Спосіб визначення антитіл до ліпополісахаридів грамнегативних бактерій

Винахід стосується біології і медицини, а саме, способів визначення характеристик крові в організмі і може бути використаний для визначення рівня антитіл різних класів, специфічних до ліпополісахаридів грамнегативних бактерій - анти-ЛПС-антитіл, у сироватці і плазмі крові людей і лабораторних тварин. За прототип обраний спосіб визначення антитіл до ліпополісахаридів грамнегативних бактерій [Takahashi К., Fukada M., Kawai M., Yokochi T. Detection of lipopolysaccharide (LPS) and identification of its serotype by an enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) using poly-L-lysine //J. Immunol. Meth.- 1992.- Vol.153, №1-2 -P.67-71], який полягає в проведенні непрямого твердофазного імуноферментного аналізу з використанням поло-L-лізина для модифікації поверхні твердої фази перед одержанням шару імуносорбента, причому для зниження рівня неспецифічних реакцій на етапах проведення аналізу застосовується реагент, що блокує - 0,01%-й розчин бичачого сироваткового альбуміну. Ліпополісахарид, імобілізований на модифікованої поло-L-лізиній твердій фазі, взаємодіє зі специфічними до нього антитілами чи сироватки плазми крові; далі з комплексом, що утворився, зв'язуються антивидові антитіла, кон'юговані з ферментом. Дія ферменту призводить до утворення в субстратно-буферної суміші забарвлених продуктів реакції, світло поглинання яких вимірюють за допомогою мікрофотоколориметра після зупинки ферментативної реакції. Ознаками прототипу, загальними з істотними ознаками запропонованого способу, є: проведення непрямого твердо фазного імуноферментного аналізу. Причинами, що перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату (підвищення чутливості і специфічності аналізу), є: при одержанні шару імуносорбента ліпополісахарид погано сорбується на поверхні полістиролових планшетів, тому для поліпшення його сорбції тверду фазу попередньо модифікують високомолекулярним поло-L-лізинім, що поряд зі зростанням сорбції ліпополісахариду істотно підвищує рівень неспецифічних взаємодій, що призводить до зниження співвідношення корисний сигнал/фон і падінню чутливості і специфічності реакції. В основу винаходу поставлена задача удосконалення способу визначення антитіл до ліпополісахаридів грамнегативних бактерій шляхом використання нового принципу одержання шару імуносорбента, що полягає в зміні складу імобілізаційного буфера і температурного режиму сорбції, що не вимагає попередньої модифікації поверхні твердої фази, дозволяє підвищити чутливість і специфічність аналізу, а також спростити та здешевити процедуру його проведення. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення антитіл до ліпополісахаридів грамнегативних бактерій шляхом проведення непрямого твердофазного імуноферментного аналізу, відповідно до винаходу, сорбцію ліпополісахариду проводять у 0,05М карбонатному буфері, що містить 70% сульфат амонію при рН9,6 і температурі 37°С протягом 12-18 годин. Між сукупністю істотних ознак запропонованого способу та очікуваним технічним результатом, що може бути досягнутий, виявляється наступний причинно-наслідковий зв'язок: проведення сорбції ліпополісахариду з 0,05М карбонатного буфера, рН9,6, що містить 70% сульфат амонію і при температурі 37°С протягом 12-18 годин дозволяє виключити етап попередньої модифікації поверхні твердої фази поло-L-лізинім, що підсилює гідрофобні взаємодії ліпополісахариду з поверхнею твердої фази і забезпечує його міцну мобілізацію, що дає можливість підвищити специфічність і чутливість імуноферментного аналізу. Спосіб полягає в наступному. Для одержання шару імуносорбента сорбцію ліпополісахариду на поверхні полістиролових планшетів проводять з 0,05М карбонатного буфера, рН9,6, що містить 70% сульфат амонію - буфер для іммобілізації, протягом 12-18 годин при 37°С. При цьому в кожну лунку вносять по 100мкл буфера для іммобілізації, що містить ліпополісахарид у концентрації 10мкг/мл. Для запобігання висихання розчину ліпополісахариду в буфері для іммобілізації лунки планшетів необхідно герметизувати за допомогою однобічної самоклейкої плівки. Для видалення ліпополісахариду, що не зв'язався та одночасного блокування вільних центрів зв'язування лунки промивають 4 рази по 1 хв. робочим буфером, що представляє собою 0,05 М фосфатний буфер, рН7,4, що містить 1% NaCI і 0,05% Tween 20. Далі в лунки послідовно вносять по 100мкл аналізованої розведеної плазми чи сироватки крові і кон'югата антивидових антитіл з пероксидазою хрону. З кожним реагентом проводять 60хвилинну інкубацію при 37°С. Неспецифічне зв'язалися компоненти після кожного етапу відмивають робочим буфером 5 разів по 2 хвилини. При визначенні анти-ЛПС-антитіл класів А, М і G тестовані плазми чи сироватки крові людини за допомогою PBS-T розводять у 50 разів. Для реєстрації пероксидазної активності в лунки вносять по 100мкл субстратно-буферної суміші, що представляє собою 30 мМ фосфатно-цитратний буфер, рН5,0, що містить 0,33 мг/мл о-фенилендіаміну і 0,02% Н2O2 і інкубують 60хв. при 37°С. Реакцію зупиняють доданням у лунки 25мкл 3М сірчаної кислоти. Оптичну щільність кінцевого продукту ферментативної реакції визначають за допомогою імуноферментного аналізатора АКІ-Ц01 при довжині хвилі 492нм чи іншого аналогічного приладу. Рівні анти-ліпополісахаридних антитіл виражають в умовних одиницях оптичної щільності кінцевого продукту ферментативної реакції для розведення тестованої плазми крові в 50 разів. Спосіб ілюстрований графічним матеріалом. На Фіг. представлені криві сорбції, по осі абсцис - концентрація ліпополісахариду Escherichia coli К30, мкг/мл; по осі ординат - оптична щільність при довжині хвилі 492 нм. На Фіг. - крива 1 показує ефективність сорбції ліпополісахариду за допомогою способу-прототипу, а крива 3 за допомогою запропонованого способу, крива 2 показує рівень неспецифічних реакцій при використанні способупрототипу, а крива 4 - при використанні способу, що заявляється. Криві 1 і 2 отримані при сорбції ліпополісахариду Escherichia coli К30 по способу-прототипу з попередньою обробкою полістиролу поло-L-лізину, молекулярна маса більше 300кДа, Sigma. Для зниження рівня неспецифічних реакцій на етапах проведення аналізу застосовують реагент, що блокує - 0,01%-й розчин бичачого сироваткового альбуміну. Криві 3 і 4 отримані при сорбції ліпополісахариду Escherichia coli К30 з 0,05М карбонатного буфера, рН 9,6, що містить 70%-й сульфат амонію протягом 18 годин при 3700 кДа, Sigma. Для одержання кривих 3 і 4 лунки були послідовно оброблені розведеною 1:400 сироваткою крові мишей, імунізованих ліпополісахаридом Escherichia coli К30 і кон'югатом козячих афінно очищених антитіл з пероксидазою хрону 1:2500. Для одержання кривих 2 і 4 лунки були оброблені тільки кон'югатом козячих афінно очищених антитіл проти m - ланцюза Ig M миші з пероксидазою хрону 1:2500. Для способу-прототипу при концентрації ліпополісахариду в буфері для іммобілізації, рівної 10мкг/мл, величина корисного сигналу складає 0,994, а співвідношення сигнал/фон - 1,9, а для запропонованого способу відповідно 1,216 і 60,8. Приведені дані показують те, що попередня обробка полістиролу поло-L-лізинім, як це роблять у способіпрототипі, збільшує сорбцію ліпополісахариду, однак одночасно призводить до істотного зростання неспецифічних взаємодій. Це виявляється в зниженні співвідношення корисний сигнал/фон навіть при використанні 0,01% бичачого сироваткового альбуміну як блокуючого реагент. При використанні для сорбції ліпополісахариду запропонованого способу при більш високій ефективності іммобілізації ліпополісахариду в порівнянні зі способом-прототипом рівень неспецифічних реакцій залишається дуже низьким, що виключає необхідність застосування яких-небудь додаткових блокуючих реагентів. Відомості, що підтверджують можливість використання винаходу. За допомогою запропонованого способу визначення антитіл до ліпополісахаридів грамнегативних бактерій була обстежена плазма крові 97 постійних донорів крові і визначено середній вміст, а також особливості розподілу рівнів антитіл класів А, М і G, специфічних до ліпополісахаридів Escherichia coli К30 і Salmonella minnesota. Для виявлення анти-ліпополісахаридних антитіл класів А, М і G були використані імунопероксидазні кон'югати козячих афінно очищених антитіл до Ig A, Ig M та IgG людини хрону фірми Sigma. Рівні IgA, IgM і IgG-антитіл до ліпополісахариду Escherichia coli К30, які більше ніж у 3 рази перевищують значення відповідних медіан, були зареєстровані відповідно в 11,2, 5,2 і 2,1% донорів. Рівні IgA і IgG-антитіл до ліпополісахариду Salmonella minnesota, які більше ніж у 3 рази перевищують значення відповідних медіан, були виявлені відповідно в 3,1 і 8,2% донорів. У той же час вміст IgM-антитіл до ліпополісахариду Salmonella minnesota не перевищував в 3 рази значення медіани для цього показника в жодного з 97 обстежених донорів. Яка-небудь кореляція між вмістом антитіл різних класів до ліпополісахаридів Escherichia coli К30 і Salmonella minnesota була відсутня. Крім того, установлено, що розподіл рівнів природних антитіл до ліпополісахаридів Escherichia coli K30 і Salmonella minnesota у плазмі крові донорів мав виражену позитивну асиметрію щодо значень відповідних медіан. Спосіб, що заявляється, дозволяє за рахунок ефективної сорбції ліпополісахариду на полістирол підвищити точність визначення специфічних до нього антитіл, а також спростити та удешевити процедуру проведення аналізу за рахунок виключення етапу обробки полістиролового планшета поло-L-лізинім і наступного блокування центрів неспецифічного зв'язування розчином бичачого сироваткового альбуміну. Запропонований спосіб визначення рівня анти-ліпополісахаридних антитіл характеризується високою чутливістю, специфічністю, простотою і приступністю у відношенні реагентів і може бути використаний як у клінічних, так і в науково-дослідних лабораторіях.