Спосіб імуноферментного визначення антитіл до вірусу діареї великої рогатої худоби

Спосіб імуноферментного визначення антитіл до вірусу, що включає нанесення антигену на твердий носій, інкубацію з сироватками крові, які досліджують, з подальшим внесенням антивидового імунопероксидазного кон'югату та субстрату і визначенням продукту ферментативної реакції, який відрізняється тим, що як антиген використовують очищений ультрацентрифугуванням у градієнті ЩІЛЬНОСТІ сахарози культуральний вірус діареї великої рогатої худоби Винахід, що передбачається, відноситься до ветеринарної вірусологи та біотехнологм, може бути використаний для визначення антитіл у сироватці крові великої рогатої худоби (ВРХ) В основі винаходу лежить використання очищеного у градієнті ЩІЛЬНОСТІ сахарози антигену вірусу діареї та блокуючого розчину, що містить фосфатний буферний розчин (ФБР) і 0,5% сироватки крові коня У лабораторній практиці для проведення серологічних досліджень щодо вірусу діареї ВРХ використовують реакцію нейтралізації, реакцію зв'язування комплементу, реакцію імунодифузм Вищенаведені способи поступаються за специфічністю, чутливістю, тривалістю та трудомісткістю імуноферментному аналізу (ІФА) Існує "Способ иммуноферментного определения антител к вирусу СПИД" (АС №1581022, от 30 06 88, G01 N33/535) Цей спосіб застосовують тільки для визначення антитіл до вірусу СНІДу Спосіб виконують активацією полістиролових планшетів синтетичними пептидами, а як білок у кон'югаті використовують білок А Цей спосіб не можливо застосовувати для визначення антитіл до вірусу діареї Існує "Наставление по применению набора для определения антител к вирусу снижения яйценоскости кур иммуноферментным анализом, Россия, Минсельхозпрод, 25 ноября, 1999 г, №137-2/1792" Це рішення може бути прототипом Спосіб ІФА для визначення антитіл містить нанесення антигену на твердий носій, інкубацію з антивидовим імунопероксидазним кон'югатом, внесення субстрату та визначення продукту перо ксидазної реакції Недоліком способу є можливість використання його тільки для визначення антитіл до вірусу синдрому зниження несучості курей В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб імуноферментного визначення антитіл до вірусу, що містить нанесення антигену на твердий носій, інкубацію з сироватками крові, що досліджують, з послідуючим внесенням антивидового імунопероксидазного кон'югату та субстрату і визначенням продукту ферментативної реакції шляхом використання як антигену очищеного ультрацентрифугуванням у градієнті ЩІЛЬНОСТІ сахарози культурального вірусу діареї, щоб забезпечити спосіб імуноферментного визначення антитіл до вірусу діареї ВРХ Спосіб виконується таким чином Аналіз проводять за слідуючою схемою Для сенсибілізації планшету у лунки вносять по ЮОмкл очищеного антигену вірусу діареї, планшет накривають кришкою та залишають на 18 годин при температурі 4°С Після ЦЬОГО проводять трьохкратну відмивку планшет твін-фосфатним буферним розчином (ТФБР) Для блокування неспецифічних місць зв'язування в лунки вносять по ЮОмкл 0,5%-ного розчину сироватки коня приготовленого на ФБР і інкубують 2 години в термостаті при температурі 37°С, після чого розчин видаляють і трикратно відмивають лунки планшету ТФБР У лунки планшету вносять по ЮОмкл ТФБР У першу лунку ряду А вносять ЮОмкл специфічної до вірусу діареї ВРХ сироватки крові, у першу лунку ряду В вносять ЮОмкл сироватки негативної, а в перші лунки рядів С, D, Е, F, G і Н - по ЮОмкл СО (О (О 61763 досліджуваних сироваток крові і шляхом подвійних розведень розтитровують усі проби, ретельно перемішуючи їх Після ЦЬОГО накривають і шкубують 2-3 години при температурі 37°С Після інкубації вміст лунок зливають і знову відмивають від компонентів, що не зв'язались, ТФБР В усі лунки вносять по ЮОмкл антивидового іммунопероксидазного кон'югату, шкубують 1 годину при температурі 37°С, вміст лунок зливають і 4-5 разів відмивають ТФБР Для виявлення продукту пероксидазної реакції вносять по ЮОмкл субстрату ABTS, шкубують 4060 хвилин при кімнатній температурі в темряві Ферментативну реакцію зупиняють додаванням по 50мкл 1.25М розчину сірчаної кислоти Приклад 1 Для приготування антигену вихідну вірусвміщуючу культуральну рідину піддавали одноразовому заморожуванню - відтаванню Після цього вірусну суспензію освітлювали низькошвидкісним центрифугуванням (3000об/хв) протягом 20-30 хвилин Супернатант збирали Попередньо очищену від клітинного детриту низькошвидкісним центрифугуванням суспензію піддавали концентруванню вірусу за допомогою 6-8% ПЕГ-6000 або ультрафільтрації В суспензію вірусу додавали при постійному перемішуванні 50% розчин ПЕГ до кінцевої концентрації 6-8% за сухою речовиною Суміш витримували протягом 16-18 годин при температурі 4°С Осад відокремлювали центрифугуванням при 5000об/хв протягом 30-40 хвилин і ресуспендували в мінімальному обов'язково визначеному об'ємі розчину Хенкса (рН 7,27,4) або суспензію вірусу пропускали через мем Комп'ютерна верстка А Крулевський брани УАМ-300А на установці УФМ-3 Сконцентрований на мембрані вірус знімали змиванням мінімальним обов'язково визначеним об'ємом розчину Хенкса Сконцентрований таким чином вірус діареї осаджували в градієнті ЩІЛЬНОСТІ сахарози на ультрацентрифузі при 70000д протягом 5-6 годин Виявлену за допомогою автоматичного колектору марковану фракцію, після визначення КІЛЬКОСТІ загального білку, використовували як препарат антигену ВД ВРХ Приклад 2 Для встановлення інтенсивності фарбування продуктів ферментативної реакції визначали їх оптичну величину (ОП) за допомогою спектрофотометру при довжині хвилі 492нм з подальшим обчисленням оптичної величини (ОВ) по формулі ОП досліджуваного зразку ОВ — ОП контрольного зразку Реакцію вважають позитивною, якщо показник оптичної величини більше чи дорівнює 2 Наприклад, при визначенні антитіл до вірусу діареї в сироватках крові ВРХ оптична ЩІЛЬНІСТЬ досліджуваного зразку дорівнювала 0,648, а оптична ЩІЛЬНІСТЬ контрольного зразку, тобто сироватки крові, що не містить антитіла до вірусу діареї, дорівнювала 0,262 Поділяли 0,648 на 0,262 і отримали показник ОВ рівний 2,47 Спосіб імуноферментного визначення антитіл до вірусу діареї великої рогатої худоби є ефективним, чутливим та дає змогу відтворення тестів визначення антитіл до вирусу діареї в ІФА Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119