Протитуберкульозний лікарський засіб на основі 4-тіоуреїдоімінометилпіридинію перхлорату, спосіб його одержання та спосіб лікування

Реферат: Винахід належить до галузі хіміко-фармацевтичної промисловості та стосується протитуберкульозного лікарського засобу, що містить як активну речовину 4тіоуреїдоімінометилпіридинію перхлорат в ефективній і безпечній кількості та фармацевтично прийнятні допоміжні речовини. UA 102970 C2 (12) UA 102970 C2 UA 102970 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Винахід відноситься до галузі хіміко-фармацевтичної промисловості, конкретно - до нового протитуберкульозного лікарського засобу, що містить як активну речовину 4тіоуреїдоімінометилпіридинію перхлорат у терапевтично ефективній і безпечній кількості, а також фармацевтично прийнятні допоміжні речовини. Крім того, винахід відноситься до способу одержання вищевказаного лікарського засобу (варіанти) і способу лікування всіх форм легеневого та позалегеневого туберкульозу, а також профілактиці в складі комбінованої терапії туберкульозу. Рівень техніки На сьогоднішній день гостро стоїть проблема смертності від туберкульозу (ТБ). За даними Всесвітньої організації охорони здоров'я (ВОЗ) у 2007 р. в усьому світі налічувалося 9,27 мільйона випадків захворювання на ТБ. Це є збільшенням у порівнянні з 9,24 мільйона випадків у 2006 p., 8,3 мільйона випадків у 2000 р. і 6,6 мільйона випадків у 1990 році. Більшість передбачуваних випадків у 2007 р. відбулися в Азії (55 %) та Африці (31 %), з невеликою часткою випадків у регіоні Східного Середземномор'я (6 %), Європейському регіоні (5 %) і регіоні країн Америки (3 %). П'ятьма першими країнами за загальною кількістю випадків захворювання в 2007 р. є Індія (2,0 мільйони), Китай (1,3 мільйона), Індонезія (0,53 мільйона), Нігерія (0,46 мільйона) і Південна Африка (0,46 мільйона). Згідно з оцінками, з 9,27 мільйона випадків захворювання 1,37 мільйона (15 %) були ВІЛ-позитивними; 79 % з цих ВІЛ-позитивних випадків були в Африканському регіоні і 11 % - у регіоні Південно-Східної Азії. Хоча загальна кількість випадків захворювання на ТБ в абсолютному вираженні збільшується в результаті зростання чисельності населення, кількість таких випадків на душу населення падає. Темпи цього зниження є повільними, менш ніж на 1 % на рік. Частота випадків захворювання у світі в 2004 р. досягла піку і становила 142 випадки на 100 000 чоловік. У 2007 р. ця цифра становила приблизно 139 випадків захворювання на 100 000 чоловік. Частота випадків захворювання падає в п'яти із шести регіонів ВОЗ (виключенням є Європейський регіон, в якому коефіцієнти є практично стабільними). У 2007 p. налічувалося приблизно 0,5 мільйона випадків ТБ з множинною лікарською стійкістю (ТБ-МЛС). На 27 країн (з яких 15 - у Європейському регіоні) припадає 85 % таких випадків. П'ятьма країнами з найбільшою кількістю випадків ТБ-МЛС є Індія (131 000), Китай (112 000), Російська Федерація (43 000), Південна Африка (16 000) і Бангладеш (15 000). До кінця 2008 р. 55 країн і територій повідомили принаймні про один випадок ТБ з широкою лікарською стійкістю (ТБ-ШЛС) [1]. Найбільш важливі досягнення в лікуванні хворих на ТБ пов'язані з хіміотерапією. На цей час з рівня техніки відома велика кількість протитуберкульозних засобів. Перші хіміопрепарати з'явилися наприкінці 40-х років (стрептоміцин, натрію паріаміносаліцилат, тибон). Потім були створені фтивазид, ізоніазид і нові ефективні хіміопрепарати - етіонамід, канаміцин, флориміцин, циклосерин, протіонамід. Це дозволило здійснювати вибір хіміопрепаратів, найбільш показаних для лікування конкретних хворих. Далі з'явилися дуже ефективні препарати - рифампіцин, етамбутол, мікобутин. Однак одночасно з появою нових протитуберкульозних препаратів (ПТП) розширюється розвиток стійкості мікобактерій туберкульозу (МБТ) до них. В стандартній хіміотерапії ТБ (при лікуванні всіх форм) як основні і найбільш ефективні протитуберкульозні препарати застосовуються ізоніазид (гідразид ізонікотинової кислоти (ГІНК) [2], прийнятий нами як прототип, а також рифампіцин [2,3]. Ізоніазид має високу терапевтичну ефективність, однак є високотоксичним (LD50 дорівнює 150 мг/кг), крім того при застосуванні даного препарату в курсі тривалого лікування у пацієнта, як правило, виникають розлади травлення, діяльності нирок, нервово-психічні, гематологічні, алергійні прояви та токсичні гепатити. Крім цього, основним його недоліком є швидкий розвиток лікарської стійкості мікобактерій туберкульозу. Резистентність мікобактерій туберкульозу до ізоніазиду розвивається у 70 % хворих, а 30 % пацієнтів переходять в розряд хронічних хворих. Напівсинтетичний антибіотик рифампіцин також має високу активність відносно МБТ і сильний токсичний ефект. Крім того, його основним недоліком, як і для ізоніазиду, є швидкий розвиток лікарської резистентності мікобактерій туберкульозу, що істотно знижує його ефективність. Резистентність мікобактерій туберкульозу до рифампіцину розвивається у 40-50 % хворих. При розвитку стійкості збудника до даного антибіотика його варто поєднати з іншими ПТП (стрептоміцином, ізоніазидом, етамбутолом та ін. препаратами [2]. В зв'язку з проблемою розвитку резистентності мікобактерій туберкульозу до існуючих препаратів виникає необхідність розробки нових ПТП і їхніх комбінацій. Завданням даного винаходу є розробка нового високоефективного протитуберкульозного засобу з мінімальними токсичними ефектами та стабільного в процесі зберігання. 1 UA 102970 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Суть винаходу Запропоновано новий оригінальний протитуберкульозний лікарський засіб, що як активний інгредієнт включає 4-тіоуреїдоімінометилпіридинію перхлорат в терапевтично ефективній і безпечній кількості та фармацевтично прийнятні допоміжні речовини. Одержують 4-тіоуреїдоімінометилпіридинію перхлорат способом, який раніше був розроблений авторами даного винаходу і який полягає у взаємодії 4-піридинальдегіду (в надлишку) з тіосемікарбазидом у присутності 48-55 %-ної хлорної кислоти у водно-етанольному розчині при 80-85 °C [4]. Згідно з винаходом, пропонований протитуберкульозний лікарський засіб містить активну речовину в кількості від 5,0 до 90,0 % від маси лікарської форми, а також фармацевтично прийнятні допоміжні речовини в кількості від 11,0 % до 100,0 % від маси діючої речовини. Ефективна кількість активної речовини в лікарській формі становить від 5 мг до 1000 мг. Краще, якщо протитуберкульозний лікарський засіб, що заявляється, додатково містить, принаймні ще один протитуберкульозний засіб для досягнення синергетичної дії. Лікарський засіб як додатковий протитуберкульозний лікарський засіб може містити одну з таких активних речовин, як ізоніазид, піразинамід, рифампіцин, рифабутин, амікацин, етамбутол, антибіотик групи фторхінолонів або їх комбінації. У кращому варіанті лікарський засіб може бути виготовлений у вигляді таблеток (кишковорозчинних, з модифікованим вивільненням), комбінованих таблеток, капсул, драже, гранул, покритих оболонкою, супозиторіїв, суспензій. Лікарські форми можуть бути виконані традиційним способом [5]. Засіб згідно з винаходом може вводитися звичайним чином перорально або парентерально. Дозування залежить від віку, стану та ваги пацієнта, а також від виду введення. Разом з активною речовиною лікарський засіб може при цьому містити звичайні допоміжні речовини, прийняті в технології готування лікарських засобів, такі як зв'язуючі, наповнювачі, консерванти, регулятори текучості, зм'якшувачі, змочувальні речовини, диспергатори, емульгатори, розчинники, антиокислювачі та/або пропеленти, пролонгатори дії [6]. У кращому варіанті як цільові добавки використовують сахарозу, повідон, целюлозу мікрокристалічну, кремнію діоксид колоїдний, етилцелюлозу, співполімери метакрилової кислоти та етилакрилату, триетилцитрат, макрагол, тальк, барвник заліза оксиду при наступному співвідношенні компонентів, мас. % від діючої речовини: Сахароза 3,1-50,4 Повідон 0,9-14,4 Целюлоза мікрокристалічна 1,1-18,0 Кремнію діоксид колоїдний 0,2-3,6 Етилцелюлоза 0,2-3,6. Найпоширенішими способами одержання таблеток є три технологічні схеми: з вологим гранулюванням, сухим гранулюванням і прямим пресуванням. Згідно з даним винаходом запропоновано спосіб одержання нового протитуберкульозного лікарського засобу. Найбільш близьким за технічною суттю до пропонованого об'єкта є спосіб вологого гранулювання, що включає наступні етапи: змішування інгредієнтів, зволоження, гранулювання, сушіння, опудрювання, таблетування [7]. Спосіб одержання заявленого лікарського засобу включає наступні етапи: а) окремо просіюють крізь сито порошки 4-тіоуреїдоімінометилпіридинію перхлорату, кремнію діоксиду колоїдного, кросповідону, магнію стеарата, повідону, целюлози мікрокристалічної, гіпромелози (гідроксипропілметилцелюлоза), тальку, поліетиленгліколю, пропіленгліколю, титану діоксиду, заліза оксиду жовтого; б) в реактор для готування зволожувача завантажують холодну воду очищену та повідон, перемішують протягом 30 хвилин при температурі 60 °C до одержання прозорого, однорідного, блідо-жовтого розчину; в) для одержання маси для таблетування в змішувач завантажують 4тіоуреїдоімінометилпіридинію перхлорат і целюлозу мікрокристалічну та перемішують протягом 15 хв., після закінчення перемішування заливають зволожувач, зволоження та перемішування здійснюють протягом не менше 15 хв. до рівномірного розподілу зволожувача та одержання однорідної маси; г) здійснюють вологе гранулювання маси, отриманої на стадії в); д) вологий гранулят, отриманий на стадії г), висушують протягом 20 хв. при тиску 0,2 МПа і температурі 55±2 °C до залишкової вологості 1,0-2,0 %; 2 UA 102970 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 е) здійснюють опудрювання та сухе гранулювання отриманого на стадії д) висушеного гранулята, завантажуючи його в бункер вібросита і потім завантажуючи в змішувач сухий гранулят і опудрювач (аеросил, кросповідон, магнію стеарат), уникаючи пилоутворення, перемішують напівпродукт протягом 15 хв., одержують масу для таблетування; ж) отриману на стадії е) масу таблетують на таблет-пресі; з) на таблетки-ядра наносять водну суспензію плівкової оболонки, що складається із суміші гіпромелози, заліза оксиду жовтого, макрогола, тальку, пропіленгліколю та титану діоксиду, і одержують заявлений лікарський засіб. Отримані таблетки лікарського засобу згідно з винаходом покриті оболонкою від жовтого до темно-жовтого кольору, овальної форми, двоопуклі. На зламі таблетка має колір від ясножовтого до жовтого зі слабким зеленуватим відтінком. Вихід на стадії становить 99,47 %. Таким чином, спосіб дозволяє одержати заявлений лікарський засіб з максимально можливим виходом. Також відповідно до даного винаходу запропоновано альтернативний спосіб одержання нового протитуберкульозного лікарського засобу. Найбільш близьким за технічною суттю до пропонованого об'єкта є спосіб прямого пресування, а також спосіб вологого гранулювання, що включає наступні етапи: змішування інгредієнтів, зволоження, гранулювання, обкатування та нарощування гранул, нанесення плівкового покриття та сушіння [7]. Альтернативний спосіб одержання нової протитуберкульозної композиції включає наступні етапи. Порошок 4-тіоуреїдоімінометилпіридинію перхлорату змішують з кремнію діоксидом колоїдним, мікрокристалічною целюлозою та етилцелюлозою, зволожують 3,0-5,0 % водним розчином повідону та 30,0-35,0 % цукровим сиропом, гранулюють і обкатують отримані гранули. Гранули висушують при 40-45 °C до залишкової вологості 1,5-4,5 %. Покриття на гранули-ядра наносять відомим способом з 20 % водного розчину співполімеру метакрилової кислоти та етилакрилату та суспензії пігментів тальку і барвника заліза оксиду. Також, відповідно до даного винаходу, заявляється спосіб лікування всіх форм легеневого та позалегеневого туберкульозу, а також профілактики в складі комбінованої терапії. Відповідно до способу, що заявляється, лікарський засіб згідно з даним винаходом застосовують перорально або парентерально (підшкірно, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньочеревинно), кратність прийому - 1 раз на добу; разова добова доза - 20 мг/кг (1200 мг/добу); максимальна разова доза - 30 мг/кг (1800 мг/добу). Для уповільнення розвитку стійкості мікобактерій зазначений лікарський засіб призначають разом з іншими протитуберкульозними препаратами або їхніми комбінаціями (ізоніазид, піразинамід, рифампіцин, рифабутин, амікацин, етамбутол, антибіотики групи фторхінолонів). Біологічна активність лікарського засобу згідно з винаходом МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ВИВЧЕННЯ ПРОТИТУБЕРКУЛЬОЗНОЇ АКТИВНОСТІ ЛІКАРСЬКОГО ЗАСОБУ ЗГІДНО З ВИНАХОДОМ 1. Оцінка дії in vitro (культури мікроорганізмів і методики) Використані штами мікроорганізмів: 1) лабораторні тест-штами, що входять в Mycobacterium tuberculosis complex, отримані з Федеральної Державної установи "НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича", чутливі до існуючих протитуберкульозних препаратів: - М. tuberculosis Erdman; - М. tuberculosis H37Rv; - М. tuberculosis "Academia" - M. bovis bovinus 8; 2) культури з множинною лікарською стійкістю, виділені від хворих з уперше виявленим туберкульозом (всього 14 штамів): - № 5419 СПбНИИФ, стійкість до ізоніазиду (10 мкг/мл), рифампіцину (40 мкг/мл) і стрептоміцину (50 мкг/мл); - № 2483 СПбНИИФ, стійкість до ізоніазиду (1 мкг/мл), рифампіцину (40 мкг/мл), стрептоміцину (5 і 10 мкг/мл), рифабутину (40 мкг/мл), етамбутолу (2 мкг/мл); - № 3485 і № 3589 СПбНИИФ, стійкі до ізоніазиду (1 мкг/мл), рифампіцину (20 і 50 мкг/мл), стрептоміцину (50 мкг/мл), канаміцину (30 мкг/мл), етамбутолу (2 мкг/мл); етіонаміду (30 мкг/мл); - № 3019 СПбНИИФ, стійкість до ізоніазиду (1 і 25 мкг/мл), рифампіцину (20 і 50 мкг/мл), стрептоміцину та канаміцину (30 і 50 мкг/мл відповідно), етіонаміду (30 мкг/мл); - № 3655 СПбНИИФ, стійкість до ізоніазиду (1 мкг/мл), рифампіцину (20 і 50 мкг/мл), стрептоміцину (50 мкг/мл), канаміцину та етамбутолу (30 мкг/мл); 3 UA 102970 C2 5 10 15 20 25 30 35 - № 3689 СПбНИИФ, стійкість до ізоніазиду (1 мкг/мл), рифампіцину (20 і 50 мкг/мл), стрептоміцину (50 мкг/мл), канаміцину (30 мкг/мл); - № 3910 СПбНИИФ, стійкість до ізоніазиду (1 мкг/мл), рифампіцину (20 і 50 мкг/мл), стрептоміцину (50 мкг/мл), канаміцину та етіонаміду (30 мкг/мл); - № 1201 СПбНИИФ, стійкість до ізоніазиду (1 мкг/мл), рифампіцину (20 мкг/мл), стрептоміцину (50 мкг/мл), канаміцину (30 мкг/мл), етамбутолу (2 мкг/мл); - № 41 і № 779 СПбНИИФ, стійкі до ізоніазиду (1 мкг/мл), рифампіцину (20 і 50 мкг/мл), стрептоміцину (50 мкг/мл); -№1081 СПбНИИФ, стійкість до рифампіцину (20 мкг/мл), стрептоміцину (50 мкг/мл); - № 1719 і № 1279 СПбНИИФ, стійкі до ізоніазиду (1 мкг/мл), рифампіцину (20 мкг/мл), стрептоміцину (50 мкг/мл) канаміцину та етіонаміду (30 мкг/мл); 3) неспецифічні мікроорганізми, чутливі до антимікробних препаратів (з колекції ФГУ "СПб НИИФ Росздрава") - грамнегативні палички - Е. соlі; - грампозитивні коки - Staphylococcus aureus, Streptococcus aureus, Corynebacterium pseudodiphtericum (дифтероїд). Антибактеріальну активність перхлозону вивчали стандартним методом дворазових серійних розведень у живильних середовищах з урахуванням біологічних властивостей тестштамів: - синтетичне середовище Сотона з 10 % нормальною сироваткою (для мікобактерій); - цукровий бульйон (для грампозитивних і грамнегативних бактерій). 6 Мікробну суспензію готували ex tempore, робоча концентрація - 5 × 10 клітин/мл. Діапазон досліджуваних доз перхлозону складав від 100 до 0,19 мкг/мл, з кожною культурою виконували по 3 повторні дослідження. Суспензію тест-штамів вносили по 0,2 мл у дослідні та контрольні пробірки: мікобактеріальну суспензію методом поверхневого нашарування, суспензію неспецифічних бактерій - методом глибинного посіву. Інтенсивність росту неспецифічних мікробів ураховували через 24 години, мікобактеріальної плівки - через 7-10 днів. Критерієм активності служила величина мінімальної концентрації засобу згідно з винаходом в живильному середовищі, яка повністю інгібувала ріст мікроорганізмів (МІК, мкг/мл). Для моделювання експериментального туберкульозу використовували штам М. bovis bovinus 8, чутливий до протитуберкульозних препаратів. Оцінка терапевтичного ефекту засобу згідно з винаходом. Використовували індекс ефективності лікування IE (%) - дольова різниця показників тяжкості перебігу туберкульозної інфекції в контрольних групах і в групах тварин, які одержували засіб згідно з винаходом. Індекс ефективності визначали за формулою: n  n0 IE %  k  100 nk , 40 45 50 де nk і n0 - середні значення показників відповідно в контрольній і дослідній групах. Позитивне значення IE (плюс-ефект) вказує на зниження показника ураженості або підвищення терапевтичної активності композиції протитуберкульозних препаратів під дією засобу згідно з винаходом. Негативне значення IE (мінус-ефект) свідчить про збільшення показника ураженості або послаблення терапевтичної дії композиції протитуберкульозних препаратів під впливом засобу згідно з винаходом. При оцінюванні дії препаратів порівняння ефекти розраховували аналогічно і позначали їх відповідно до загальноприйнятої символіки (за першою літерою препарату). Ступінь зв'язку у варіації отриманих терапевтичних ефектів визначали за коефіцієнтом кореляції (r), кількісно вимірювали за коефіцієнтами регресії в у/х. Для цього використовували стандартні методи розрахунків Стьюдента - Фішера. 2. Антибактеріальна активність засобу згідно з винаходом in vitro Результати вивчення впливу засобу згідно з винаходом на ріст стандартних тест-штамів, що входять в Mycobacterium tuberculosis complex, чутливих до існуючих протитуберкульозних препаратів, наведені в таблиці 1. 55 4 UA 102970 C2 Таблиця 1 Вплив засобу згідно з винаходом на ріст чутливих тест-штамів мікобактерій 6 (щільність мікобактеріальної суспензії 10 клітин/мл) Концентрація Інтенсивність росту мікобактеріальної плівки засобу згідно з винаходом в М. tuberculosis М. tuberculosis М. tuberculosis М. bovis bovinus 8 середовищі H37RV Erdman "Academia" (мкг/мл) 100 --------50 --------25 --------12,5 --------6,25 --------3,125 --++ --++ 1,56 --+++ + +++ 0,78 + +++ ++ +++ 0,39 ++ +++ ++ +++ 0,19 ++ +++ ++ +++ Контроль культури +++ +++ +++ +++ 5 10 Як видно з таблиці 1, засіб згідно з винаходом пригнічував ріст тестованих штамів у діапазоні концентрацій від 1,56 мкг/мл до 6,25 мкг/мл. Найбільшу інгібуючу активність засіб згідно з винаходом виявив у відношенні М. bovis bovinus 8, початкове інгібування росту (++) виявлено при концентрації 0,19 мкг/мл, повне пригнічення росту (МІК) - при концентрації 1,56 мкг/мл. Далі, в порядку послаблення інгібуючого ефекту, штами розподілилися наступним чином: - М. tuberculosis Erdman (MIK = 3,125 мкг/мл) - М. tuberculosis H37RV i M. tuberculosis "Academia"(MIK=6,25 мкг/мл). З метою виявлення широти спектра антибактеріальної активності перхлозону вивчено його дію у відношенні грампозитивних коків (Staphylococcus aureus, Streptococcus aureus), а також грампозитивних і грамнегативних паличок (Е. соlі і дифтероїду). Результати дослідження представлені в таблиці 2. 15 Таблиця 2 Вплив засобу згідно з винаходом на ріст грам (+) і грам (-) тест-штамів мікроорганізмів 6 (щільність мікробної суспензії 10 клітин/мл) Концентрація засобу згідно з винаходом в середовищі (мкг/мл) 100 50 25 12,5 6,25 3,125 1,56 0,78 0,39 0,19 Контроль культури Інтенсивність росту тест-штаму Staphyl. aureus Strept. aureus Е. coli Дифтероїд +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 5 UA 102970 C2 5 Як видно з наведених у таблиці 2 даних, засіб згідно з винаходом навіть при високих концентраціях в живильному середовищі (100 мкг/мл) не впливав на ріст грампозитивних і грамнегативних культур мікроорганізмів. Інгібуючу дію засобу згідно з винаходом відносно лікарсько-чутливих мікобактерій вивчено на 14 клінічних ізолятах, з них в 2 (14,3 %) виявлена резистентність до 6 протитуберкульозних препаратів (ПТП), в 7 (50 %) - до 5 ПТП, в 1 (7,1 %) - до 4 ПТП, в 3 (21,4 %) - до 3 ПТП, в 1 (7,1 %) - до 2 ПТП (дивись табл. 3) Таблиця 3 Вплив засобу згідно з винаходом на ріст лікарсько-стійких клінічних ізолятів МБТ 6 (щільність мікобактеріальної суспензії 5 × 10 мікробних клітин/мл) Досліджені ізоляти МБТ Стійкість до 6 ПТП N3485 Стійкість до 6 ПТП N3589 Стійкість до 5 ПТП N2485 Стійкість до 5 ПТП N1201 Стійкість до 5 ПТП N3019 Стійкість до 5 ПТП N3655 Стійкість до 5 ПТП N3910 Стійкість до 5 ПТП N1719 Стійкість до 5 ПТП N1279 Стійкість до 4 ПТП N3689 Стійкість до 3 ПТП N5419 Стійкість до 3 ПТП N779 Стійкість до 3 ПТП N41 Стійкість до 2 ПТП N1081 10 15 20 25 30 35 Мінімальна інгібуюча концентрація (МІК, мкг/мл) 6,25 6,25 50 6,25 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125 6,25 3,125 1,56 3,125 1,56 Тестування показало, що засіб згідно з винаходом інгібував ріст всіх лікарсько-стійких клінічних ізолятів: - 14,3 % (2 штами) - в дозі 1,56 мкг/мл; - 50,0 % (7 штамів) - в дозі 3,125 мкг/мл; - 28,6 % (4 штами) - в дозі 6,25 мкг/мл; - 7,1 % (1 штам) - в дозі 50,0 мкг/мл. Необхідно відзначити ефективність інгібуючої дії засобу згідно з винаходом відносно штамів, стійких до 5-6 протитуберкульозних препаратів, де МІК для 88,8 % культур становила 3,1256,25 мкг/мл. Таким чином, в результаті проведених досліджень in vitro встановлено, що засіб згідно з винаходом: - має вибіркову антимікробну активність, діючи тільки на життєздатність мікобактерій туберкульозу; - має виражену протитуберкульозну дію як у відношенні чутливих, так і стійких штамів МБТ. 1.2 Ефективність монотерапії засобом згідно з винаходом при експериментальному туберкульозі у мишей Дослідження, проведене на 200 білих нелінійних мишах-самцях масою 18-20 г. У мишей штам М. bovis bovinus 8 викликав клінічну картину генералізованого туберкульозу, на 11 день після інфікування в легенях візуалізовані осередки специфічного запалення. З цього дня тваринам дослідних груп розпочато введення досліджуваних препаратів. На 52-й день після зараження летальність в групі контролю (заражені, неліковані тварини) склала 95,8 % (табл. 4). Засіб згідно з винаходом в дозі 10 мг/кг знизив летальність на 31,6 %, а в дозах 20 мг/кг і 30 мг/кг - на 73,9 % і на 97,5 % відповідно (табл. 4). Захисна дія засобу згідно з винаходом проявилася також і у вигляді зменшення втрати маси тіла хворих мишей. В дозі 10 мг/кг засіб згідно з винаходом скоротив падіння маси тіла на 5,3 %, а в дозах 20 мг/кг і 30 мг/кг - на 21,5 % і на 19,0 % (табл. 4). 6 UA 102970 C2 Таблиця 4 Протективна дія засобу згідно з винаходом за показниками летальності та зміни маси тіла мишей, заражених М. bovis bovinus 8 № гр. 2 3 4 5 Летальність Умови досліду Маса тіла % від вихідної ІЕ% % 95,8 0 77,8 0 62,5 +31,6 81,9 +5,3 25,0 +73,9 94,5 +21,5 2,4 Заражені неліковані n=24 засіб згідно з винаходом 10 мг/кг, per os n=16 засіб згідно з винаходом 20 мг/кг, per os n=16 засіб згідно з винаходом 30 мг/кг, per os n=16 ІЕ% +97,5 92,6 +19,0 Примітка: IE - індекс ефективності 5 10 Таким чином, високі протективні і терапевтичні показники засобу згідно з винаходом в умовах монотерапії мишей з експериментальним туберкульозом характеризують його як ефективний антимікобактеріальний засіб. Ці результати відповідають здатності засобу згідно з винаходом пригнічувати ріст тест-штаму М. bovis bovinus 8 in vitro (табл. 1). 2. Ефективність монотерапії засобу згідно з винаходом при експериментальному туберкульозі у кроликів Дослідження проведено на 18 кроликах-самцях породи шиншила, інфікованих в крайову вушну вену тест-штамом М. bovis bovinus 8. Засіб згідно з винаходом починали вводити тваринам (n=6) у день зараження в дозі 20 мг/кг перорально, тривалість курсу - 2 місяці. Групи порівняння: заражені неліковані кролики (контроль зараження, n=6) і заражені, ліковані ізоніазидом (15 мг/кг, перорально, n=6). Результати експерименту представлені в таблиці 5. Таблиця 5 Протективна дія засобу згідно з винаходом за показниками летальності та зміни маси тіла кроликів, заражених М. bovis bovinus8 № гр. 1. 2. 3. Умови досліду Контроль зараження n=6 Ізоніазид 15 мг/кг per os n=6 Засіб згідно з винаходом 20 мг/кг per as n=6 Летальність % (від вихідного IE (%) n) Macа тіла % від вихідної ІE (%) 100 0 -27,6 -- 0 +100,0 -6,99 +74,67 0 +100,0 -7,13 +77,17 15 20 25 Як видно з даних таблиці 5, засіб згідно з винаходом більш ефективно, ніж ізоніазид, запобігав загибелі кроликів від туберкульозної інфекції, сприяв підвищенню їхньої маси тіла (в середньому на 77,17 % проти 74,67 % для ізоніазиду). 2.1. Вплив засобу згідно з винаходом на лікувальний ефект протитуберкульозних препаратів при експериментальному туберкульозі у мишей Дослідження проведено на 250 білих нелінійних мишах-самцях. Проведено оцінювання 6 комбінацій засобу згідно з винаходом (20 мг/кг, перорально) з протитуберкульозними препаратами (ПТП), що мають різну специфічну активність. В групах порівняння проводили мототерапію досліджуваними ПТП в середніх терапевтичних дозах. Лікування починали у всіх групах на 12 день після інфікування на фоні підтвердженого специфічного запального процесу в легенях при розтині мишей з групи контролю зараження. Результати досліду враховували через 42 дня (6 тижнів) терапії. 7 UA 102970 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Вплив засобу згідно з винаходом на терапевтичну дію ПТП за показниками ураженості органів варіював залежно від властивостей використовуваних препаратів (табл. 6). Залежно від особливостей результату взаємодії із засобом згідно з винаходом ПТП розподілені на 3 групи. Група 1. ПТП, що проявляють синергідну взаємодію із засобом згідно з винаходом (посилення лікувального ефекту за всіма показниками ураженості органів): - Ізоніазид - підвищення терапевтичної активності в середньому на 13,9 % з варіацією від 3,6 % (зниження коефіцієнта маси печінки) до 25 % (зменшення масивності колонієутворюючих одиниць (КУО) в селезінці); - Амікацин - збільшення ефективності в середньому на 11,34 % з варіацією від 34,6 % (зниження коефіцієнта маси селезінки, р< 0,001) до 1,8 % (зменшення індексу ураження легенів). Група 2. ПТП, у яких терапевтична активність підсилюється за більшістю показників ураженості (три з п'яти): - Рифампіцин - приріст ефективності на 9,66 % за рахунок зниження коефіцієнтів маси легенів (на 18,2 %, р < 0,05), селезінки (на 34,6 %, р < 0,01) і печінки (на 1,6 %), при збільшенні числа КУО на 6,19 %; - Рифабутин - приріст ефективності на 7,68 % за рахунок зменшення коефіцієнтів маси легенів (на 12,4 %) і селезінки (на 20,6 %, р < 0,05), зниження здатності МБТ висіватися із селезінки (на 13,2 %), але при цьому підвищувалися два показники - коефіцієнт маси печінки та індекс ураження легенів (на 0,4 % і 7,4 % відповідно); - Етамбутол - приріст ефективності на 11,44 % за рахунок зменшення коефіцієнтів маси селезінки (на 22,1 %), печінки (8,9 %) і числа КУО в селезінці (на 33,3 %), при збільшенні індексу ураження легенів і їхньої маси (на 4,0 і 3,1 % відповідно). Група 3. Препарати, що взаємодіють із засобом згідно з винаходом переважно за типом антагонізму: - Офлоксацин - зниження ефективності на 6,2 % з варіацією показників від 4,65 % до 11,9 %, за винятком індексу ураження легенів з позитивним лікувальним ефектом в 2,6 %. Стан фагоцитарної функції пМф в групах спостереження представлено в таблиці 7. Як видно з таблиці, середня макрофагальна активність пМф при монотерапії засобом згідно з винаходом була на рівні інтактних мишей (132,41 проти 154,97). Активуюча дія засобу згідно з винаходом поширювалася на ті препарати, які знижували ефективність фагоцитозу при монотерапії. Під впливом засобу згідно з винаходом реєстрували активацію фагоцитозу в комплексі з 3 ПТП: рифампіцином - в 1,4 раза (з 71,43 до 99,12), рифабутином - в 1,3 раза (з 66,88 до 83,55), офлоксацином - в 1,2 раза (з 95,14 до 111,66). У трьох ПТП спостерігали зниження активності пМф при поєднаному застосуванні із засобом згідно з винаходом. Так, зменшення середньої макрофагальної активності на фоні засобу згідно з винаходом відзначене у ізоніазиду в 1,2 раза (з 77,66 до 66, 54); у етамбутола - в 1,3 раза (з 106,35 до 81,95), у амікацину - в 2,8 раза (з 193,42 до 68,29). Морфологічні показники в умовах монозастосування шести протитуберкульозних препаратів і в композиції із засобом згідно з винаходом наведені в таблиці 7. За сукупністю тестованих показників засіб згідно з винаходом сприяв зменшенню ступеня ураженості легеневої тканини при поєднаному застосуванні з рифампіцином - на 16,9 %, з ізоніазидом - на 10,1 %, з офлоксацином - на 3,24 %, з етамбутолом - на 3,19 %, з амікацином - на 2,56 %. Підвищення показників пошкодження легенів відзначено тільки при спільному призначенні засобу згідно з винаходом з рифабутином (на 15,9 %). Класифікація ПТП за вираженістю терапевтичної дії на фоні засобу згідно з винаходом, врахована по семи найбільш інформативних тестах, установленим за допомогою кореляційного аналізу, представлена в таблиці 8. Можна відзначити три композиції з найбільшим позитивним ефектом по семи тестах ураження (20 випадках). З цього числа лідирують композиції рифабутин + засіб згідно з винаходом і рифампіцин + засіб згідно з винаходом (в 7 випадках кожна). Рідше зустрічаються композиції амікацин + засіб згідно з винаходом (в 4 випадках) та ізоніазид + засіб згідно з винаходом (в 2 випадках). Слабка дія відзначена в композиціях засобу згідно з винаходом з офлоксацином і етамбутолом. 8 UA 102970 C2 Таблиця 6 Вплив засобу згідно з винаходом на терапевтичну активність протитуберкульозних препаратів в умовах їхнього поєднаного застосування (42 дня лікування) Коефіцієнти маси органів № Умови досліду гp. легенів 1 2 3 4 рифампіцин 1,98±0,1 n=13 10 мг/кг, per os засіб згідно з 5 винаходом, 1,62±0,14 n=12 20 мг/кг, per os р 4-5