Мас-спектрометричний спосіб діагностування хвороби марека у курей

Спосіб діагностування хвороби Марека у сільськогосподарської птиці, який відрізняється тим, що шля хом м’якоіонізаційної часопролітної плазмово-десорбційної мас-спектрометрії визначають піки квазімолекулярних іонів (КМІ) холестеролу (ХЛС) та фосфатидилхоліну (ФХ) у зразках ліпідної фракції крові птиці, вираховують співвідношення висот зазначених піків і при його значенні менше за 0,95 діагностують хворобу Марека, більше за 1,55 - відсутність хвороби, значення від 0,95 до 1,55 вказує на вірогідність наявності захворювання. (19) (21) 2003076566 (22) 14.07.2003 (24) 26.11.2007 (72) БОРДУНОВА ОЛЬГА ГЕОРГІЇВНА, UA, ЧІВАНОВ ВАДИ М ДМИТРОВИЧ, U A, БОНДАРЧУК ЛАРИСА ВОЛОДИМИРІВН А, U A, СЕМЬОНОВ ДМИТРО МИХАЙЛОВИЧ, UA (73) СУМСЬКИЙ НАЦІОН АЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA (56) UA A 43486 17.12.2001 SU A1 1791454 30.01.1993. Куцак Р.С. Оценка эффективности вакцинопрофилактики цыплят против болезни Марека по данным сероконтроля // Ма т. міжнар. наук. - практ. конф.: "Розвиток ветеринарної науки 3 80939 птаха зазначеної хвороби, що значно здешевшує та прискорює процедуру аналізу. Поставлена задача досягається тим, що у пропонуємому способі використовується м’якоіонізаційна часо-прольотна плазмоводесорбційна мас-спектрометрія (біохімічний масспектрометр «МСБХ», ВАТ SEL MI, С уми, Україна), яка дозволяє з великою чутливістю визначати термолабільні нелетючі органічні речовини, зокрема ліпіди тваринного та рослинного походження [«Mac-спектрометричний спосіб прогнозування ефективності фунгіцидів щодо хвороб картоплі», авторське свідоцтво 7А01С21/00, №2000063550 від 20.06.2000p.]. Спосіб полягає в мас-спектрометричному дослідженні висушених на металевій підкладинці хлороформних екстрактів із зразків крові сільськогосподарських птахів. На кресленні зображено мас-спектр ліпідної складової крові птиці, де ФХ - фосфорилхолін, ХЛС - фрагмент холестеролу. Аналіз зразків крові проводили на часопрольотному плазмово-десорбційному масспектрометрі МСБХ з іонізацією уламками поділу 252 -Cf. Прискорююча напруга +15 kV; обсяг накопичуємих даних (стартів) 50000; 1нс/канал. Довжина труби 15см. Зняття спектрів проводили в режимі віднімання постійного та гладкого фонів. Кров у птахів брали зранку до годування із вени крила в кількості 200-400мкл. Зразки ліпідної фракції з крові птахів го тували шля хом нанесення мікрошприцем на поверхню зразконесучого позолоченого диску приладу по 10мкл хлороформно-метанольних екстрактів із крові птахів з наступним висушуванням в термостаті за температури +20°С в атмосфері азоту (діаметр плями зразку на диску 4,5-5мм). Екстрагування ліпідної фракції в хлороформ-метанол проводили в пробірках "Епендорф" за стандартною методикою [Folch J. et al., 1957], з модифікаціями (40мкл суміші хлороформ-метанол (9:1, об'єм/об'єм); рН3,5 (СН3СООН) додавали до 40мкл негемолізованої крові і витримували при 37°С протягом 2г). Піки квазимолекулярних іонів (КМІ) ліпідів в мас-спектрах вважали придатними для вірогідної ідентифікації цих речовин за умов, якщо співвідношення "сигнал : шум" дорівнювало (або перевищувало) 3:1. В отриманих мас-спектрах за показниками молекулярних мас (вісь абсцис) ідентифікували KМІ, що відповідають інгредієнту у фосфа тидилхолінів - фосфорилхоліну (ФХ) та фрагменту холестеролу [Μ-18]+ (ХЛС) з молекулярними масами 184,0±2,0а.о.м. та 367±2,0а.о.м. відповідно (креслення). На вісі ординат визначали інтенсивність (J) зазначених піків у відносних одиницях: J1 та J2 для ХЛС та ФХ відповідно (креслення). Виходячи із значень інтенсивності піків, що відповідають ХЛС (J1) і ФХ (J2) вираховували співвідношення k=ХЛС (J1)/ФХ (J2) (креслення). Співвідношення k безпосередньо пов'язане із наявністю захворювання птиці на хворобу Марека: так, якщо величина к є меншою за 0,90-0,95, є всі підстави вважати, що птах 4 хворий на хворобу Марека; у випадку, якщо к більша за 1,55 - птах не уражений зазначеною патологією; значення k, що варіюють від 0,95 до 1,55 є проміжними і потребують підтвердження чи спростування додатковими методами. Досліджують птицю у 3-5 місячному віці, коли птиця в найбільшому ступеню уражується хворобою Марека, або при наявності клінічних ознак даної хвороби. Дослідження повторюють через кожні 2 тижні протягом двох місяців. Контролем слугували зразки крові, відібрані від здорової птиці того ж віку, породи або кросу, що утримувалася на такому ж раціоні. Підозрілі на хворобу Марека зразки крові піддають додатковому дослідженню, котре полягає у визначенні ступеню адсорбції білків до фосфоліпідів крові. Відомо, що спорідненість ліпідів до білків в пухлина х значно знижена [Ambrose E.J., 1962; Воллеман М., 1977]. На шар фосфоліпідів на зразконесучому диску наносять 30мкл 10% водного розчину альбуміну бичачого ("Sigma", США) (рН=6,0-6,5). Адсорбують при 37°С 240с, після чого одноразово змивають бідистильованою водою. Висушують зразок, як зазначено вище та піддають повторному дослідженню на мас-спектрометрі. Вимірюють інтенсивність піку КМІ, що відповідає холестеролові (креслення). Якщо інтенсивність зазначеного піку складає 60-65% та більше від контролю, то це свідчить на користь того, що птах, у якого був відібраний зразок крові, хворий на хворобу Марека (ступінь спорідненості білку до фосфоліпідів значно знижена). Навпаки, якщо внаслідок обробки альбуміном шару фосфоліпідів, інтенсивність піку КМІ холестерола знижується до 40% і менше, ступінь спорідненості білку до фосфоліпідів є досить великою, що притаманно здоровій птиці. Запропонований спосіб для діагностування хвороби Марека птиці за допомогою м'якоіонізаційної часо-прольотної плазмоводесорбційної мас-спектрометрії значно здешевшує та прискорює процедуру скринінг-діагностування у порівнянні з відомими методами.