Застосування il-18 інгібіторів для лікування або попередження пов’язаної з сепсисом дисфункції серця

1. Застосування інгібітору IL-18 для отримання лікарського засобу для лікування і/або профілактики пов'язаної із сепсисом дисфункції серця, де інгібітор IL-18 вибраний з групи: антитіла проти IL18, антитіла проти зв’язувальних білків IL-18 BРa і IL-18 BPс. 2. Застосування за п. 1, де IL-18-зв’язувальний білок є ПЕГ-кон’югованим. 3. Застосування за п. 1, де інгібітор IL-18 є специфічним антитілом проти IL-18, вибраним з групи: химерне, гуманізоване або людське антитіло. 4. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де лікарський засіб додатково містить інгібітор цитокіну, вибраний з групи: фактор некрозу пухлини α (TNF-α) і IL-1β. C2 2 UA 1 3 85531 здатний індукувати інтерферон-γ (IFN-γ) у к ультурах клітин селезінки нормальних мишей у присутності інтерлейкіну-2 (IL-2) (Nakamura et al., 1989). Даний фактор діяв не як прямий індуктор IFN-γ, а скоріше як костимулятор разом з IL-2, анти-CD3 або мітогенами. У спробі додаткової ідентифікації цієї активності з сироватки мишей після обробки ендотоксином був виявлений, очевидно, гомогенний білок з М.м. 50-55 кДа, який був зв'язаний із зазначеною вище активністю (Nakamura et al. 1993). Оскільки інші цитокіни можуть діяти як костимулятори відносно продукування IFN-γ, нездатність нейтралізуючих антитіл до IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 або TNF блокувати цю сироваткову активність припускала, що даний фактор був фактором, який відрізняється. Ті ж самі автори документували, що костимулятор продукування IFN-γ, який індукується ендотоксином, був присутнім в екстрактах печінок з мишей, заздалегідь підданих впливу P. acnes (Okamura et al. 1995). Відповідно до цієї експериментальної моделі, популяція печінкових макрофагів (клітин Купфера) збільшується, і, отже, низька доза бактеріального ліпополісахариду (LPS) стає летальною. Подібна обробка не є летальною для непідготованих описаним вище способом мишей. Даний фактор, названий IFN-γ-індукуючим фактором (IGIF) і пізніше названим інтерлейкіном18 (IL-18), був очищений до гомогенності з цих оброблених P. acnes печінок мишей, і була одержана часткова амінокислотна послідовність. Для клонування кДНК мишачого IL-18 використовували вироджені олігонуклеотиди, одержані з амінокислотних послідовностей очищеного IL-18 (Okamura et al. 1995). Людська кДНК-2 послідовність для IL18 була повідомлена у 1996 році (Ushio et al. 1996). Інтерлейкін IL-18 (Tsutsui et al. 1996, Nakamura et al. 1993, Okamura et al. 1995, Ushio et al. 1996) має спільні структурні ознаки з сімейством IL-1 білків (Bazan et al. 1996), які всі мають βскладчасту стр уктур у на відміну від більшості інших цитокінів, які виявляють структуру чотириспіральних пучків. Подібно до IL-1β, IL-18 синтезується у ви гляді біологічно неактивного попередника (пpoIL-18) і позбавлений сигнального пептиду (Ushio et al. 1996). Попередники IL-1β та IL-18 розщеплюються каспазою 1 (IL-1β-конвертуючим ферментом або ICE), яка розщеплює дані попередники після залишку аспарагінової кислоти у положенні Р1. Одержані зрілі цитокіни вивільняються з клітини (Ghayur et al. 1997 і Gu et al. 1997), незважаючи на відсутність сигнального пептиду. Відомо, що IL-18 діє як костимулятор відносно продукування цитокінів (IFN-γ, IL-2 і гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора) Т-хелперними клітинами типу І (Th1) (Kohno et al. 1997), а також як костимулятор відносно FASлігандопосередкованої цитотоксичності, що виявляється клонами мишачих природних клітинкілерів (Tsutsui et al. 1996). Інтерлейкін-12 (IL-12) є імунорегуляторним цитокіном, що продукується моноцитами/макрофагами та іншими антигенпрезентуючими клітинами. Він є центральним в «оркестровці» як природних, так і набути х клітинно 4 опосередкованих імунних відповідей (Trinchieri 1998). Він складається з гетеродимеру, складеного з ковалентно зв'язаних продуктів двох окремих генів: важкого ланцюга (р40) і легкого ланцюга (р35). Продукування IL-12 стимулюється у відповідь на певні бактерії, бактеріальні продукти, внутрішньоклітинні паразити і віруси. IL-12 були приписані наступні функції: 1) він є сильнодіючим індуктором IFN-γ з Т-клітин і природних клітинкілерів (NK-клітин), 2) він є ко-мітогенним для таких клітин, 3) він є вирішальним для розвитку Thlреакцій у більшості систем (таким чином, приводячи повторно до збільшень продукування IFN-γ і TNF, активації макрофагів і т.д.), 4) він посилює цитотоксичність цитотоксичних Т-лімфоцитів і NKклітин, і 5) він є необхідним для гіперчутливості уповільненого типу. Було показано, що продукування IL-12 у виділених мишачих лейкоцитах селезінки, оброблених штамом Staphylococcus aureus Cowan 1, пригнічується IFN-α або IFN-β (Karp et al. 2000). Нещодавно повідомлялося, що IL-12 бере участь у патогенезі органоспецифічних автоімунних запальних захворювань, таких як розсіяний (множинний) склероз (MS) (Karp et al. 2000) і запальне захворювання кишечнику (IBD) (Blumberg and Strober 2001 і Fiocchi 1999), і, отже, вважається потенційною мішенню лікарських засобів для лікування даних станів. IL-18 і IL-12 виявляють явний синергізм в індукції IFN-γ в Т-клітинах (Okamura et al. 1998). Дослідження механізму цього синергізму виявили, що IL-12 підвищуючим чином регулює експресію обох ланцюгів рецептора IL-18 на продукуючи х IFN-γ клітинах (Kim et al. 2001). Хоча IL-12 та IL-18 активують як природний, так і набутий імунітет, їх надмірне продукування активованими макрофагами може індукувати порушення великої кількості органів, у тому числі порушення функції імунної системи (Seki et al. 2000). Цитокінзв'язувальні білки (розчинні рецептори цитокінів) є звичайно позаклітинними лїгандзв'язувальними доменами їх відповідних рецепторів цитокінів клітинної поверхні. Вони продукуються або альтернативним сплайсингом, або протеолітичним розщепленням рецептора клітинної поверхні. Ці розчинні рецептори були описані у минулому: наприклад, розчинні рецептори для IL-6 та IFNγ (No vick et al. 1989), TNF (Engelmann et al. 1989 і Engelmann et al. 1990), IL-1 та IL-4 (Maliszewski et al. 1990) і IFN-α/β (Novick et al. 1994, Novick et al. 1992). Один цитокінзв'язувальний білок, названий остеопротегерином (OPG, відомий також як фактор, що інгібує остеокласти, - OCIF), член TNFR/Fas-сімейства, є, очевидно, першим прикладом розчинного рецептора, який існує тільки у вигляді білка, що секретується (Anderson et al. 1997, Simonet et al. 1997, Yasudaetal. 1998). Інтерлейкін-18-зв'язувальний білок (IL-18BP) був а фінно очищений на IL-18-колонці з сечі (Novick et al. 1999). IL-18BP припиняє IL-18-індукцію IFN-γ та IL-18-активацію NF-kB in vitro. Крім того, IL-18BP інгібує індукцію IFN-γ у мишах, ін'єктованих LPS. Ген IL-18BP локалізований у хромосомі 11 людини, і у геномній послідовності розміром 8,3 5 85531 т.п.н., що містить ген IL-18BP, не був знайдений екзон, що кодує трансмембранний домен. До нашого часу у людини були виявлені чотири ізоформи IL-18BP, що генеруються альтернативним сплайсингом мРНК. Вони були названі IL-18BP а, b, с і d, причому всі вони мають один і той же Nкінець і відрізняються по С-кінцю (Novick et al. 1999). Дані ізоформи відрізняються за їх здатністю зв'язувати IL-18 (Kim et al. 2000). Відомо, що з цих чотирьох ізоформ ізоформи а і с IL-18BP людини (ML-18BP) мають нейтралізуючу активність відносно IL-18. Найбільш представлена ізоформа IL18BP, ізоформа а сплайсингового варіанта, виявляє високу афінність відносно IL-18 з високою швидкістю зв'язування і низькою швидкістю дисоціації та константою дисоціації (Kd), яка складає приблизно 0,4 нМ (Kim et al. 2000). IL-18BP конститутивно експресується у селезінці і належить до суперсімейства імуноглобулінів. Залишки, що беруть участь у взаємодії IL-18 з IL-18BP, були описані з використанням комп'ютерного моделювання (Kim et al. 2000) і на основі взаємодії між подібним білком IL-Ιβ та IL-1R типу І (Vigers et al. 1997). Відповідно до цієї моделі зв'язування IL-18 з IL-18BP, було зроблене припущення, що залишок Glu у положенні 42 і залишок Lys у положенні 89 IL-18 зв'язуються з Lys-130 і Glu-114 в IL-18BP, відповідно (Kim et al. 2000). IL-18BP конститутивно присутній у багатьох клітинах (Puren et al. 1999) і циркулює у кровотоці здорових людей (Urushihara et al. 2000), представляючи унікальний феномен у біології цитокінів. Внаслідок високої афінності IL-18BP відносно IL-18 (Kd = 0,4 нМ), а також високої концентрації IL18BP, виявленої у кровотоці (20-разового молярного надлишку відносно IL-18), було зроблене припущення, що більшість молекул, якщо не всі молекули, IL-18 у кровотоці є зв'язаними з IL-18BP. Таким чином, циркулюючий IL-18BP, який конкурує з рецепторами клітинної поверхні за IL-18, може діяти як природна протизапальна та імуносупресивна молекула. Як згадувалося, IL-18 індукує IFN-γ, який, у свою чергу, як повідомлялося нещодавно, індукує генерування мРНК IL-18BPa in vitro (Muhl et al. 2000). Таким чином, IL-18BPa міг би служити як сигнал «вимкнення», що термінує запальну реакцію. IL-18BP є значимо гомологічним з сімейством білків, що кодується декількома поксвірусами (Novick et al. 1999, Xiang and Moss 1999). Інгібування IL-18 цим припустимим вірусним IL-18BP може атенуювати запальну антивірусн у Thl-реакцію. Термін синдром системної запальної реакції (SIRS) описує звичайний клінічний синдром сепсису, незалежно від його причини. SIRS може бути результатом травми, панкреатиту, реакцій на лікарські засоби, автоімунного захворювання та інших порушень; коли даний синдром виникає у відповідь на інфекцію, кажуть про присутність сепсису (Nathens and Marshall 1996). Септичний шок є поширеною причиною смерті у медичних і хірургічних відділеннях інтенсивної терапії (Astiz and Rackow 1998). Терміни сепсис, важкий сепсис і септичний шок використовуються 6 для ідентифікації розгортання клінічної реакції на інфекцію. Пацієнти з сепсисом виявляють ознаки інфекції та клінічних маніфестацій запалення. Пацієнти з важким сепсисом розвивають гіпопер фузію з дисфункцією органів. Септичний шок виявляється гіпоперфузією та стійкою гіпотензією. Смертність знаходиться у діапазоні від 16% у пацієнтів з сепсисом до 40-60% у пацієнтів з септичним шоком. Найбільш звичайною причиною септичного шоку є бактеріальна інфекція. Найбільш частими місцями інфекції є легені, черевна порожнина і сечові шляхи. Звичайні протизапальні терапії, такі як застосування кортикостероїдів, не змогли показати поліпшення у виживанні від сепсису і септичного шоку. Три моноклональних антитіла, специфічних відносно ендотоксину, випробовували у клінічних випробуваннях, і вони не змогли поліпшити коефіцієнти виживаності. Терапія з використанням антагоністів до фактора некрозу пухлини, інтерлейкіну 1, брадикініну, ібупрофену; та фактора, що активує тромбоцити, не виявляла поліпшення виживання від септичного шоку (Astiz and Rackow 1998). Сепсис викликається inter alia грампозитивними бактеріями, наприклад, Staphylococcus epidermidis. Вважається, що ліпотейхоєві кислоти і пептидоглікани, які є основними компонентами клітинної стінки видів Staphylococcus, є індукторами вивільнення цитокінів у даному стані (Grupta et al. 1996 і Cleveland et al. 1996). Однак інші грампозитивні компоненти також розглядаються як стимулятори синтезу цитокінів (Henderson et al. 1996). Вважається, що продукування IL-1, TNF-α та IFN-γ вносить основний внесок у патогенез септичного шоку (Dinarello 1996 і Okusawa et al. 1988). Крім того, було показано, що хемокін IL-8 індукується нейтрофілами у відповідь на S. epidermidis (Hachicha et al. 1998). Важливими факторами у регуляції індукції IL-1, TNF-α та IFN-γ S. epidermidis є IL-18, IL-12, IL-Ιβ і TNF-α. IL-1 β і TNF-a можуть розглядатися як костимули для продукування IFNγ Т-лімфоцитами, подібно до IL-18. Дані два цитокіни мають костимуляторну активність на продукування IFN-γ у контексті IL-12 або бактеріальної стимуляції (Skeen et al. 1995 і Tripp et al. 1993). Нещодавно Nakamura et al. (2000) повідомили, що одночасне введення IL-18 та IL-12 мишам приводить до високої токсичності, подібної до токсичності, виявленої в індукованому ендотоксином септичному шоку. Було показано, що рівні IL-18 підвищуються у сироватках пацієнтів з сепсисом (Endo et al. 2000), але це збільшення корелювало з рівнями креатиніну, що дозволяє припускати, що підвищені рівні IL-18 можуть бути результатом ниркової недостатності. В іншому дослідженні (Grobmyer et al. 2000) рівні IL-18 у 9 суб'єктів з сепсисом під час перших 96 годин після госпіталізації були високими і не корелювали з рівнями креатиніну. Як видно із зазначеного вище, IL-18 є плейотропним інтерлейкіном, що має як посилюючу, так і послаблюючу запалення функції. З одного боку, він посилює продукування прозапальних цитокінів, подібних до TNF-α, посилюючи таким чином запалення. З іншого боку, він індукує продукування 7 85531 оксиду азоту (NO), інгібітору каспази-1, блокуючи таким чином дозрівання IL-Ιβ і, можливо, послаблюючи запалення. Ця двозначна роль IL-18 піддає сумніву ефективність інгібіторів IL-18 у лікуванні запальних захворювань.^Крім того, внаслідок участі великої різноманітності різних цитокінів і хемокінів у регуляції запалення, не можна завжди чекати одержання сприятливого ефекту блокуванням тільки одного з шляхів у настільки складній мережі взаємодій. Netea et al. (2000) повідомляли, що введення поліклонального антитіла проти IL-18 захищало мишей проти шкідливих дій LPS, які походять як з Е. соїі, так і з перевірених видів S. typhimurium, підтверджуючи концепцію, що IL-18 грає важливу патогенну роль у летальному ендотоксикозі. Однак, невизначеність відносно ефективності потенційної композиції для лікування на основі введення інгібіторів IL-18 виявляється у тому, що миші з нокаутом IL-18 не є менш чутливими до сепсису у порівнянні з тваринами дикого типу (Sakao et al. 1999), і у тому, що нещодавні повідомлення припускають, що прозапальна активність IL-18 є істотною для захисної системи хазяїна проти важких інфекцій (Nakanishi et al. 2001 iFossetal. 2001). Таким чином, існує необхідність у забезпеченні засобу для лікування і/або попередження сепсису, незважаючи на зазначені вище міркування, які стосуються застосування інгібіторів IL-18. Даний винахід відноситься до застосування інгібітору IL-18 у приготуванні лікарського засобу для лікування і/або попередження сепсису та інших захворювань, характерних для синдрому системної запальної реакції (SIRS), вибраних з тяжкого сепсису і септичного шоку, а також зв'язаного з сепсисом порушення функції серця. Більш конкретно, даний винахід відноситься до застосування інгібітору IL-18, вибраного з інгібіторів каспази-1 (ICE), антитіл проти IL-18, антитіл проти будь-якої з субодиниць рецептора IL-18, інгібіторів шляху передачі сигналу за участю IL-18, антагоністів IL-18, які конкурують з IL-18 і блокують IL-18-рецептор, інгібіторів продукування IL-18 та IL-18-зв'язувальних білків, їх ізоформ, мутеїнів, злитих білків, функціональних похідних, активних фракцій або похідних циркулярної перестановки, які мають щонайменше по суті ту ж саму активність, що і IL-18-зв'язувальний білок. IL-18-зв'язувальний білок, що використовується відповідно до даного винаходу, є його ізоформою, мутеїном, злитим білком (наприклад, Igзлитим), функціональним похідним (наприклад, ПЕГ-кон'югованим), активною фракцією або похідним циркулярної перестановки. Антитіла, що використовуються відповідно до даного винаходу, можуть бути специфічними антитілами проти IL-18, вибраними з химерних, гуманізованих і людських антитіл. Крім того, даний винахід відноситься до застосування інгібітору у приготуванні лікарського засобу, що додатково містить інгібітор IL-12, переважно нейтралізуюче IL-12 антитіло, інтерферон, переважно інтерферон α або β, інгібітор фактора некрозу пухлини, переважно розчинний TNPRI або TNFRII, і/або інгібітор IL-1, переважно антагоніст 8 рецептора IL-1, для одночасного, послідовного або роздільного введення. В одному аспекті даний винахід забезпечує застосування експресуючого вектора, що містить кодуючу послідовність інгібітору IL-18, вибраного з інгібіторів каспази-1 (ICE), антитіл проти IL-18, антитіл проти будь-якої з субодиниць рецептора IL18, інгібіторів шляху передачі сигналу за участю IL18, антагоністів IL-18, які конкурують з IL-18 і блокують IL-18-рецептор, інгібіторів продукування IL18 та IL-18-зв'язувальних білків, їх ізоформ, мутеїнів, злитих білків або похідних циркулярної перестановки, які мають щонайменше по суті ту ж саму активність, що і IL-18-зв'язувальний білок, у приготуванні лікарського засобу для лікування і/або попередження сепсису, наприклад, за допомогою генотерапії. В іншому аспекті даний винахід забезпечує застосування вектора для індукції і/або посилення ендогенної продукції інгібітору IL-18 у клітині у приготуванні лікарського засобу для лікування і/або попередження сепсису. Крім того, даний винахід забезпечує застосування клітини, яка була генетично модифікована для продукування інгібітору IL-18, у приготуванні лікарського засобу для лікування і/або попередження сепсису. В іншому варіанті, даний винахід відноситься до способу лікування і/або попередження сепсису та інших захворювань, характерних для синдрому системної запальної реакції (SIRS), у тому числі зв'язаної з сепсисом дисфункції серця, що передбачає введення суб'єкту, який потребує цього, фармацевтично ефективної кількості інгібітору IL-18, вибраного з інгібіторів каспази-1 (ICE), антитіл проти IL-18, антитіл проти будь-якої з субодиниць рецептора IL-18, інгібіторів шляху передачі сигналу за участю IL-18, антагоністів IL-18, які конкурують з IL-18 і блокують IL-18-рецептор, інгібіторів продукування IL-18 та IL-18-зв'язувальних білків, їх ізоформ, мутеїнів, злитих білків, функціональних похідних, активних фракцій або похідних циркулярної перестановки, які мають щонайменше по суті ту ж саму активність, що і IL-18-зв'язувальний білок. Даний спосіб може передбачати спільне введення терапевтично ефективної кількості інгібітору цитокінів, вибраного з інгібітору IL-12, переважно нейтралізуючих антитіл, інгібіторів фактора некрозу пухлини, переважно розчинної частини TNFRI або TNFRII, інгібіторів IL-1, переважно антагоністів рецептора IL-1, та інгібіторів IL-8, і/або інтерферону, переважно інтерферону-α або -β. Крім того, даний винахід забезпечує спосіб лікування і/або попередження сепсису та інши х захворювань, характерних для синдрому системної запальної реакції (SIRS), що передбачає введення суб'єкту, який потребує цього, фармацевтично ефективної кількості вектора, що кодує послідовність інгібітору IL-18, вибраного з інгібіторів каспази-1 (ICE), антитіл проти IL-18, антитіл проти будьякої з субодиниць рецептора IL-18, інгібіторів шляху передачі сигналу за участю IL-18, антагоністів IL-18, які конкурують з IL-18 і блокують IL-18рецептор, інгібіторів продукування IL-18 та IL-18 9 85531 зв'язувальних білків, їх ізоформ, мутеїнів, злитих білків або похідних циркулярної перестановки. У наступному варіанті даний винахід відноситься до способу лікування і/або попередження сепсису та інших захворювань, характерних для SIRS, що передбачає введення суб'єкту, який потребує цього, фармацевтично ефективної кількості вектора для індукції і/або посилення ендогенного продукування інгібітору IL-18 у клітині. Крім того, даний винахід забезпечує спосіб лікування і/або попередження сепсису та інши х захворювань, характерних для SIRS, що передбачає введення суб'єкту, який потребує цього, клітини, яка була генетично модифікована для продукування IL-18. Фіг.1 показує розподіл сироваткового IL-18BPa у здорових індивідуумів. Сироватки здорових індивідуумів чоловічої і жіночої статі у віці 20-60 років, аналізовані на присутність IL-18BPa за допомогою специфічного ELISA-тесту (n=107). Фіг.2А показує середні рівні IL-18 та IL-18BPa у пацієнтів з сепсисом і здорових суб'єктів. IL-18 та IL-18BPa у сироватці визначали у здорових індивідуумів (див. фіг.1) і у 198 пробах з 42 пацієнтів з сепсисом відразу ж після госпіталізації і під час госпіталізації. Фіг.2В показує розподіл індивідуальних рівнів IL-18 та IL-18BPa у здорових суб'єктів і пацієнтів, описаних у фіг.2А. Середні рівні у сироватці IL-18 та IL-18BPa у здорових суб'єктів показані пунктирною вертикальною і горизонтальною лінією, відповідно. Фіг.3 показує порівняння між загальним і вільним IL-18 у окремих пацієнтів з сепсисом після госпіталізації. Рівень вільного IL-18 (чорні кружки) у сироватках розраховували на основі концентрації загального IL-18 (білі кружки) та IL-18BPa, з врахуванням стехіометрії 1:1 IL-18 до IL-18BP у комплексі і розрахованій Kd, що складає 400 пМ. Кожна вертикальна лінія зв'язує загальний і вільний IL-18 в окремій пробі сироватки. Фіг.4 показує дію IL-18BP на S. epidermidisіндуковане продукування IFN-γ у цільній крові. Суцільна кров стимулювалася тільки S. epidermidis або S. epidermidis і рекомбінантним IL-18BP у вказаних концентраціях. Після 48 годин інкубації культуру крові лізували і вимірювали IFN-γ. Результати виражені у відсотках індукції IFN-γ S. epidermidis. P