Спосіб діагностики форм атопічного дерматиту у дітей

Винахід відноситься до медицини, а саме до педіатрії і може бути використаним для визначення форм атопічного дерматиту у дітей. Атопічний дерматит - захворювання шкіри, яке спостерігається у осіб зі спадковою схильністю до атонії і характеризується типовими морфологічними змінами з певним розташуванням вогнищ ураження та свербінням шкірних покровів різної інтенсивності (Балаболкин И.И., Гребенюк В.Н. Атонический дерматит у детей. - М.: Медицина, 1999.-240с.). За характером клініко-морфологічних змін відрізняють ексудативну, ерітемато-сквамозну, ерітематосквамозну з ліхенізацією, ліхеноїдну та прурігінозну форми атопічного дерматиту (Ласиця 0.І. Основні положення щодо діагностики і лікування атопічного дерматиту: Матеріали до консенсусу "Діагностики і лікування атопічного дерматиту" - К.:2000.-10с.). Різні форми атопічного дерматиту характеризують не тільки морфологічні зміни у шкірі, але і динаміку, прогресування хвороби - як правило, одна форма переходить в другу. Перші прояви атопічного дерматиту у більшості дітей виникають на 3-4 місяці життя і характеризуються еритематозними елементами, везикулами, мокнуттям - ексудативна форма. Поступово ексудація стає менш вираженою і переважають процеси інфільтрації та лихенізації, що характерно для ерітемато-сквамозної та ерітемато-сквамозної з ліхенізацією форм атопічного дерматиту. При прогресуванні атопічного дерматиту патологічні зміни набувають хронічний необоротний характер - формується ліхеноїдна форма хвороби (Атопический дерматит у детей: диагностика, лечение и профилактика. Научно-практическая программа Союза педиатров России. Руководитель программы Баранов А.А. - Москва, 2000.-76с.). У типових випадках діагностика різних форм атопічного дерматиту не викликає ускладнень і проводиться при огляді шкіри хворого. Але при нетиповому перебігу атопічного дерматиту, при тривалому лікуванні, при застосуванні сильнодіючих препаратів (топікальних стероїдів) встановити форму атопічного дерматиту, користуючись лиш даними огляду шкіри, стає неможливим. Особливе значення встановлення форми атопічного дерматиту має у ранньому віці, коли важко визначитись у прогнозі - будуть шкірні прояви швидкоминучими (що характерно для ексудативної форми) або вони започатковують хронічний рецидивуючий перебіг алергодерматоза (ерітемато-сквамозна, ерітемато-сквамозна з ліхенізацією форми). Встановити форму атопічного дерматиту у цих випадках стає можливим тільки шляхом застосування імуноморфологічного дослідження шкіри. Так, наприклад, відомо, що в біоптатах шкіри при гострому та хронічному перебігу атопічного дерматиту абсолютна кількість дендритних клітин не змінена у порівнянні із здоровою шкірою - вони представлені гетерогенним пулом, характеризуються експресією маркера CD1a (prototypic dendritic cell marker) та диференціюються при наявності макрофагів. Кількість макрофагів підвищена (як при гострому, так і при хронічному запаленні), вони експресують класичний маркер CD68, але в ураженій шкірі мають фенотипічні відмінності - mannose-рецептор. (Kiekens RC, Thepen T, Costing AJ et al. Heterogeneity within tissue-specific macrophage and dendritic cell populations during cutaneous inflammation in atopic dermatitis.//Br J Dermatol 2001 Dec; 145(6): 957-65.) Встановлено, що імуноморфологічні зміни при атопічному дерматиту якісно та кількісно відрізняються від порушень системного імунітету, що виявляються при дослідженні крові. In vitro досліджували Т-клітинну відповідь лімфоцитів, отриманих з крові та біоптатів шкіри. У хворих при загостренні атопічного дерматиту виявлений більш високий рівень в крові Т-лімфоцитів, що експресують cutaneous lymphocyte antigen у порівнянні з ареактивними пацієнтами. Фенотипічні відмінності Т-лімфоцитів виявлені при біопсії шкіри: 25% Т-лімфоцитів експресували рецептор Vbeta. Також в біоптатах шкіри встановлена підвищена кількість специфічних Т-клітин (birch pollenspecific T-cell). (Reekers R, Busche M, Wittmann M. et al. Birch pollen-related foods trigger atopic dermatitis in patients with specific cutaneous T-cell responses to birch pollen antigens./Л Allergy Cline Immunol 1999 Aug; 104(2 Pt 1):46672.) При атопічному дерматиті вивчали також в біоптатах шкіри хворих CD4+, CD23+, IgG, С-3. Виявлена збільшена кількість СD4+лімфоцитів у всіх шарах дерми, зменшення СD23+лімфоцитів і місцями - депозити у дермі, що містять С-3 і IgG. (Kato Y, Miyano M, Tokuda Y, Koga M. Late phase reaction in atopic dermatitisimmunological parameters and immunohistological analysis. // Arerugi. 1997May;46(5):410-19.) Атопічний дерматит виявляли також шляхом визначення CD45RO+, CD4+ і CD8+ в крові і біоптатах шкіри. Доведено збільшення CD45RO+, CD4+ і CD8+кліток у крові та шкірі хворих, підвищена продукція ІЛ-5, ІЛ-13 та IgE. (Akdis M, Simon HU, Weigl L. et al. Skin homing (cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive) CD8+ Т cells respond to superantigen and contribute to eosinophilia and IgE production in atopic dermatitis.// J Immunol 1999 Jul 1;163(1):466-75). Даний спосіб визначення атопічного дерматиту є найбільш ефективним, бо визначає головні імунокомпетентні клітини, що мають значення в патогенезі хвороби. Цей спосіб є найбільш близьким до того, що заявляється по суті та результату, який може бути досягнутим, тому його обрано у якості прототипу. Основні недоліки відомих способів діагностики атопічного дерматиту (у тому числі і прототипу) полягають у тому, що не визначено залежності імуноморфологічних змін від форми хвороби, крім того точність відомих способів недостатня - імуноморфологічні порушення характеризуються тенденціями, а не кількісними значеннями, що ускладнює оцінку результатів, робить неможливим їх стандартизацію та об'єктивізацію. У зв'язку з вищевикладеним, в основу винаходу покладено задачу підвищення точності діагностики атопічного дерматиту у дітей шляхом визначення його форм. Задача, яку покладено в основу винаходу, вирішується тим, що у відомому способі діагностики атопічного дерматиту, що включає визначення CD4+, CD8+ ,CD45RO+ Т-лімфоцитів, ІЛ-4, ІЛ-13, згідно з винаходом, додатково визначають: CD3+, CD5+, CD16+, CD20+, CD22+, CD38+, HLA-Dr, IgE, C-3 фракцію комплементу і якщо кількість CD4=46,0±6,0; CD8=23,0±4,0; відношення CD4:CD8=2,0±0,4; CD16=8,0±0,5; HLA-DR=0,5±0,05; плазматичні клітини IgE=0,2±0,02; C-3 фракція комплементу=0,3±0,04 - діагностують ексудативну форму атопічного дерматиту; коли кількість CD4=47,0±5,5; CD8=16,0±3,5; відношення CD4:CD8=2,9±0,5; CD16=5,0±0,6; HLA-DR=0,9±0,09; плазматичні клітини IgE=0,3±0,06; C-3-фракція комплементу=0,5±0,08 - діагностують ерітематоосквамозну форму атопічного дерматиту; а якщо кількість CD4=48,0±6,0; CD8=13,0±2,0; відношення CD4:CD8=3,6±0,5; CD16=4,0±1,0; HLA-DR=1,8±0,3; плазматичні клітини IgE=0,9±0,08; C-3-фракція комплементу=1,5±0,6 - діагностують ліхеноїдну форму атопічного дерматиту. Спосіб виконують наступним чином: Шматочки шкіри фіксують в 10% нейтральному формаліні, заливають в целоідін-парафін, після спиртової проводки виготовляють зрізи, товщиною 5-6мкм. Зрізи фарбують гістологічними методами: гематоксиліном і еозіном, пікрофуксіном по Ван-Гізону, по Малорі; гістохімічними - мукополісахаріди ідентифікують PAS-реакцією з контролем амілазою, плазматичне просочування виявляють реакцією Рего, РНП визначають реакцією Браше (контроль кристалічною рібонуклеазою), а ДНП - реакцією Фельгена-Россенбека (контроль - гідроз з НС1) (Р.Лилли,1969). Имуноморфологічне дослідження проводять на парафінових зрізах, товщиною 5-6 мкм непрямим методом Кунса за методикою Bromine (1979). Імунні клітини диференціюють за допомогою моноклональних антитіл (МКА) до різних типів клітин фірми Novocastra Laboratories Ltd. Використовують антитіла CD3, CD4, CD5, CD8 , CD 16, CD20, CD22, CD3 8, HLA-Dr, IgE та С-3 фракції комплементу. У якості люмінісцентної мітки використовують F(ab)-2 - фрагменти кролячих антитіл проти імуноглобулінів миші, мічених ФІТЦ. При трактуванні результатів дослідження з моноклональними антитілами користуються рекомендаціями 6-ої Міжнародної конференції по диференційовочним антигенам лейкоцитів людини (Кобе, Японія, 1996). Препарати вивчають в люмінесцентному мікроскопі МЛ-2 з використанням світлофільтрів: ФС-1-2, СЗС-24, БС-8-2, УФС-6-3. При ексудативній формі атопічного дерматиту в епідермісі відзначають великі неправильної форми отростчаті клітини Лангерганса. Імуногістохімічним методом виявлена експресія С-3 фракції комплементу, IgE, HLA-Dr антиген. Серед епітеліоцитів виявляють одиничні CD4-лімфоцити, тоді як CD8 не виявляють. HLA-Dr антиген визначався частіше (у контролю в 1/6 випадків, тоді як у цій групі в 1\3 усіх спостережень). Базальна мембрана епідермісу хвилеподібна, нерівномірної товщини - місцями потоншена і навіть відсутня, місцями стовщена унаслідок відкладення на ній імунних комплексів, що містять IgE і С-3 фракцію комплементу. У верхніх відділах дерми, переважно периваскулярно, виявляють незначні запальні інфільтрати з перевагою CD4. Периваскулярно має місце незначна лімфо-плазмоцитарно-макрофагальна інфільтрація з домішкою еозинофілів. У складі інфільтрації відзначають як Т, так і В-лімфоцити, а саме CD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD20, CD22, CD38, а також одиничні клітини з HLA-Dr антигеном. Переважає популяція CD4- Т-лімфоцитів. Серед плазмоцитів виявляють клітини - продуценти IgE. Було визначено відносну кількість основних клонів імунних кліток у лімфомакрофагальних інфільтратах шкіри хворих (у полі зору х 400, у перерахуванні на 100 клітин): CD4=46,0±6,0; CD8=23,0±4,0; відношення CD4:CD8=2,0±0,4; CD16=8,0±0,5; HLA-DR=0,5±0,05; плазматичні клітини IgE=0,2±0,02; C-3 фракція комплементу=0,3±0,04. При ерітемато-сквамозній формі, також як і в попередній групі, серед кліток епідермісу відзначають клітини Лангерганса, а також CD4 -лімфоцити; у виді одиничних екземплярів відзначалися CD8- лімфоцити. На поверхні кліток Лангерганса виявляють рецептори до Ig Е і C-3 фракції комплементу. У порівнянні з попередньою групою, сила експресії цих імуноглобулінів не змінюється, тоді як експресія HLA-Dr була посилена і виявлялася в 2\3 спостережень цієї групи. На базальній мембрані очагово відзначається відкладення імунних комплексів, що містять IgE і C-3 фракцію комплементу. У дермі виявляють колагенові волокна з явищами фібриноїдного набрякання й очагово фібриноїдного некрозу. Сполучно-тканні елементи строми представлені фібробластами, фіброцитами, макрофагами, при цьому помітно збідніння дерми макрофагами (CD16). Так якщо в групі контролю нараховується до 5 кліток у полі зору 400, то в цій групі спостереження - 1-2 клітки. У порівнянні з попередньою групою периваскулярно визначають більш виражену лімфо-плазмоцитарно-макрофагальна інфільтрацію з домішкою еозинофілів. У її складі переважають CD4- Т-лімфоцити. Крім того, виявляють одиничні CD3, CD5, CD8, CD16, CD20, CD22, CD3 8, а також одиничні клітини з HLA-Dr антигеном. Серед плазмоцитів виявляють одиничні клітини - продуценти IgE. Було визначено відносну кількість основних клонів імунних кліток у лімфоплазмоцитарно-макрофагальних інфільтратах шкіри хворих (у полі зору х 400, у перерахуванні на 100 клітин): CD4=47,0±5,5; CD8=16,0±3,5; відношення CD4:CD8=2,9±0,5; CD16=5,0±0,6; HLA-DR=0,9±0,09; плазматичні клітини IgE=0,3±0,06; C-3-фракція комплементу =0,5 ±0,08. При ліхеноїдної формі атопічного дерматиту як і в попередніх групах, серед кліток епідермісу відзначають великі клітки Лангерганса, що експресують IgE, C-3 фракцію комплементу і HLA-Dr. Експресія HLA-Dr антигену відзначається в 2\3 випадків цієї групи. Зрідка серед епітеліоцитів відзначаються СD8-лімфоцити, частіше СD4лімфоцити. Базальна мембрана епідермісу нерівномірної товщини, стовщена унаслідок відкладення на ній імунних комплексів, що містять Ig Е і С-3 фракцію комплементу. У колагенових волокнах дерми виявляють явища мукоідного, фібриноідного набрякання і фібриноідного некрозу. Рясна лімфо-плазмоцитарно-макрофагальная інфільтрація з домішкою еозинофілів виявляється переважно в периваскулярних просторах дерми. У складі інфільтрації відзначають як Т, так і В-лімфоцити, а саме CD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD20, CD22, CD38, а також одиничні клітки з HLA-Dr антигеном. Переважає популяції CD4-лімфоцитів. Серед плазмоцитів виявляють одиничні клітини - продуценти IgE. Було визначено відносну кількість основних клонів імунних кліток у лімфоплазмоцитарно-макрофагальних інфільтратах шкіри хворих (у полі зору х 400, у перерахуванні на 100 клітин): CD4=48,0±6,0; CD8=13,0±2,0; відношення CD4:CD8=3,6±0,5; CD16=4,0±1,0; HLA-DR=1,8±0,3; плазматичні клітини IgE=0,9±0,08; С-3-фракція комплементу=1,5±0,6. Кількісні та якісні характеристики форм атопічного дерматиту у дітей встановлені експериментальне на достатній кількості клінічного матеріалу та узагальнені у таблиці 1. Таблиця 1 Відносна кількість основних клонів імунних клітин у лімфо-макрофагальних інфільтратах шкіри хворих у полі зору х 400 ( у перерахуванні на 100 клітин) Групи спостереження CD4 CD8 Відношення CD16 HLA-DR Плазматичні С-3 Ексудативна форма Еритемато-сквамозна форма Ліхеноідна форма 46,0±6,0 23,0±4,0 CD4:CD8 2,0±0,4 8,0±0,5 0,5±0,05 клітини IgE 0,2±0,02 0,3±0,04 47,0±5,5 16,0±3,5* 2,9±0,5 5,0±0,6* 0,9±0,09* 0,3±0,06* 0,5±0,08* 48,0±6,0 13,0±2,0* 3,6±0,5* 4,0±1,0* 1,8±0,3* 0,9±0,08* 1,5±0,6* *Р