Спосіб виявлення ознак індукованого апоптоза в клітинних популяціях плаценти

Винахід відноситься до галузі медицини, зокрема патологічної анатомії, може бути використаний для прогнозування стану плацентарного бар'єра при індукції апоптоза гіпоксією та радіаційним фактором. Плацента у своєму розвитку безперервно зазнає процесів саморуйнування і самовідтворення. Ці протилежні за направленням процеси становлять єдність, яка важлива не лише в фізіологічних умовах, а й набуває провідного значення при розвитку патологічних станів, оскільки порушення сталості клітинного складу або у бік проліферації або у бік клітинної смерті призводять до тяжких стр уктурних змін. Тому процеси загибелі разом з диференціацією є важливими станами життєдіяльності клітини, які забезпечують структурний гомеостаз багатоклітинних організмів на усіх етапах їх розвитку у нормі і при патології. При впливові ушкоджуючих чинників на плацентарний бар'єр в останньому виникають альтернативні зміни аж до необоротних. Існують дві основні морфологічні форми клітинної смерті: перший - апоптоз, який є активним процесом саморуйнування клітини, а другий - некроз як прояв руйнування клітини внаслідок її ушкодження. Описані фазність апоптозу і його патогенетичні механізми в різних органах, визначені біохімічні, мікроскопічні та ультраструктурні зміни при цьому процесі (Задорожна Т.Д., Лук'янова І.С. Структурні особливості апоптозу в плаценті //Журнал АМН України. -1997; Zadorozhnaya T. Dinamic of apoptosis changes in early normal pregnancy chorionic villi and decidua // Placenta. -1999; Zadorozhna T.D., Hata Т., Lukianova I. Placenta apoptosis immunohistochemistry and incorporated radionuclides in chronic hypoxia of pregnancy //Placenta. -1999; Задорожна Т.Д., Лук'янова І.С., Дашкевич В.Є., Антипкін Ю.Г., Єщенко О.І., Покришко С.М., Хеншо у Д., Хата.Т. Особливості проліферативних реакцій структур плаценти при інкорпоруванні радіонуклідів: морфологія та імуногістохімія (огляд літератури та власних досліджень //Журн. АМН України, 1999, Huppertz В.The apoptosis cascade in human placental trophoblast //Placenta. -1999; Lee H.P. Programmed cell death in placentas //Placenta. -1998; Levy R., Nelson D.M. Current topic: to be, or not to be, that is the question. Apoptosis in human placenta //Placenta. -2000, Zadorozhnaya T. Dinamic of apoptosis changes in early normal pregnancy chorionic villi and decidua //Placenta. -1999, Zadorozhnay T. Bondarenko G. Proliferative cell nuclear antigen in early normal pregnancy placental tissues //Placenta. -2000, Zadorozhnaya Т., Hata Т., Lukianjva I. Placenta apoptosis immunochemistry and incorporated radionuclides in chronic hypoxia of pregnancy //Placenta. -2000, Бондаренко Г.I, Лукьянова I.С. Апоптоз в плаценті. Огляд літератури //Перинатологія та педіатрія -2001, Zadorozhnaya Т., Antipkin Yu., Stad y of CEA, p53, PCNA, cytoceratin in thyroid gland of fetuses from women living in radionuclides contaminated areas after Chernobyl accident in different terms of gestation //XXIY International Congress of the International Academy of Pathology. -2002. -Amsterdam, Zadorozhnay Т., Bondarenco G., Pokryshka S. Antiapoptotic protein Bcl-2 in early human placenta //Placenta. -2001, Задорожна Т.Д., Єщенко О.І., Арчакова Т.М. Порівняльна характеристика методів виявлення апоптозу в плаценті //Вісник морфології. -2002, Zadorozhnaya Т., Archakova Т., Grebinitchenko A. Morphology and immunohistochemistry of apoptosis in the placenta following intrauterine fetal death //Placenta -2000, Єщенко O.I., Покришко С.М. Морфологічні та імуногістохімічні особливості клітинних популяцій плацентарного бар'єра у жінок при інкорпоруванні радіонуклідів більше 5Бк/кг. //Галицький лікарський вісник -2003, Арчакова Т.М. Особливості апоптозу у ворсинчастому хоріоні при природжених вада х розвитку центральної нервової системи у плода //Галицький лікарський вісник. -2003). Але чимало питань запишаються нез'ясованими: потребують оцінки і детального вивчення суперечливі дані про наявність апоптоза та особливостей взаємодії і впливу його на проліферацію у різних стр уктурах плаценти при патології (екстрагенітальна патологія), а також дії несприятливих факторів навколишнього середовища (радіаційного). Усе це вказує на важливість досліджень процесу апоптоза та виявлення його ознак в клітинних популяціях плацентарного бар'єра при дії гіпоксичного та радіаційного факторів, що необхідно для морфологічної характеристики стану плацентарного бар'єра та розробки профілактичних заходів пропередження розвитку ускладнень вагітності та порушень стану новонародженого. Способу виявлення ознак індукованого апоптоза в клітинних популяціях плаценти на основі сучасних морфологічних методів дослідження його, у доступній науково медичній та патентній літературі автори не виявили. В основу винаходу покладено задачу створення способу виявлення ознак індукованого апоптоза в клітинних популяціях плаценти, у якому використана морфологічна та гістостереометрична оцінка його особливостей апоптоза при дії гіпоксичного (екстрагенітальна патологія) та радіаційного (різна питома масова активність радіонуклідів в плаценті) факторів, що дало можливість розробити критерії ознак індукованого апоптоза, які дозволять прогнозувати стан плацентарного бар'єра, плоду та новонародженого і сприятимуть зниженню перинатальної смертності. Поставлена задача способу виявлення ознак індукованого апоптоза в клітинних популяціях плаценти вирішується тим, що згідно винаходу досліджуються такі показники: - гістологічні ознаки апоптоза; - наявність дезоксирибонуклеїнових гранул в ядрах клітин; - апоптозний індекс; - ступінь експресії реакції TUNEL (мітка ДНКнуклеотидів, опосередкована кінцевою трансферазою); антиапоптотичного протеїну bсl2; проапоптотичного протеїну р53. Гістологічні ознаки апоптоза встановлюють за допомогою загальногістологічних методів - забарвлення зрізів гематоксилін-еозином та пікрофуксином по ван-Гізон; наявність ДНК-гранул в ядрах клітин виявляється за допомогою методу Фельгену з наступною обробкою реактивом Шифа; апоптозний індекс - це визначення кількості клітин, в яких є морфологічні ознаки апоптоза, в перерахунку на 100 досліджених клітин з наступним вичисленням відсотків, ступінь експресії реакції TUNEL визначають прямим імунопероксидазним методом, за допомогою мітки ДНК-нуклеотидів опосередкованою кінцевою трансферазою; ступінь експресії bcl-2 та р53 визначається за допомогою непрямого імуногістохімічного стрептовідін-пероксидазного методу з використанням Kit моноклональних антитіл, ступінь експресії оцінюється в балах: 0 - немає видимого забарвлення; 1 - слабка ступінь; 2 - помірний ступінь; 3 - виразний ступінь; 4 - дуже виразний ступінь. Аналіз дослідження плацент з різною питомою масовою активністю радіонуклідів та при гіпоксії, яка викликана екстрагенітальною патологією, показав, що в децидуальних клітинах та клітинах плацентарного бар'єра виявлені зміни, які характеризують різні стадії апоптозного процесу. При цьому виявляються зміни хроматину ядра, його ущільнення, конденсація навколо мембрани у вигляді кільця або напівмісяця. При дії радіаційного фактору виявлено збільшення або зменшення розмірів ядер, зміна конфігурації. Найбільша кількість таких ядер спостерігалась в ендотелії фетальних судин та епітелії ворсин. Лімфоїдна інфільтрація навколо цих клітин відсутня. В більшості спостережень відмічалась рання (ущільнення хроматину) та проміжна фази (конденсація хроматину навколо мембрани у вигляді кільця) апоптозного каскаду. Клітини на пізній стадії - з утворенням апоптозних тілець, виявлялись в меншій кількості. Кількість клітин з морфологічними ознаками апоптоза (апоптозний індекс) знаходилась в прямій залежності від питомої масової активності радіонуклідів в плаценті та від ступеню серцевої недостатності. Дослідження показали, що найбільший показник апоптозного індексу відмічався в плацентах з питомою масовою активністю радіонуклідів більше 4,8Бк/кг і в три рази перевищував показник групи контролю (25,0±0,75)%, контроль (8,0±0,24)%; р