримання більш тонких результатів при гістологічних дослідженнях набуває можливості, бо за допомогою орієнтира можливо виявити на всіх зрізах серії одну і ту ж ділянку. Додатковою перевагою винаходу над прототипом є оперативність підготовки біологічних матеріалів до реконструкції та зниження собівартості методики. Отже, сук упність відмітних ознак запропонованого рішення задачі не випливає з рівня техніки, що встановлений заявником, і має причинно-наслідковий зв'язок з очікуваним технічним результатом. Відомості, які пояснюють можливість здійснення способу підготовки біологічного матеріалу для тривимірної реконструкції, що заявляється, полягають в наступному. Для здійснення способу підготовки біологічного матеріалу для тривимірної реконструкції залучають набір реактивів, мікротом, світловий мікроскоп, нервові волокна, а для фіксування досліджуваних зразків - рідину Буена. Спосіб підготовки біологічного матеріалу для тривимірної реконструкції виконують наступним чином. Відразу ж після забору досліджувану тканину розміщують в рідині Буена [2], зневоднюють в розчинах спиртів зростаючої концентрації та ксилолі, а на завершення заливають парафіном. Парафінізацію зразка проводять разом із трьома нервовими волокнами, як маркерними осями, які розташовують на 2, 10 та 6 годин відносно розташуванню на циферблаті в площинах Χ, Υ, Ζ, відповідно. При цьому парафін поетапно охолоджують: спочатку охолоджують шар, в якому розміщений об'єкт та дві маркерні вісі (на 2 та 10 годин), а потім шар, в якому розміщена третя маркерна вісь - на 6 годин. На мікротомі отримують зрізи 7мкм завтовшки, орієнтуючи напрямок по маркерним точкам. Після фарбування препаратів, наприклад гематоксилінеозином, проводять дослідження в світловому мікроскопі, створюючи тривимірну модель за однією з методик [2]. Результати контрольних досліджень дозволили встановити, що при використанні допоміжних маркерних осей підвищується точність та інформативність заявленого способу, оперативність орієнтування в полі зору з виявленням ідентичних ділянок на всіх зрізах, запобігається викривлення кінцевих результатів при ущільненні зрізу, зміні його положення на предметному склі та забезпечується безпомилковий розрахунок масштабу тієї частини модельного об'єкта. Тобто, маркерні вісі за функціональним призначенням добре корелюють з артефактами, що виникають при виготовленні гістологічного препарату. Приклад 1. Задача - створити тривимірну модель порожнини лівого шлуночка. Об'єкт - серце дорослого щура. Досліджуваний зразок фіксували в рідині Буена, а обробку матеріалу проводили за відомою стандартною методикою [2]. Заливку об'єкта парафіном виконували разом із трьома нервовими волокнами, як маркерними осями, після їхнього зсуву на 2, 6 та 10 годин відносно розташуванню на циферблаті в площинах Χ, Υ, Ζ, відповідно. При виготовленні гістологічних зрізів на мікротомі (площина зрізу проходила фронтально по відношенню до центральної вісі об'єкта) орієнтували зрізи в одному напрямку з використанням маркерних крапок. Після обробки парафінових зрізів та їх фарбування гематоксилін-еозином за стандартною методикою [2] за допомогою маркерних точок, провели тривимірну реконструкцію порожнини лівого шлуночка. Приклад 2. Задача - створити тривимірну модель трабекули лівого шлуночка. Об'єкт - серце ембріона щура на 14-й добі пренатального розвитку. Досліджуваний зразок фіксували в рідині Буена, а обробку матеріалу проводили за відомою стандартною методикою [2]. Заливку об'єкта проводили разом з трьома нервовими волокнами, як маркерними осями, після Їхнього зсуву на 2,6 та 10 годин відносно розташуванню на циферблаті в площинах Χ, Υ, Ζ, відповідно. Після обробки парафінових зрізів та фарбування останніх гематоксилін-еозином отримали можливість сформувати по трьом маркерним точкам стандартну сітку зразка. У подальшому її розміщували в окулярі мікроскопу та обстежували при 40-кратному збільшенні. Дана сітка допомогла знайти на всіх зрізах ідентичні поля та зробити тривимірну реконструкцію трабекули лівого шлуночка. Таким чином, після проведення експериментального випробування запропонованого способу підготовки біоматеріалу для тривимірної реконструкції була встановлена можливість використання об'єкту в роботі дослідницьких морфологічних та патофізіологічних лабораторій саме в тому вигляді, який характеризується у незалежному пункті формули. За допомогою вказаних в заявці чи відомих на дату пріоритету діагностичних приладів і середовищ підтверджена можливість його відтворення з покращенням технічного результату, а саме інформативності, точності досліджень та розширенням меж використання об'єкта. Отже, розроблене технічне рішення відповідає умовам «промислова придатність», «новизна», «винахідницький рівень» і може бути кваліфіковане винаходом України. 1. Ромейс Б. Методы реконструкции /Микроскопическая техника. - М.: Иностранная литература.-1953. - Г.ХIV.С.209-216. 2. Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. - М.:Советская наука. - 1957. - с.468.