Спосіб діагностики атопічного дерматиту у дітей

Корисна модель відноситься до медицини, а саме до педіатрії і може бути використана для діагностики атонічного дерматиту (АД) у дітей. Діагноз АД у переважній більшості країн виставляється при клінічному обстеженні хворого на підставі алгоритму, створеного на основі критеріїв діагностики Hanifin, Rajka (1980). Виділяють обов'язкові та додаткові діагностичні критерії. До обов'язкових критеріїв відносять: сверблячку при наявності навіть мінімальних змін на шкірі; типову морфологію і локалізацію; індивідуальну або сімейну історію атонічного захворювання; хронічний рецидивуючий перебіг хвороби. Додаткові критерії: початок захворювання в дитячому віці; гіперлініарність долонь і підошов; pityriasis alba (білісоваті плями на шкірі обличчя, плечового поясу; фолікулярний гіперкератоз; злущення, ксероз, іхтіоз; неспецифічні дерматити рук і ніг; часті інфекційні ураження шкіри (стафілококової, грибкової, герпетичної етіології); білий дермографізм; сверблячка при підвищеному потовиділенні; складки на передній поверхні шиї; темні кола навколо очей («алергійне сяйво»); складки Ден'є-Моргана; тріщини за вухами; хейліт; екзема сосків; кератоконус; передня субкапсулярна катаракта. При наявності трьох обов'язкових та будьяких трьох і більше додаткових критеріїв можна встановити діагноз АД. [Городенко Н.Г., Ласиця О.І., Калюжна Л.Д., Осипова Л.С. Методологічні підходи у вирішенні проблеми атопічного дерматиту на сучасному етапі //Астма та алергія. - 2002. - №1. - С.54-58]. Також існують параклінічні методи діагностики АД - зокрема, клінічний аналіз крові (еозинофілія), імунологічні тести in vitro - визначення загальних та специфічних IgE та IgG4 реакціями пасивної гемаглютинації (РПГА), зв'язання комплементу (РЗК), преципітації (РП), радіоімуносорбентним тестом (ПРІСТ), методом імуноферментного аналізу (ІФА), радіоалергосорбентним тестом (PACT), хемілюмінесцентним алергосорбентним тестом та деякими іншими. Вірогідність цих методів невисока - від 40% до 70% хБалаболкин И.И., Гребенюк В.Н. Атопический дерматит у детей. - М.: Медицина, 1999. - 240с.ї. Загальновизнано, що найбільш достовірні і суттєві зміни відмічені при захворюванні в «органі-мішені» - так, при бронхіальній астмі досліджують перш за все мокротиння, рідину бронхоальвеолярного лаважу, біоптати слизової оболонки; при алергійному риніті патогномонічним являється визначення еозинофілів у слизу з носу. При АД також найбільш достовірні зміни відмічені при дослідженні вогнищ уражень на шкірі - розроблена методика визначення еозинофілії в морфологічних елементах висипки і доведено, що при екземі еозинофілія ураженої ділянки шкіри становить 7%, здорової шкіри - 2,7%; при нейродерміті - 7% та 4,1% відповідно. «Місцева еозинофілія» вірогідно відрізняється від системної еозинофілії крові [Гольдштейн Л.М., Ткач В.Е. Методы и методики обследования больных кожними и венерическими заболеваниями - К., «Здоров'я», 1987. - 112с.]. 3 другого боку, доведено, що зміни в шкірі при АД - не вторинні (як вважали раніше), а первинні - саме у шкірі та SALT (skin associated lymphoid tissue) відбувається захват алергену, його процесінг, презентування та синтез антитіл з формуванням імунної відповіді. Імунопатологічний процес у шкірі кількісно та якісно відрізняється від змін системного імунітету. Переконливо доведена провідна роль шкіри та місцевої імунної реакції у формуванні алергії - після перев'язки аферентних лімфоїдних судин від шкіри до місцевого лімфатичного вузла імунна відповідь на алергени на шкірі не розвивалась [Jacques Banchereau, Ralph М. Steinman Dendritic cells and the control of immunity// Nature - 1998 - N392. - P.245-252.]. Роботами провідних лабораторій визначені головні імунокомпетентні клітини, що формують патологічний процес в шкірі при АД - це CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD20. У типових випадках діагностика атонічного дерматиту не викликає ускладнень і проводиться згідно наведеному алгоритму. Але при нетиповому перебігу атонічного дерматиту, при тривалому лікуванні, при застосуванні сильнодіючих препаратів (топікальних стероїдів), при наявності ускладнень встановити діагноз атонічного дерматиту стає можливим тільки шляхом імуноморфологічного дослідження біоптатів шкіри. Відомий спосіб діагностики АД шляхом визначення імунокомпетентних клітин CD8 та CD4, що підсилюють продукцію IgE В-лімфоцитами і збільшують термін життя еозинофілів. Також доведена істотна роль CD45RO рецептора Т-лімфоцитів (це - skin homing receptor, the cutaneous lymphocyte-associated Ag), що у відповідь на стимуляцію суперантигеном взаємодіє з E-selectin (CD62E), що експресований на посткапілярних поверхневих венулах шкіри, обумовлюючи запальну реакцію. Визначались Т-лімфоцити, отримані з вогнищ ураження при атонічному дерматиті методом біопсії, а також лімфоцити периферійної крові. [Akdis М, Simon HU, Weigl L, Kreyden 0, Blaser К, Akdis CA. Skin homing (cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive) CD8+ Т cells respond to superantigen and contribute to eosinophilia and IgE production in atopic dermatitis//J Immunol 1999 Jul 1;163(1):46675)]. Відомий також спосіб діагностики атопічного дерматиту шляхом визначення кількісних значень CD3+, CD4+, CD5+, CD8+, CD16+, CD20+, CD22+, CD38+, HLA-Dr, IgE і С-3 фракції комплементу в мікробіоптатах шкіри, отриманих шляхом обережної пункційної біопсії голкою UNICUT фірми "C.R.BARD,INK" (США) з діаметром 1,6мм. з вогнищ ураження шкіри у дітей. [Клименко В.А., Кожем'яка A.I., Сорокіна І.В. Деклараційний патент на винахід Спосіб діагностики форм атопічного дерматиту у дітей. UA 70021 A- 7Go 1 N33/00 - 15.09.2004. - Бюл. №9.] Даний спосіб визначення атопічного дерматиту є найбільш ефективним, бо визначає головні імунокомпетентні клітини, що мають значення в патогенезі хвороби. Перевагою метода також є вивчення морфології клітин, що отримані безпосередньо з вогнищ ураження шкіри. Цей спосіб є найбільш близьким до корисної моделі, що заявляється по суті та результату, який може бути досягнутим, та обраний як найближчий аналог. Основні недоліки відомих способів діагностики атонічного дерматиту (у тому числі і прототипу) полягають у тому, що імунокомпетентні клітини отримані методом біопсії, що є травматичним, залишає на шкірі косметичні дефекти, потребує анестезії, призводить до емоційного стресу дитини. Тому метод імуноморфологічного дослідження біоптатів шкіри (не дивлячись на його високу достовірність) не знайшов широкого розповсюдження в педіатрії при АД. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі покладено задачу зменшення травматичності і болючості методу, зменшення економічних витрат при збереженні високої вірогідності результатів. Задача, яку покладено в основу корисної моделі, вирішується тим, що у відомому способі діагностики атонічного дерматиту, що включає визначення імунокомпетентних клітин CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD16+, С020+лімфоцитів та їх кількісних значень в вогнищах ураження шкіри, згідно з корисною моделлю, їх визначають в мазках-відбитках шкіри. Спосіб виконують наступним чином: «Мазки - відбитки» отримують методом «шкірного вікна» у модифікації A.I. Щуренкової - після скарифікації ланцетом шкіри у місці ураження АД накладають предметні стекла, що оброблені спиртом [Л.М. Заклякова Клиническая оценка дермограммы по Rebuck у больных ревматизмом средней степени активности //Вопросы ревматизма. - 1971. - №2. - С.75-78]. Для ідентифікації імунокомпетентних клітин використовують метод імунопероксидазного фарбування. Предметні стекла висушують при кімнатній температурі. Фіксацію клітин на предметному склі проводять 96° спиртом. На мазки-відбитки наносять первинні моноклональні антитіла (немічені мишачі CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD20) на 30хв., потім стекла промивають 3 рази в забуференому фізіологічному розчині (ЗФР). Наступним етапом є інкубація мазків-відбитків із кролячою сироваткою проти імуноглобулінів миші протягом 1 години, після чого стекла з мазками-відбитками відмивають 3 рази ЗФР і проводять інкубацію з ПАП-комплексом протягом 45хв. ПАП-комплекс, що зв'язався, відмивають й проводять реакцію цитохімічного виявлення активності пероксидази. Всі інкубаційні цикли, що передбачені в імуногістохімічній реакції, проводять у вологій камері при кімнатній температурі. Клітини, що експресують антиген, мають обрамлення коричневого кольору по краю цитоплазми. Підрахунок імунокомпетентних клітин проводять на світловому мікроскопі на 100 лімфоцитів. Встановлено кількість головних імунокомпетентних клітин при атонічному дерматиті: CD3=71,35±5,98; CD4=44,4±6,11; CD8=27,65±6,17; CD14=10,05±3,49; CD16=17,75±3,08; CD20=16,65±2,37 Позитивний ефект корисної моделі обумовлений тим, що: - розроблено малотравматичну методику для вивчення місцевих імуноморфологічних змін при АД; - впровадження корисної моделі надасть значний економічний ефект - для отримання біоптату методом пункційної біопсії потрібна спеціальна голка UNICUT фірми "C.R.BARD.INK" (вітчизняного аналога не існує); ціна однієї голки - 17у.о., а для одержання зразка шкіри методом «шкірного вікна» потрібен лише скарифікатор, ціна якого складає 0,2грн. Ефективність і практичну значущість способу ілюструє наступний приклад його клінічного використання: Хвора Л., 8 років, була госпіталізована в алергологічне відділення з приводу загострення АД. З анамнезу відомо, що дівчинка з грудного віку страждає тяжкою формою АД, що характеризується безпереривнорецидивуючим перебігомта резистентністю до терапії. Показанням до госпіталізації було вирішення питання про встановлення інвалідності. Згідно приказу №482 від 4.12.2001 року „Про затвердження порядку видачі медичного висновку про дитину-інваліда віком до 16 років" біопсія є обов'язковим методом дослідження для підтвердження діагнозу при встановленні інвалідності. Лікарем виконано пункційну біопсію шкіри з вогнища ураження та біоптат відправлено на імуноморфологічне дослідження. З іншого вогнища ураження шкіри було одержано 6 мазків - відбитків методом «шкірного вікна». Отримані результати підтвердили діагноз АД та виявили порушення місцевої імунної відповіді. В біоптаті було визначено відносну кількість основних клонів імунних кліток у лімфо-плазмоцитарно-макрофагальних інфільтратах шкіри хворих (у полі зору х 400, у перерахуванні на 100 клітин): CD3=57; CD4=46; CD8=11; відношення CD4:CD8=4,2; CD14=11; CD16=14; CD20=16. При імунологічному дослідженні мазків - відбитків встановлено кількість CD3=59; CD4=44; CD8=11; відношення CD4:CD8=4,0; CD14=12; CD16=16; CD20=15. Визначено, що кількість імунних клітин в біоптатах та мазках відбитках вірогідно не відрізняється, але на шкірі після проведення біопсії було відмічено набряк, гіперемія, що залишались протягом 2 днів, рана заживала протягом 1 тижня, відмічені суб'єктивні скарги на місцеві біль та свербіж. На місці проведення мазків - відбитків методом «шкірного вікна» місцеву гіперемію відмічено протягом 1 доби, епітелізація шкірного вікна відбувалась швидше в 2 рази (за 3 доби) без косметичного дефекту, і суб'єктивно хвора відмічала менш виражені біль та свербіж. Таким чином, запропонована методика за достовірністю порівнюється з імуноморфологічним дослідженням біоптату, але більш проста у виконанні, менш болюча і травматична, не потребує складного і дорогого інструментарію, значно дешевша.