Спосіб отримання біологічно активного комплексу з насіння льону

1. Спосіб отримання біологічно активного комплексу з насіння льону, який полягає в екстракції водою подрібненого насіння льону, фільтрації, центрифугуванні, діалізі, концентрації, який відрізняється тим, що перед екстракцією насіння льону водою попередньо проводять його знежирення гексаном або етиловим ефіром 3 16992 подрібненого насіння льону, фільтрації через нейлонову тканину, центрифугуванні екстракту, діалізі, концентрації під вакуумом проводять попереднє знежирення гексаном або діетиловим ефіром подрібненого насіння льону протягом 8-12 годин і три кратну обробку 75-85%-ним етанолом протягом 30хв. при температурі 70-80°С (співвідношення твердого матеріалу і розчинника 1:20), після нагрівання дають витяжці відстоятися 10-15хв. і фільтрують через пористий скляний фільтр. Обробку спиртом проводять з метою видалення спирторозчинних моноі олігосахаридів, а також речовин фенольної природи - небажаних домішок, здатних переходити у водний екстракт. Оброблений спиртом матеріал висушують в сушильній шафі при температурі 4050°С для видалення спирту. Для видалення білкової складової знежирений і оброблений спиртом залишок піддають ферментативній обробці панкреатином (рН=8,4). Після ферментативної обробки насіння льону піддають три кратній екстракції водою при температурі екстракції 40-60°С по 15-30хв., при цьому в розчин переходять малорухливі вуглеводи - водорозчинні полісахариди. Після фільтрації через сито d=635 мкм екстракт центрифугують при частоті обертів 5000 об/хв протягом 10-20хв. Після діалізу центрифугат висушують у вакуум-ротаційному випарнику при температурі 50-60°С до вмісту вологи в матеріалі 5-10%. Заявлений спосіб виконується таким чином (Приклад 1). Насіння льону подрібнюється у лабораторному млині. 10г подрібненого насіння (узятого з точністю до 0,0001г) поміщають в паперовий пакетик з фільтрувального паперу. Пакетик з матеріалом поміщають в екстрактор апарату Сокслета. Екстракцію проводять гексаном або етиловим ефіром протягом 10 годин. Після екстракції пакетик кладуть в бюкс і видаляють розчинник в сушильній шафі при температурі 105°С.Висушений знежирений матеріал поміщають у круглодонну колбу, заливають 80%ним етиловим спиртом (20мл спирту на 1г сухої речовини) і нагрівають на водяній бані зі зворотнім холодильником при температурі 75°С протягом 30хв. Після нагрівання дають витяжці відстоятися 12хв. і фільтрують через пористий скляний фільтр. 4 Після фільтрації залишок з фільтру переносять в колбу, в якій проводилася обробка. Обробку сировини спиртом повторюють три рази. Після трьох обробок матеріалу спиртом при температурі 75°С спирторозчинні моно- і олігосахариди, а також речовини фенольної природи вилучаються повністю. Оброблений спиртом матеріал звільняють від спирту, висушуючи фільтр в сушильній шафі при температурі 45°С.Знежирений і оброблений спиртом залишок переносять в колбу на 100-200мл, додають 25мл цитратного буферу з рН=8,4, нагрітого в термостаті до температури 37°С і 25мг панкреатину, збовтують і витримують в термостаті при температурі 37°С протягом 3 год. Після інкубації матеріал фільтрують через пористий фільтр і висушують в сушильній шафі при температурі 45°С.Залишок після ферментативної обробки переносять в круглодонну колбу і екстрагують 3 рази водою зі зворотнім холодильником при температурі 50°С по 22хв. При цьому в екстракт переходять водорозчинні полісахариди. При температурі вище 60°С відбуваються зміни в будові водорозчинних полісахаридів насіння льону, за рахунок чого відбувається різке зниження їх інгібіторної активності на 15-20%, при температурі нижче 40°С - знижується вихід водорозчинних полісахаридів до 3-5% при збільшенні їх інгібіторної активності всього на 2-3%. Екстракти об'єднують і фільтрують через одне і теж нейлонове сито з діаметром отворів 635 мкм. Після фільтрації екстракт охолоджують до температури 4°С і центрифугують в лабораторній центрифузі при частоті обертів 5000 об/хв протягом 15хв. Параметри центрифугування були одержані в результаті оптимізації даного процесу, критерієм оптимізації служила інгібіторна активність екстракту. Діаліз проводять через целофан при температурі 4°С протягом 96 годин. Після діалізу екстракт висушують у вакуум-ротаційному випарнику при температурі 55°С до вмісту вологи близько 7%. Одержаний даним способом біологічно активний комплекс має наступний хімічний склад, представлений в Табл.1. Приклади 2 і 3 виконуються аналогічно прикладу 1. У прикладі 2 брали мінімальні значення заявлені у формулі корисної моделі, у прикладі 3 брали максимальні заявлені значення. Таблиця 1 Хімічний склад біологічно активного комплексу з насіння льону,% Вихід слизистих речовин,% Вологість,% Вуглеводи,% Білок,% Зола,% Найближчий аналог 7,8-8,3 5,1-5,4 84,7-86,4 4,8-5,8 3,6-4,1 Моносахаридний склад вуглеводної складової Приклад 2 6,3-6,7 6,5-7,5 90,5-89,1 0,001 3,0-3,4 Приклад 1. 9,5-9,8 6,3-7,3 90,2-89,0 0,001 3,5-3,7 представлений в Табл.2. Приклад 3 10,8-11,2 6,3-7,3 89,3-87,9 0,001 4,4-4,8 5 16992 6 Таблиця 2 Моносахаридний склад водорозчинних полісахаридів біологічно активного комплексу з насіння льону,% співвідношення Моносахариди Рамноза Фукоза Арабіноза Ксілоза Галактоза Глюкоза Галактуронова кислота Найближчий аналог 4,4-7,9 2,1-3,7 8,9-9,7 32,6-33,1 13,3-14,1 3,7-4,2 28,6-33,7 Інгібіторну активність біологічно активного комплексу відносно протеолітичних ферментів (трипсину, хімотрипсину) визначають по різниці ступеня розщеплення казеїну одним ферментом (протеолітична активність ферменту без додавання біологічно активного комплексу - ПА1) і ферментом з додаванням біологічно активного комплексу (протеолітична активність ферменту з додаванням біологічно активного комплексу при співвідношенні маси ферменту і біологічно активного комплексу 1:10 - ПА2), як еталон порівняння використовують фармацевтичний препарат контрикал: ІА=(ПА1-ПА2)*100/ПА1. Протеолітичну активність визначають модифікованим методом Ансона. Визначення проводять таким чином. В пробірку, що містить 1мл ферментного розчину (0,1-0,5мг ферменту в натрій фосфатному буфері рН=7,4), через 5хв. інкубації при 37°С додають 2мл 2%-ного розчину казеїну у тому ж буферному розчині, доводять дистильованою водою до 4мл, струшують і інкубують при 37°С протягом 20хв. (час гідролізу казеїну). Після закінчення інкубації вносять 5мл 5%-ного розчину трихлороцтової кислоти, перемішують і витримують 20хв. при 37°С.В контрольній пробі до 1мл ферментного розчину додають 5мл розчину трихлороцтової кислоти і потім 2мл розчину казеїну. Контрольну і дослідну проби центрифугують протягом 5хв. при 5000 об/хв і фільтрують через паперовий фільтр в сухі пробірки. Для визначення відбирають 1мл прозорого фільтрату, додають 5мл 0,5 н розчину Na2CО3 і 1мл робочого розчину реактиву Фоліна. Через 20хв. визначають оптичну густину на спектрофотометрі при довжині хвилі λ=670 нм. Приклад 2 5,2-5,4 2,0-2,2 10,5-12,1 26,9-28,1 13,7-16,2 4,3-5,4 33,7-37,4 Приклад 1 5,0-5,3 1,8-2,1 11,0-12,8 27,0-29,3 14,8-16,7 4,2-5,2 32,5-35,3 Приклад 3 4,8-5,6 1,9-2,3 11,3-13,6 30,2-30,8 15,6-18,5 3,8-4,7 28,3-28,6 Протеолітичну активність (ПА) виражають числом протеолітичних одиниць на 1г ферменту і розраховують по формулі: ПА=(Д*4)/(ТЭ*20*m), де Д - оптична густина дослідного розчину відносно контрольного; 4 - об'єм суміші, мл; ТЕ - тирозиновий еквівалент - оптична густина 1 мкмоля тирозину в 1 мл; 20 - час інкубації, хв; m - маса ферменту,г. Результати дослідження інгібіторної активності біологічно активних комплексів із насіння льону представлені в Табл.3. Одержаний таким чином біологічно активний комплекс відповідає поставленій задачі, а саме має інгібіторну активність відносно травних протеолітичних ферментів і може бути використаний в лікувально-профілактичному харчуванні населення України, як в самостійному вигляді, так і у складі біологічно активних добавок і харчових продуктів, для корекції патологічних станів пов'язаних з підвищеною активністю травних протеолітичних ферментів. Використана література. 1. Т.П. Гарник, Т.В. Ковальчук,р.С.Коритнюк і др. До питання ефективності водних витяжок з лікарської рослинної сировини // Фітотерапія в Україні - №1-2, 1999. - С.51-53. 2. Биологически активные добавки к пище. Полная энциклопедия / СоСт.Н.А. Натарова. СПб.: ИД «ВЕСЬ», 2001. - С.60-61. 3. Капрельянцл.В., Швец Н.А., Столярова Т. Водорастворимые полисахариды семян льна // Наукові праці ОДАХТ - вип. 24 - С.146-150. Таблиця 3 Вплив біологічно активного комплексу з насіння льону на активність трипсину і хімотрипсину порівняно з контрикалом Фермент Препарат Відношення сухих речовин препарату: фермент* найближчий аналог 2 Трипсин 1 10:1 3 контрикал найближчий аналог 2 Хімотрипсин 1 10:1 3 контрикал * - визначено дослідним шляхом і є оптимальним. Інгібіторна активність,% 24 53 51 46 98 21 48 45 43 97 Комп’ютерна верстка О. Чепелев Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601