Спосіб отримання дигаплоїдних рослин льону

Спосіб отримання дигаплоїдних рослин льону, що включає добір бутонів на одноядерній стадії розвитку пилкових зерен, обробку бутонів зниженою температурою, виділення, посадку та культивування пиляків на штучному поживному середовищі, пересадку утворених на пиляках калусів на поживне середовище для регенерації пагонів, укорінення утворених пагонів на поживному середовищі, обробку рослин колхіцином для подвоєння хромосомних наборів, посадку в ґрунтосуміш та дорощування рослин, який відрізняється тим, що обробку бутонів проводять упродовж 1-2 діб при температурі 6°С, після чого виділені з бутонів пиляки висаджують на середовище LMA-1 з концентрацією сахарози 8% і тіаміну 1мг/л та культивують їх у темряві спочатку 7-10 діб при 6°С, а потім при 20-25°С, причому утворений на пиляках калус культивують упродовж 20-30 діб на поживному середовищі N6 з додаванням 1мг/л бензиламінопурину (БАП), 0,05мг/л нафтилоцтової кислоти (НОК) та 0,1мг/л гіберелової кислоти (ГК) до утворення та видовження пагонів, які вкорінюють на штучному поживному середовищі та висаджують у ґрунтосуміш, де дорощують до зрілих рослин. UA (21) a200608565 (22) 31.07.2006 (24) 25.11.2008 (46) 25.11.2008, Бюл.№ 22, 2008 р. (72) СОРОКА АН АТОЛІЙ ІВАНОВИЧ, UA (73) ІНСТИТУТ ОЛІЙНИХ КУЛЬТУР УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ Н АУК, UA, СОРОКА АНАТОЛІЙ ІВАНОВИЧ, UA (56) Сорока А.И . Влияние состава среды на процессы каллусогенеза и регенерации в культуре пыльников льна. Цитология и генетика. 2004.№2 стр.20-25 SU A 1335205, 07.09.1987 SU A1 1746951, 15.07.1992 SU 679190, 15.07.1979 SU A1 1708211, 30.01.1992 RU C1 2120741, 27.10.1998 Калинин Ф.Л.і Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - Киев: Наук. думка, 1980. - 488 с. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Кунах В.А. Біотехнологія рослин - Київ: ПоліграфКонсалтинг, 2003. 520 с C2 2 (19) 1 3 84732 добір бутонів на одноядерній стадії розвитку пилкових зерен, обробку бутонів зниженою температурою, посадку пиляків на штучне поживне середовище і їх к ультивування, пересадку калусів на нове поживне середовище для регенерації пагонів, укорінення утворених пагонів на новому середовищі та посадку рослин в гр унт, однорідний матеріал льону, відповідно до винаходу, отримують проводячи обробку бутонів упродовж 1-2 діб при температурі 6°С, після чого виділені з бутонів пиляки висаджують на середовище LMA-1 з концентрацією сахарози 8% і тіаміну 1мг/л та культивують їх у темряві спочатку 7-10 діб при 6°С, а потім при 20-25°С, причому утворений на пиляках калус культивують упродовж 20-30 діб на поживному середовищі Мб з додаванням 1мг/л БАП, 0,05мг/л НОК та 0,1мг/л ГК до утворення та видовження пагонів, які вкорінюють на штучному поживному середовищі та висаджують у грунтосуміш, де дорощують до зрілих рослин. Спосіб здійснюють таким чином. Бутони збирають з рослин льону на початку цвітіння і проводять цитологічний аналіз стадії розвитку пилкових зерен. Для цього готують давлені ацетокармінові або ацетоорсеїнові препарати. В подальшу роботу беруть бутони, в яких пилкові зерна знаходяться на одноядерній стадії розвитку. Такі бутони помішують в холодильник у вологій камері при температурі 6°С і витримують протягом 1-2 діб. Така обробка в подальшому значно стимулює розвиток калусів на пиляках. Потім з бутонів асептично виділяють пиляки й висаджують на стерильне штучне поживне середовище, наприклад, в чашки Петрі. В кожну чашку Петрі діаметром 60 мм висаджують 30-40 пиляків. Середовище для культивування пиляків являє собою середовище LMA1 з додаванням сахарози в концентрації 8% та тіаміну в концентрації 1 мг/л. Пиляки в чашках Петрі культивують у темряві перші 7-10 діб при 6°С, а потім при 20-25°С. Упродовж 30-45 діб після посадки пиляки аналізують на наявність утворення калусу. Для цього, як правило, використовують бінокулярну луп у. Чашки Петрі при цьому не відкривають. Утворений на пиляках калус в стерильних умовах відділяють за допомогою скальпеля та пересаджують на агаризоване поживне середовище N5 з додаванням 1мг/л бензиламінопурину (БАП), 0,05мг/л нафтилоцтової кислоти (НОК) та 0,1мг/л гіберелової кислоти (ГК). На даному середовищі калуси культивують при фотоперіоді 16/8 годин (день/ніч) протягом 20-30 діб для утворення пагонів. Таке середовище забезпечує утворення значної кількості пагонів. Калуси для утворення пагонів можна культивувати і на середовищі без додавання ГК. Утворені на калусах пагони асептичне відділяють, відрізаючи їх скальпелем, та пере Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 4 саджують на середовище такого ж складу для їх видовження. Пагони, що видовжились не менш ніж на 10мм пересаджують для вкорінення на стерильне агаризованепоживне середовище МС [7] зі зміненою концентрацією неорганічних речовин (0,6-0,8 раз від нормальної) та концентрацією сахарози 1% з додаванням 2мг/л індолілмасляної кислоти (ІМК) чи 2мг/л індолілоцтової кислоти (ІОК) чи 2мг/л НОК. Після утворення коренів молоді рослини висаджують у легку грун тосуміш, яку бажано простерилізувати. Перед посадкою у гр унтосуміш аналізують молоді листочки чи кінчики корінців на плоїдність. З цією метою готують давлені ацетокармінові або ацетоорсеїнові препарати і підраховують кількість хромосом на стадії метафази мітозу. Рослини з гаплоїдним набором хромосом обробляють колхіцином. Для цього на верхівки висаджених пагонів наносять вату, змочену водним розчином колхіцину 0,1-0,5% на 3-5 діб або перед посадкою занурюють кореневу систему рослин в такий же розчин колхіцину на 1-2 години. Висаджені рослини витримують перші кілька діб в умовах підвищеної вологості, а в подальшому вирощують як звичайно. В кінці вегетації проводять збір насіння. Даний спосіб дозволяє отримувати однорідний лінійний матеріал льону у вигляді дигаплоїдних рослин. Джерела інформації, які прийняті до уваги при проведенні експертизи 1. Калинин Ф.Л.і Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - Киев: Наук. думка, 1980. - 488 с. 2. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Кунах В.А. Біотехнологія рослин - Київ: ПоліграфКонсалтинг, 2003. - 520 с. 3. Поляков А.В., Пролетова Н.В., 1998. Питательная среда для культивирования пыльников льна. Пат. № 2120741. Россия: Всероссийский НИИ льна. Бюл. №30, 27.10.98. 4. Nichterlein К., Friedt W. Plant regeneration from isolated microspores of linseed (Linum usitatissimum L.) // Plant Cell Rep. -1993. -12, - С. 426-430. 5. Zhizheng С., Zhenghua C. High frequency induction of pollen-derived embryoids from anther cultures of rape (Brassica napus L.) // Kexue Tongbao. - 1983. -28, №12. -С. 1690-1694. 6. Chu С.С. The Ne medium and its applications to anther culture of cereal crops // Proc. Symp. on Plant Tissue Culture, Beijing, China, 1978: - Science Press, - C. 43-50. 7. Murashige J., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. - 1962. - 15, - С. 473-497. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601