Використання пептидів, що зв’язуються з тро рецептором

1. Спосіб лікування пацієнта, що потерпає від тромбоцитопенії, який включає призначення даному пацієнту терапевтично ефективної дози або кількості пептидної сполуки, що містить наступну послідовність: (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)K(NH2)-(X10RAAL(2-Nal)QRLTPGEI)-H, де (2-Nal) є 2 (19) 1 3 96418 4 15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що поліетиленгліколь вибирається із групи, що складається із монометоксиполіетиленгліколю (МеРEG-ОH), монометоксиполіетиленглікольсукцинату (MePEG-S), монометоксиполіетиленглікольсукцинімідилсукцинату (MePEG-S-NHS), монометоксиполіетиленглікольаміну (MePEG-NH2), монометоксиполіетиленглікольтрезилату (MePEGTRFS) та монометоксиполіетиленглікольімідазолілкарбонілу (MePEG-IM). 16. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що пептидна сполука має формулу: І Е G Р Т L R Q (2-Nal) L А А R-(Sar) \ K(NН2) / І Е G Р Т L R Q (2-Nal) L A A R-(Sar), де (2-Nal) є β-(2-нафтил)аланіном і (Sar) є саркозином. 17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що пептидна сполука приєднана у ковалентний спосіб до гідрофільного полімеру. 18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що гідрофільний полімер вибирається із групи, яка складається із поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, полімолочної кислоти та полігліколевої кислоти. 19. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що гідрофільний полімер являє собою поліетиленгліколь. 20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що поліетиленгліколь має середню молекулярну вагу від приблизно 5000 до приблизно 20000 Да. 21. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що поліетиленгліколь вибирається із групи, що скла дається із монометоксиполіетиленгліколю (MePEG-OH), монометоксиполіетиленглікольсукцинату (MePEG-S), монометоксиполіетиленглікольсукцинімідилсукцинату (MePEG-S-NHS), монометоксиполіетиленглікольаміну (MePEG-NH2), монометоксиполіетиленглікольтрезилату (MePEGTRES) та монометоксиполіетиленглікольімідазолілкарбонілу (MePEG-IM). 22. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що кожна із димерних субодиниць пептидної сполуки приєднана у ковалентний спосіб до гідрофільного полімеру. 23. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що гідрофільний полімер вибирається із групи, яка складається із поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, полімолочної кислоти та полігліколевої кислоти. 24. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що гідрофільний полімер являє собою поліетиленгліколь. 25. Спосіб за п. 24, який відрізняється тим, що поліетиленгліколь має середню молекулярну вагу від приблизно 5000 до приблизно 20000 Да. 26. Спосіб за п. 24, який відрізняється тим, що поліетиленгліколь вибирається із групи, що складається із монометоксиполіетиленгліколю (MePEG-ОН), монометоксиполіетиленглікольсукцинату (MePEG-S), монометоксиполіетиленглікольсукцинімідилсукцинату (MePEG-S-NHS), монометоксиполіетиленглікольаміну (MePEG-NH2), монометоксиполіетиленглікольтрезилату (MePEGTRES) та монометоксиполіетиленглікольімідазолілкарбонілу (MePEG-IM). Перехресне посилання на споріднені заявки Дана заявка, котра є заявкою у часткове продовження заявки США за серійним номером 10/918561 від 13 серпня 2004 року, оголошує пріоритет заявок США за серійними номерами 10/918561 та 60/498740, на які у даному тексті зроблені повні посилання. Галузь винаходу Даний винахід запроваджує пептидні сполуки, що зв'язуються з та активують тромбопоетиновий рецептор (c-mpl або TPO-R) або, інакше, діють як ТРО агоністи. Даний винахід має застосування у галузях біохімії та медичної хімії, і, зокрема, запроваджує ТРО агоністи для використання у лікуванні людських хвороб. Рівень техніки Мегакаріоцити являють собою клітини, одержані із кісткового мозку, котрі відповідальні за продукування циркулюючих у крові тромбоцитів. Хоча у більшості видів ці клітини містять ніж 10-кратно більший об'єм типових мозкових клітин Дивись, Kuter, et al., Proc Natl Acad Sci USA 91 11104-11108 (1994). Мегакаріоцити піддаються процесу, відомому як ендомітоз, за допомогою якого вони реплікують свої ядра, але нездатні піддаватись поділу, і через це дають початок поліплоїдним клітинам. Як реакція на знижену кількість тромбоцитів, швидкість ендомітозу зростає, утворюються мегакаріоцити вищої плоїдності, і кількість мегакаріоцитів може зрости 3-кратною Дивись, Harker, J. Clin. Invest., 47 458-465 (1968). Навпаки, як реакція на підвищену кількість тромбоцитів, швидкість ендомітозу падає, утворюються мегакаріоцити нижчої плоїдності, і кількість мегакаріоцитів може знизитись на 50%. Точний фізіологічний механізм зворотного зв'язку, за допомогою якого маса циркулюючих тромбоцитів регулює ендомітотичну швидкість та кількість мегакаріоцитів кісткового мозку, невідомий. Тромбопоетичним фактором крові, що задіяний в опосередкуванні цієї петлі зворотного зв'язку, є, як тепер вважають, тромбопоетин (ТРО). Більш конкретно, ТРО, як було показано, є основним гуморальним регулятором у ситуаціях, що включають тромбоцитопенію. Дивись, наприклад, Metcalf, Nature, 369:519-520 (1994). Як було встановлено у ряді досліджень, ТРО підвищує кількість тромбоцитів, збільшує розмір тромбоцитів та підсилює введення ізотопів у тромбоцити тваринреципієнтів. Зокрема, ТРО, як вважають, впливає на мегакаріоцитопоез кількома шляхами: (1) він спричиняє збільшення розміру мегакаріоцитів та їх кількості; (2) він спричиняє зростання вмісту ДНК, у 5 формі поліплоїдії, у мегакаріоцитах, (3) він підвищує ендомітоз мегакаріоцитів, (4) він спричиняє підсилене визрівання мегакаріоцитів; і (5) спричиняє зростання відсотку клітин-попередників, у формі невеликих ацетилхолінестераза-позитивних клітин у кістковому мозку. Тромбоцити потрібні для згортання крові. Коли їх кількість дуже низька, пацієнт має значний ризик померти від катастрофічної кровотечі. Тому ТПО має можливе корисне застосування як у діагнозі так і лікуванні різних гематологічних розладів, наприклад, хвороб, що спричинені, головним чином, дефектами тромбоцитів. Клінічні випробування ТРО, які продовжуються, вказують на те, що ТРО може без всякої небезпеки призначатись пацієнтам. Крім того, недавні дослідження запровадили основу для прогнозування ефективності ТРО терапії у лікуванні тромбоцитопенії і, зокрема, тромбоцитопенії, спричиненої хіміотерапією, радіаційною терапією або трансплантацією кісткового мозку як лікуванням раку або лімфоми. Дивись, наприклад, McDonald, Am. J. Ped. Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992). Ген, що кодує ТРО, був клонований та охарактеризований. Дивись, Kuter, et al., Proc Natl Acad. Sci USA, 91:11104-11108 (1994); Barley, et al., Cell 77:1117-1124(1994); Kaushansky et al., Nature 369:568-571 (1994); Wendling, et al., Nature, 369:571-574 (1994), та Sauvage et al., Nature 369:533-538 (1994). Тромбопоетин є глікопротеїном, що має принаймні дві форми, з приєднаними молекулярними масами 25 кДа та 31 кДа, із загальною N-кінцевою амінокислотною послідовністю. Дивись, Barley, et al., Cell, 77:1117-1124 (1994). Тромбопоетин має, мабуть, дві окремі ділянки, розділені потенційним Arg-Arg сайтом розщеплення. Аміно-кінцева ділянка є сильно консервативною у людини та миші, і має деяку гомологію з еритропоетином та інтерфероном-а, і інтерфероном-b. Карбокси-кінцева ділянка виявляє широку видову дивергенцію. ДНК послідовності та кодовані пептидні послідовності для людського TPO-R (також відомого як c-mpl) описані. Дивись, Vigon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5640-5644 (1992). TPO-R є членом родини рецепторів гематопоетинового фактору росту, родини, що характеризується спільною структурною схемою екстрацелюлярного домену, включаючи чотири консервативних С залишки у Nкінцевій частині та WSXWS мотив (SEQ ID NO:1) поблизу трансмембранної ділянки. Дивись, Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6934-6938 (1990). Доказ того, що цей рецептор відіграє функціональну роль у гематопоезі, включає спостереження, що його експресія обмежується селезінкою, кістковим мозком або фетальною печінкою у мишей (дивись, Souyri, et al., Cell 63:1137-1147 (1990)), і мегакаріоцитами, тромбоцитами та CD34+ клітинами у людей (дивись, Methia, et al., Blood 82:13951401 (1993)). Крім того, експозиція CD34+ клітин до синтетичних олігонуклеотидів, антизмістових генів щодо mpl РНК, у значній мірі інгібує виникнення мегакаріоцитних колоній без впливу на утворення еритроїдних або мієлоїдних колоній. Деякі дослідники постулюють, що даний рецептор 96418 6 діє як гомодимер, подібно до ситуації з рецепторами для G-CSF та еритропоетину. Наявність клонованих генів для TPO-R полегшує пошук агоністів цього важливого рецептора. Наявність рекомбінантного рецепторного білка дозволяє вивчати взаємодію рецептор-ліганд у множині систем, що генерують різновиди білків у випадкових та напіввипадкових режимах. Ці системи розкриті у патентах США за номерами 6251864, 6083913, 6121238, 5932546, 5869451, 5506362 та 6456430 та у роботі Cwira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990); на які у даній заявці зроблені посилання. Повільне відновлення рівнів тромбоцитів у пацієнтів, що потерпають від тромбоцитопенії, являє серйозну проблему, і це вимагає негайного пошуку агоніста фактора росту крові, що здатен прискорити регенерацію тромбоцитів, Даний винахід запроваджує такий агоніст. Стислий виклад винаходу Даний винахід спрямований на визначені пептидні сполуки з низькою молекулярною вагою, що мають сильні зв'язувальні властивості з TPO-R, можуть активувати TPO-R і потенційно дають знижені побічні ефекти у порівнянні з відомими ТРО агоністами. Відповідно, дані пептидні сполуки можуть бути корисними для терапевтичних цілей при лікуванні станів, опосередкованих ТРО (наприклад, тромбоцитопенії, спричиненої, хіміотерапією, радіаційною терапією або трансплантацією кіткового мозку), так само як і для діагностичних цілей при вивченні механізму гематопоезу і для in vitro поширення мегакаріоцитів та "навчених" антигеном клітин-попередників. Пептидні сполуки, придатні для терапевтичних та/або діагностичних цілей, мають ІС50 приблизно 2 мМ або менше, як визначено, наприклад, за допомогою проби на афінність зв'язування, проведеної у Прикладі 3 патенту США за номером 5869451, де менше значення ІС50 корелює з сильнішою афінністю зв'язування з TPO-R. Аналіз у патенті США за номером 5869451 полягає у наступному: афінності зв'язування пептидних сполук вимірюються у конкурентній пробі на зв'язування. Комірки мікротитрувального планшета покриваються 1 мг стрептавідину, блокуються PBS/1% BSA з наступним додаванням 50 нг біотинільованого імобілізуючого антитіла проти рецептора (Аb179). Потім комірки обробляються 1:10 розведенням розчинного TPO-R біоптату. Різні концентрації пептидної сполуки змішуються з постійною кількістю зрізаної форми ТРО, що складається із залишків 1-156, злитих з С-кінцем зв'язуючого мальтозу протеїну (МВР-ТРО156). Пептидні МВРТРО156 суміші додаються до покритих TPO-R комірок, інкубуються протягом 2 годин при 4°C і потім промиваються PBS. Кількість МВР-ТРО, що зв'язується при рівновазі, вимірюється шляхом додавання кролячої антисироватки, спрямованої проти МБР, потім кон'югованого лужною фосфатазою козлиного IG проти кроля. Потім кількість лужної фосфатази у кожній комірці визначається з використанням стандартних методів. Даний аналіз проводиться в області концентрацій пептидної сполуки, і результати використовують для побудо 7 ви графіка, де вісь у репрезентує кількість зв'язаного МВР-ТРО, а вісь x - концентрацію пептидної сполуки. Потім можна визначити концентрацію, при якій дана пептидна сполука знизить на 50% (ІС50) кількість МВР-ТРО, зв'язаного з імобілізованим TPO-R. Константа дисоціації (Kd) для даного пептиду має бути схожою з виміряним ІС50 з використанням цих умов аналізу. Для фармацевтичних цілей пептидні сполуки мають, краще, ІС50 не більше, ніж приблизно 100 мкМ, ще краще, не більше, ніж 500 нМ. У варіанті, якому віддається перевага, молекулярна вага даної пептидної сполуки складає від приблизно 250 до приблизно 8000 дальтонів (Да). Якщо пептидна сполука даного винаходу олігомеризована, димеризована та/або дериватизована гідрофільним полімером як тут описано, молекулярна вага таких пептидних сполук буде у значній мірі більшою і буде варіювати десь від приблизно 500 до приблизно 120000 Да, ще краще, від приблизно 8000 до приблизно 80000 Да. При застосуванні для діагностичних цілей пептидні сполуки даного винаходу, краще, мітять визначуваною міткою, і, відповідно, пептидні сполуки без такої мітки слугують проміжними сполуками у приготуванні мічених пептидних сполук. Пептидна сполука, що задовольняє визначеним критеріям щодо молекулярної ваги та афінності зв'язування для TPO-R, включає 9 або більше амінокислот, де дані амінокислоти є природними або синтетичними (неприродними) амінокислотами. Відповідно, пептидні сполуки, яким віддається перевага, включають сполуку, що має: (1) молекулярну вагу, меншу приблизно 5000 Да, та (2) афінність зв'язування до TPO-R, виражену ІС50, не більшу, ніж приблизно 100 мкМ, де від нуля до всіх -C(O)NH- зв'язків даної пептидної сполуки замінено на зв'язок, котрий вибирається із групи, яка складається із -СН2ОС(О)NRзв'язку; фосфонатного; CH2S(O)2NR-зв'язку; б СН2NR-зв'язку; -С(О)NR -зв'язку та -NНС(О)NН6 зв'язку, де R є воднем або нижчим алкілом, і R є нижчим алкілом, і де N-кінець зазначеної пептидної сполуки ви1 бирається із групи, яка складається із -NRR групи; -NRC(O)R групи, -NRC(O)OR групи; -NRS(O)2R групи -NHC(O)NHR групи; сукцинімідної групи; бензилоксикарбоніл-NН-групи; та бензилоксикарбоніл-NН-групи, що має від 1 до 3 замісників на фенільному кільці, котрі вибираються із групи, що складається із нижчого алкілу, нижчого алкокси, 1 хлоро та бромо, де R тa R вибираються, незалежно, із групи, яка складається із водню та нижчого алкілу, і де С-кінець зазначеної пептидної сполуки 2 2 має формулу -C(O)R , де R вибирається із групи, яка складається із гідрокси, нижчого алкокси, і 3 4 3 4 NR R , де R та R вибираються, незалежно, із групи, що складається із водню та нижчого алкілу, 3 4 і де атом азоту -NR R групи може, при потребі, бути аміногрупою N-кінця даного пептиду, утворюючи у такий спосіб циклічний пептид, і їх фізіологічно прийнятні солі. 96418 8 У спорідненому варіанті даний винахід спрямований на мічену пептидну сполуку, що включає пептидну сполуку, описану вище, котра має приєднану до неї ковалентним зв'язком мітку, яка може виявлятись. В одному варіанті серцевинна пептидна сполука включає послідовність амінокислот (SEQ ID NO:2) Х9Х8 G Х1 Х2 Х3 Х4 Х5 Х6 Х7 де Х9 являє собою А, С, Е, G, І, L, М, Р, R, Q, S, Τ або V; і Х8 є А, С, D, Е, K, L, Q, R, S, Τ або V; і X6 є -(2-нафтил)аланіновий (на який тут посилаються як на "2-Nal") залишок. Краще, Х9 є А або I; і Х8 є D, Ε або K. Крім того, Х1 є С, L, М, Р, Q, V; Х2 є F, K, L, N, Q, R, S, Τ або V; Х3 є С, F, I, L, M, R, S, V або W; X4 являє собою будь-яку із 20 генетично закодованих L-амінокислот; Х5 є A, D, Е, G, K, М, Q, R, S, Т, V або Υ; і Х7 є С, G, І, K, L, Μ, Ν, R або V. Пептидна сполука, якій віддається особлива перевага, включає амінокислотну послідовність І Ε G Ρ Τ L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) (SEQ ID NO:7), де (2-Nal) є -(2-нафтил)аланіном, і (Sar) є саркозином. В іншому варіанті пептидні сполуки даного винаходу є, краще, димеризованими або олігомеризованими для підвищення афінності та/або активності сполук. Приклад димеризованої пептидної сполуки, якій віддається перевага, включає, проте не обмежуючись цим, наступну: де Х10 саркозиновий або -аланіновий залишок (SEQ ID NO:7). Наведена вище структура може бути також репрезентована наступною структурою: (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2. Коли Х10 є саркозином, дана сполука має наступну структуру: де (2-Nal) є -(2-нафтил)аланіном, і (Sar) є саркозином (SEQ ID NO:7). На цю пептидну сполуку, котра може бути також репрезентована наступною структурою. (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR(Sar))2KNH2, у даному тексті посилаються також як на "ТРО сполука No. 1"). У ще одному варіанті пептидні сполуки для застосування у даному винаході, яким віддається 9 перевага, включають пептидні сполуки, котрі приєднані ковалентним зв'язком до одного або кількох із різновиду гідрофільних полімерів. Придатні гідрофільні полімери включають, проте не обмежуючись цим, поліалкілефіри, як, наприклад, поліетиленгліколь та поліпропіленгліколь, полімолочна кислота, полігліколева кислота, поліоксиалкени, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, целюлоза та похідні целюлози, декстран та декстранові похідні і т.д, як описано у патенті США за номером 5869451, на який у даній заявці зроблено повне посилання. Пептидні сполуки, що тут описані, корисні для запобігання та лікування хвороб, опосередкованих ТРО, і зокрема, для лікування гематологічних розладів, включаючи, проте не обмежуючись цим, тромбоцитопенію, спричинену хіміотерапією, радіаційною терапією або трансфузіями кісткового мозку. Таким чином, даний винахід також запроваджує спосіб лікування, в якому пацієнт, що має розлад, котрий піддається лікуванню ТРО агоністом, отримує або застосовує терапевтично ефективну дозу або кількість пептидної сполуки даного винаходу. Даний винахід також запроваджує фармацевтичні композиції, що містять одну або кілька пептидних сполук, що тут описані, та фізіологічно прийнятний носій Ці фармацевтичні композиції можуть бути у різновиді форм, включаючи пероральні лікарські форми, так само як і вдихувані порошки і розчини, і розчини для ін'єкцій та інфузій. Стислий опис фігур Фігура 1 показує і порівнює активність ТРО Сполуки No 1 з пептидною сполукою із попереднього доробку (на яку посилаються у даній заявці як на "пептидну сполуку із попереднього доробку"). Відмінність між ТРО Сполукою No 1 та пептидною сполукою із попереднього доробку полягає у тому, що пептидна сполука із попереднього доробку має -(1-нафтил)аланін (1-Nal), тоді як (2-Nal) стосується ТРО Сполуки No 1. Фігура 2 показує та порівнює активність РЕGільованої ТРО Сполуки No 1 з РЕGільованою пептидною сполукою із попереднього доробку. Фігура 3 показує та порівнює in vivo зміни кількості тромбоцитів у щура, котрі демонструють відносну активність PEGільованої ТРО Сполуки No 1 з PEGільованою пептидною сполукою із попереднього доробку. Фігури 4 та 5 показують та порівнюють кількість та об'єм тромбоцитів у крові у залежності від дози, відповідно, при застосуванні PEGільованої пептидної сполуки із попереднього доробку та при застосуванні PEGільованої ТРО Сполуки No 1. Фігура 6 показує, що окремі внутрішньовенні дози PEGільованої ТРО Сполуки No 1 (30, 100 або 300 мкг/кг) спричиняють підвищену кількість периферичних тромбоцитів у нормальних самців щурів Wistar. Фігура 7 показує РК, концентраційно-часові профілі PEGільованої ТРО Сполуки No 1 у здорових чоловіків-добровольців: чорні квадратики PEGільована ТРО Сполука No 1, 0,75 мкг/кг внутрішньовенно; незаштриховані ромби PEGільована ТРО Сполука No 1, 1,5 мкг/кг внутрі 96418 10 шньовенно; чорні трикутники, спрямовані вгору PEGільована ТРО Сполука No 1, 2,25 мкг/кг внутрішньовенно; незаштриховані трикутники, спрямовані вниз - PEGільована ТРО Сполука No 1, 1,3 мкг/кг внутрішньовенно. Фігура 8 показує, що кількість тромбоцитів підвищувалась у залежності від дози у здорових чоловіків-добровольців після застосування PEGільованої ТРО Сполуки No 1. Фігура 9 показує, що ендогенні ТРО рівні підвищувались у залежності від дози у здорових чоловіків-добровольців після застосування PEGільованої ТРО Сполуки No 1. Опис характерних варіантів І. Визначення та загальні параметри Наступні визначення запроваджені для ілюстрації та визначення сенсу та обсягу різних термінів, що застосовуються в даному тексті для опису винаходу. "Агоніст" стосується біологічно активного ліганду, котрий зв'язується зі своїм комплементарним біологічно активним рецептором і активує останній, спричиняючи біологічну реакцію у даному рецепторі або підсилюючи попередньо існуючу біологічну активність рецептора. "Пептидна сполука" стосується молекули, котра гідролізується до амінокислот та/або амінокислотних похідних, та/або амінокислотних замісників. Термін "фармацевтично прийнятні солі" стосується солей нетоксичного лужного металу, лужноземельного металу та амонієвих солей, що звичайно використовуються у фармацевтичній промисловості, включаючи натрієву, калієву, літієву, кальцієву, магнієву, барієву, амонієву та протамін цинкову солі, котрі одержуються з використанням способів, що добре відомі у даній галузі. Даний термін також включає нетоксичні кислі солі приєднання, котрі одержують, загалом, за реакцією сполук даного винаходу з придатною органічною або неорганічною кислотою. Репрезентативні солі включають хлористоводневу, бромистоводневу солі, сульфат, бісульфат, ацетат, оксалат, валерат, олеат, лаурат, борат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафзилат і таке подібне. "Фармацевтично прийнятна кисла сіль приєднання" стосується таких солей, що зберігають біологічну ефективність та властивості вільних основ, і котрі не є небажаними з біологічної або іншої точки зору, і котрі утворюються з використанням неорганічних кислот, таких як хлористоводнева кислота, бромистоводнева кислота, сірчана кислота, азотна кислота, фосфорна кислота і таке подібне, та органічних кислот, таких як оцтова кислота, пропіонова кислота, гліколева кислота, піровиноградна кислота, яблучна кислота, малонова кислота, бурштинова кислота, малеїнова кислота, фумарова кислота, винна кислота, лимонна кислота, бензойна кислота, корична кислота, мигдалева кислота, метансульфонова кислота, етансульфонова кислота, р-толуолсульфонова кислота, саліцилова кислота і таке подібне Щодо опису фармацевтично прийнятних кислих солей приєднання як промедикаментів дивись, Bundgaard, Η., вище. 11 "Фармацевтично прийнятний ефір" стосується таких ефірів, котрі зберігають, при гідролізі ефірного зв'язку, біологічну ефективність та властивості карбонової кислоти або спирту, і не є небажаними у біологічному або іншому сенсі. Щодо опису фармацевтично прийнятних ефірів як промедикаментів дивись Bundgaard, Η.,ed. Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Ці ефіри звичайно одержуються із відповідних карбонової кислоти та спирту. Загалом, утворення ефіру може здійснюватись з використанням звичайних синтетичних методів (Дивись, наприth клад, March, Advanced Organic Chemistry, 4 Ed., John Wiley & Sons, New York (1992), 393-396 та цитовані там посилання, і Mark, et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980). Спиртовий компонент даного ефіру включає, загалом, (і) С2-12 аліфатичний спирт, що може або не може містити один або кілька подвійних зв'язків, і може або не може містити розгалужені вуглеці, або (іі) С7-12 ароматичні або гетероатомні спирти. Даний винахід також розглядає використання таких композицій, котрі є ефірами, як тут описано, і у той же час їх фармацевтично прийнятними кислими солями приєднання. "Фармацевтично прийнятний амід" стосується таких амідів, котрі зберігають, після гідролізу амідного зв'язку, біологічну ефективність та властивості карбонової кислоти або аміну, і не є небажаними у біологічному або іншому сенсі. Щодо опису фармацевтично прийнятних амідів як промедикаментів дивись Bundgaard, H.,ed. Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Ці аміди звичайно одержуються із відповідних карбонової кислоти та аміну. Загалом, утворення аміду може здійснюватись з використанням звичайних синтетичних методів. (Дивись, наприклад, March, th Advanced Organic Chemistry, 4 Ed., John Wiley & Sons, New York (1992), p. 393, і Mark, et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980). Даний винахід також розглядає використання таких композицій, котрі є амідами, як тут описано, і у той же час їх фармацевтично прийнятними кислими солями приєднання. "Фармацевтично або терапевтично прийнятний носій" стосується середовища носія, котре не погіршує ефективність або біологічну активність активних інгредієнтів, і котре не є токсичним до хазяїна або пацієнта. "Стереоізомер" стосується хімічної сполуки, яка має ту саму молекулярну вагу, хімічний склад та будову, що й інша, але з атомами, котрі згруповані в інший спосіб. Тобто деякі ідентичні хімічні складові мають відмінні орієнтації у просторі і тому, у чистому вигляді, мають здатність обертати площину поляризованого світла. Проте, деякі чисті стереоізомери можуть мати оптичне обертання, котре є таким слабким, що воно не виявляється сучасними інструментами. Сполуки даного винаходу можуть мати один або кілька асиметричних вуглецевих атомів і тому включають різні стереоізомери. Усі стереоізомери включені в обсяг даного винаходу. "Терапевтичноабо фармацевтичноефективна кількість" як застосовується до компо 96418 12 зицій даного винаходу, стосується кількості композиції, достатньої для індукування бажаного біологічного результату. Цим результатом може бути послаблення ознак, симптомів або причин хвороби, або будь-яка інша бажана зміна біологічної системи. У даному винаході зазначений результат включає, типово, зниження імунологічної та/або запальної реакцій на інфекцію або ушкодження тканини. Амінокислотні залишки у пептидах мають наступні скорочення: Фенілаланін - Phe або F; Лейцин - Leu або L; Ізолейцин - IIе або І; Метіонін - Met або М; Валін - Val або V; Серин - Ser або S; Пролін - Pro або Р; Треонін - Thr або Т; Аланін - Ala або А; Тирозин - Tyr або Y; Гістидин - His або Н; Глутамін - Gln або Q; Аспарагін - Asn або N; Лізин - Lys або K; Аспарагінова кислота - Asp або D; Глутамінова кислота - Glu або Е; Цистеїн - Cys або С; Триптофан - Тrр або W; Аргінін - Arg або R; Гліцин - Gly або G. Крім того, t-Buo є трет-бутилокси, Bzl - бензил, СНА - циклогексиламін, Ac - ацетил, Me - метил, Pen - пеніциламін, Aib - аміноізомасляна кислота, Nva - норвалін, Abu - аміномасляна кислота, Тhi - тієнілаланін, Obn - О-бензил, і hyp - гідроксипролін. Пептидні аналоги звичайно застосовуються у фармацевтичній промисловості як непептидні ліки з властивостями, аналогічними до властивостей еталонного пептиду. Ці типи непептидних сполук називаються "пептидміметиками" або "пептидними міметиками", або "пептидоміметиками" (Luthman, et al., A Textbook of Drug Design and Development, nd 14:386-406, 2 Ed., Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante, Angew Chem. Int. Ed. Engl., 33:1699-1720 (1994); Fauchere, J. Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS, p. 392 (1985); and Evans, et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987), на які у даній заявці зроблені посилання). Пептидні міметики, котрі структурно подібні до терапевтично корисних пептидів, можуть використовуватись для продукування еквівалентного або підсиленого терапевтичного або профілактичного ефекту. Загалом, пептидоміметики структурно схожі зі зразковим поліпептидом (тобто поліпептидом, що має біологічну або фармакологічну активність), таким як природний поліпептид, що зв'язує рецептор, але має один або кілька пептидних зв'язків, що заміщені, при потребі, альтернативним зв'язком, таким як -СН2NН-, -CH2S-, і т.д., за допомогою методів, відомих у даній галузі і додатково описаних у наступних роботах Spatola, A.F. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A,F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm. Sci. pp. 463-468 (1980), (general review); Hudson et al., Int. J. Pept Prot. Res., 14:177-185 (1979); Spatola, et al., Life Sci., 38:1243-1249 (1986); Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 307-314 (1982); Almquist, et al., J. Med Chem., 23:1392-1398 (1980); Jennings-White, et al., Tetrahedron Lett. 23:2533 (1982); Szelke, et al., European Appln. EP 45665 (1982); Holladay, et al., tetrahedron Lett., 24:44014404 (1983); та Hruby, Life Sci., 31:189-199 (1982); 13 на кожну із яких у даній заявці зроблено посилання. Непептидним зв'язком, якому віддається особлива перевага, є -CH2NH-. Такі пептидні міметики можуть мати значні переваги щодо поліпептидних варіантів, включаючи, наприклад більш економічне виробництво, більшу хімічну стабільність, підсилені фармакологічні властивості (період піврозпаду, абсорбція, активність, ефективність і т.д.), змінену специфічність (наприклад, широкий спектр біологічних активностей), знижену антигенність та інші Маркування пептидоміметиків звичайно включає ковалентне приєднання однієї або кількох міток, безпосередньо або через спейсер (наприклад, амідну групу), у положення невтручання на пептидоміметику, котрі передбачені кількісними даними, що стосуються структурної активності та/або молекулярного моделювання. Такими положеннями невтручання є, загалом, положення, що не утворюють прямих контактів з макромолекулою(ами) (наприклад, молекули імуноглобулінової суперродини), з якими зв'язується пептидоміметик, продукуючи терапевтичний ефект. Деривація (наприклад, маркування) пептидоміметиків не повинна у значній мірі впливати на потрібну біологічну чи фармакологічну активність даного пептидоміметика. Загалом, пептидоміметики пептидів, що зв'язують рецептор, зв'язуються з рецептором з високою спорідненістю і мають виявлювану біологічну активність (тобто є агоністичними або антагоністичними щодо однієї або кількох фенотипічних змін, опосередкованих рецептором). Систематичне заміщення однієї або кількох амінокислот консенсусної послідовності Dамінокислотою того самого типу (наприклад, Dлізин замість L-лізину) може бути використано для генерування більш стабільних пептидів Крім того, загальмовані пептиди, що містять консенсусну послідовність або варіацію суттєво ідентичної консенсусної послідовності, можуть бути генеровані з використанням методів, котрі відомі у даній галузі (Rizo, et al., Ann Rev. Biochem., 61:387 (1992), на яку у даній заявці зроблено посилання), наприклад, шляхом додавання внутрішніх цистеїнових залишків, здатних формувати внутрішньомолекулярні дисульфідні містки, котрі циклізують даний пептид. "Виявлювана мітка" стосується матеріалів, котрі, при ковалентному приєднанні до пептидних сполук даного винаходу, дозволяють виявляти пептидні сполуки in vivo у пацієнта, якому дана пептидна сполука була призначена. Придатні виявлювані мітки добре відомі у даній галузі і включають, наприклад, радіоізотопи, флуоресцентні мітки (наприклад, флуоресцеїн) і таке подібне. Конкретна застосована виявлювана мітка не є критичною і вибирається з урахуванням її кількості і так само її токсичності при даній кількості. Вибір даної мітки з урахуванням таких чинників добре відомий фахівцям у даній галузі. Ковалентне приєднання виявлюваної мітки до пептидної сполуки здійснюється з використанням звичайних методів, що добре відомі у цій галузі. Наприклад, коли як виявлювану мітку використо125 125 вують радіоізотоп І, ковалентне приєднання І до пептичної сполуки може досягатись шляхом 96418 14 уведення тирозину у пептидну сполуку і потім йодування даної пептидної сполуки (дивись, наприклад, Weaner, et al., Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds, pp. 137-140 (1994)) Уведення тирозину у N або С кінець даної пептидної сполуки може досягатись з використан32 ням добре відомої хімії. Подібно до цього, Ρ може вводитись у пептидну сполуку як фосфатна складова, наприклад, через гідроксильну групу пептидної сполуки з використанням звичайної хімії. II. Огляд Даний винахід запроваджує пептидні сполуки, що зв'язуються з та активують TPO-R, або, інакше, поводять себе як ТРО агоніст. Ці пептидні сполуки включають "первинні" пептидні сполуки та "похідні" пептидні сполуки, котрі побудовані у такий спосіб, що мають таку саму або схожу молекулярну структуру або форму як і первинні пептидні сполуки, але котрі відрізняються від первинних пептидних сполук щодо схильності до гідролізу або протеолізу та/або щодо інших біологічних властивостей, таких як підвищена спорідненість до рецептора. Даний винахід також запроваджує композиції, що включають ефективну кількість пептидної сполуки і, більш конкретно, пептидної сполуки, що корисна для лікування гематологічних розладів, і, зокрема, тромбоцитопенії, пов'язаної з хіміотерапією, радіаційною терапією або трансфузіями кісткового мозку. Було знайдено, що серцевинна пептидна сполука може включати послідовність амінокислот: (SEQ ID NO:2): Х9Х8 G Х1 Х2 Х3 Х4 Х5 Х6 X7, де Х6 може бути -(2-нафтил)аланіном, і де Х9 являє собою А, С, Е, G, І, L, М, Р, R, Q, S, Τ або V; і Х8 є А, С, D, Е, K, L, Q, R, S, Τ або V. Краще, Х9 є А або І; і Х8 є D, Ε або K. Крім того, Х1 є С, L, М, Р, Q, V, Х2 є F, K, L, N, Q, R, S, Τ або V; Х3 є С, F, I, L, M, R, S, V або W, X4 являє собою будь-яку із 20 генетично закодованих L-амінокислот; Х5 є A, D, Е, G, K, М, Q, R, S, Т, V або Υ; і Х7 є С, G, I, K, L, Μ, Ν, R або V. Проте, як тут додатково описано, було знайдено, що шляхом заміни Х6 на -(2-нафтпл)аланін дана сполука запроваджує властивості, відмінні від сполуки, яка містить -(1-нафтил)аланін. Відповідно, пептидна сполука, якій віддається особлива перевага, включає амінокислотну послідовність (SEQ ID NO:7): І Ε G Ρ Τ L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) В іншому варіанті пептидні сполуки даного винаходу є, краще, димеризованими або олігомеризованими для підвищення афінності та/або активності сполук. Приклад димеризованої пептидної сполуки, якій віддається перевага, включає, проте не обмежуючись цим, наступну: 15 де Х10 саркозиновий або -аланіновий залишок (SEQ ID NO:7). Слід зазначити, що один Х10 залишок може бути саркозином а другий залишок може бути -аланіном. Наведена вище структура може бути також репрезентована наступною структурою (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2. Пептидна сполука, якій віддається перевага, наступна: де (2-Nal) є -(2-нaфтил)aлaнiнoм, і (Sar) є саркозином (SEQ ID NO.7) На цю пептидну сполуку у даному тексті посилаються як на "ТРО сполука No. 1". Пептидним сполукам, які мають ІС50 більше приблизно 100 мМ, бракує достатнього зв'язування, щоб вони могли використовуватись у діагностичному або терапевтичному аспектах даного винаходу Краще, коли для діагностичних цілей пептидні сполуки мають ІС50 приблизно 2 мМ або менше, і для фармацевтичних цілей дані пептидні сполуки мають ІС50 приблизно 100 мкМ або менше. На Фігурі 1 порівнюється активність трьох різних партій ТРО Сполуки No 1 з однією партією пептидної сполуки із попереднього доробку з використанням стандартної методики аналізу відносних люмінесцентних одиниць. У даному аналізі використовуються мишачі клітини, сконструйовані таким чином, щоб стабільно експресувати людський ТРО рецептор, і конструкт люциферазного репортера, стимульованого fos промотором. Відмінність між ТРО Сполукою No 1 та пептидною сполукою із попереднього доробку полягає у тому, що пептидна сполука із попереднього доробку має -(1-нафтил)аланін (1-Nal), де (2-Nal) знаходиться на ТРО Сполуці No 1. На Фігурі 1 на ТРО Сполуку No 1 посилаються як на 2-Nal, і на пептидну сполуку із попереднього доробку посилаються як на 1Nal (Попередній доробок). Як показано на Фігурі 1, активність схожа для всіх сполук. На Фігурі 2 порівнюється активність кількох різних партій PEGільованої ТРО Сполуки No 1 (pegілування сполук даного винаходу більш детально описано нижче). Обидві партії PEGільованої пептидної сполуки із попереднього доробку виявляють високу активність із у значній мірі таким самим рівнем активності, що й у не-PEGільованої пептидної сполуки із попереднього доробку. Решта ліній ілюструє активність різних партій PEGільованої ТРО Сполуки No 1. Як показано на Фігурі 2, у цій моделі остання має меншу активність відносно PEGільованих пептидних сполук із попереднього доробку, на Фігурі 2 на PEGільовану ТРО Сполуку No 1 посилаються як на PEG-2-Nal, і на PEGільовану пептидну сполуку із попереднього 96418 16 доробку посилаються як на PEG-1-Nal (Попередній доробок). Фігура 3 демонструє відносну активність PEGільованої пептидної сполуки із попереднього доробку та PEGільованої ТРО Сполуки No 1. На щуриній моделі Фігура 3 показує in vivo зміни у кількості тромбоцитів після застосування PEGільованої пептидної сполуки із попереднього доробку та PEGільованої ТРО Сполуки No 1. Як показано на Фігурі 3, найвища доза PEGільованої ТРО Сполуки No 1 має таку саму активність як і найнижча доза PEGільованої пептидної сполуки із попереднього доробку. Менш активна сполука може запровадити менш інтенсивне подразнення клітини-мішені, що може знизити ризик побічних ефектів, спричинених надлишковим подразненням клітини-мішені, таких як загострена тромбоцитопенія після наступного циклу хіміотерапії. На Фігурі 3 на PEGільовану ТРО Сполуку No 1 посилаються як на PEG-2-Nal, і на PEGільовану пептидну сполуку із попереднього доробку посилаються як на PEG-1-Nal (Попередній доробок). Фігури 4 та 5 показують результати дослідження реакції на застосовану дозу PEGільованої пептидної сполуки із попереднього доробку та PEGільованої ТРО Сполуки No 1 у нормальних мишей у прямому співставленні. На Фігурах 4 та 5 на PEGільовану ТРО Сполуку No 1 посилаються як на PEG-2-Nal, і на PEGільовану пептидну сполуку із попереднього доробку посилаються як на PEG-1-Nal (Попередній доробок). Фігура 4 показує зростання рівнів тромбоцитів, і Фігура 5 показує середній об'єм тромбоцитів за 6 діб після лікування. Область дозування була у межах 10-3000 мкг/кг. Обидві пептидні сполуки підвищували кількість тромбоцитів у кровотоці у залежності від дози у порівнянні з підвищеннями у контрольній групі, що спостерігались при таких низьких дозах як 30 мкг/кг для обох сполук. При максимальній реакції ці пептидні сполуки підвищували кількості тромбоцитів до рівнів, котрі до 4-х разів перевищували контрольні значення. Криві доза-реакція для цих пептидних сполук були вельми схожі, вказуючи на те, що у цій моделі не було значної відмінності між зазначеними двома випробуваними предметами, виходячи із цих кінцевих точок. IV Одержання пептидних сполук А. Твердофазовий синтез Пептидні сполуки даного винаходу можуть бути одержані з використанням класичних способів, відомих у даній галузі, наприклад, шляхом застосування стандартних твердофазових методів. Стандартні методи включають ексклюзивний твердофазовий синтез, методи парціального твердофазового синтезу, фрагментарну конденсацію, класичний синтез у розчині і навіть рекомбінантну ДНК технологію. Дивись, наприклад, Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963), на яку у даному тексті зроблено посилання. У твердій фазі даний синтез звичайно починається з С-кінця даного пептиду з використанням альфа-аміно захищеної смоли. Придатний вихідний матеріал може бути одержаний, наприклад, шляхом приєднання потрібної альфа-амінокислоти до хлорометильованої смоли, гідроксиметил смоли або бензгідриламіно 17 вої смоли. Одна така хлорометильована смола є у продажу під торгівельною назвою ΒΙΟ-BEADS SX1 від фірми Bio Rad Laboratories, Richmond, CA, а одержання даної гідроксиметил смоли описано у роботі Bodonszky, et al., Chem. Ind. (London), 38:1597 (1966) Бензгідриламінова (BHA) смола описана Pietta and Marshall, Chem. Commn , 650 (1970), і вона продається у хлорогідратній формі фірмою Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, Calif. Так, пептидні сполуки даного винаходу можуть бути одержані шляхом сполучення альфа-аміно захищеної амінокислоти з хлорометильованою смолою за допомогою, наприклад, цезій бікарбонатного каталізатора, згідно зі способом, що описаний Gisin, Helv. Chim. Acta, 56:1467 (1973). Після первинного сполучення альфа-аміно захисна група вилучається шляхом вибору реагентів, включаючи розчини трифторооцтової кислоти (TFA) або хлористоводневої кислоти (НС1) в органічних розчинниках при кімнатній температурі. Альфа-аміно захисними групами є ті, що, як відомо, корисні у галузі постадійного синтезу пептидів. Сюди входять захисні групи ацильного типу (наприклад, форміл, трифтороацетил, ацетил), захисні групи типу ароматичного уретану (наприклад, бензилоксикарбоніл (Cbz) і заміщений Cbz), захисні групи типу аліфатичного уретану (наприклад, t-бутилоксикарбоніл (Вос), ізопропілоксикарбоніл, циклогексилоксикарбоніл) та захисні групи алкільного типу (наприклад, бензил, трифенілметил). Захисними групами, яким віддається перевага, є Вос та Fmoc. Захисна група бічного ланцюга залишається неторканою підчас сполучення і не відщеплюється підчас депротектування амінокінцевої захисної групи або підчас сполучення. Захисна група бічного ланцюга має бути здатною до вилучення по завершенню синтезу кінцевого пептиду і за умов реакції, що не змінять даного потрібного пептиду. Захисні групи бічного ланцюга для Tyr включають тетрагідропіраніл, трет-бутил, тритіл, бензил, Cbz, Z-Br-Cbz та 2,6-дихлоробензил. Захисні групи бічного ланцюга для Asp включають бензил, 2,6-дихлоробензил, метил, етил та циклогексил. Захисні групи бічного ланцюга для Thr та Ser включають ацетил, бензоїл, тритіл, тетрагідропіраніл, бензил, 2,6-дихлоробензил та Cbz. Захисною групою бічного ланцюга для Thr та Ser є бензил. Захисні групи бічного ланцюга для Arg включають нітро, тозил (Tos), Cbz, адамантилоксикарбоніл мезитоїлсульфоніл (Mts) або Вос. Захисні групи бічного ланцюга для Lys включають Cbz, 2-хлоробензилоксикарбоніл (2-Сl-Cbz), 2бромобензилоксикарбоніл (2-BrCbz), Tos або Вос. Після вилучення альфа-аміно захисної групи решта захищених амінокислот сполучаються постадійно у потрібному порядку. Надлишок кожної захищеної амінокислоти використовується, загалом, з відповідним активатором карбоксильної групи, таким як дициклогексилкарбодіімід (DCC) у розчині, наприклад, у метиленхлоридних (СН2Сl2), диметилформамідних (DMF) сумішах. Після довершення потрібної амінокислотної послідовності бажаний пептид відділяють від смоляної підкладки шляхом обробки реагентом, таким 96418 18 як трифторооцтова кислота або фторид водню (HF), котрі не тільки відщеплюють даний пептид від смоли, але також відщеплюють усі залишкові захисні групи бічних ланцюгів. Коли використовується хлорометильована смола, обробка фторидом водню приводить до утворення вільних пептидних кислот. Коли використовується бензгідриламінова смола, обробка фторидом водню приводить до прямого утворення вільного пептидного аміду. Як альтернатива, коли використовується хлорометильована смола, захищений пептид бічного ланцюга може бути відділений шляхом обробки даної пептидної смоли аміаком з одержанням потрібного захищеного аміду бічного ланцюга або алкіламіном з одержанням захищеного алкіламіду або діалкіламіду бічного ланцюга. Захист бічних ланцюгів потім знімають у звичайний спосіб шляхом обробки фторидом водню з одержанням вільних амідів, алкіламідів або діалкіламідів. Розглянуті процедури твердофазового пептидного синтезу добре відомі у даній галузі і додатково описані John Morrow Stewart and Janis Dillaha nd Young, Solid Phase Peptide Syntheses (2 Ed , Pierce Chemical Company, 1984). В. Синтетичні амінокислоти Ці процедури можуть також використовуватись для синтезу пептидів, в яких амінокислоти, відмінні від 20 природних, генетично кодовані амінокислоти заміщені в одному, двох або більше положеннях будь-яких сполук даного винаходу. Можливо замінити природні бічні ланцюги 20 генетично кодованих амінокислот (або D амінокислот) іншими бічними ланцюгами, наприклад, групами, такими як алкіл, нижчий алкіл, циклічний 4-, 5-, 6-, 7- членний алкіл, амід, амід нижчий алкіл, амід ди(нижчий алкіл), нижчий, алкокси, гідрокси, карбокси та їх похідні нижчих ефірів, і 4-, 5-, 6-, 7членними гетероциклічними групами. Зокрема, можуть бути застосовані пролінові аналоги, в яких розмір кільця пролінового залишку змінився від 5членного до 4, 6 або 7-членного. Циклічні групи можуть бути насиченими або ненасиченими, і якщо ненасиченими, то можуть бути ароматичними або неароматичними. Гетероциклічні групи містять, переважно, один або кілька азотних, кисневих та/або сірчаних гетеро атомів. Приклади таких груп включають фуразнніл, фурил, імідазолідиніл, імідазоліл, імідазолініл, ізотіазоліл, ізоксазоліл, морфолініл (наприклад, морфоліно), оксазоліл, піперазиніл (наприклад, 1-піперазиніл), піперидил (наприклад, 1-піперидил, піперидино), піраніл, піразиніл, піразолідиніл, піразолініл, піразоліл, піридазиніл, піридил, піримідиніл, піролідиніл (наприклад, 1-піролідиніл), піролініл, піроліл, тіадіазоліл, тіазоліл, тієніл, тіоморфолініл (наприклад, тіоморфоліно), татриазоліл. Ці гетероциклічні групи можуть бути заміщеними або незаміщеними. Коли група заміщена, замісником може бути алкіл, алкокси, галоген, кисень або заміщений чи незаміщений феніл. Можна також легко модифікувати пептиди даного винаходу шляхом фосфорилування (дивись, наприклад, W. Bannwarth, et al., Biorganic and Medicinal Chemistry Letters, 6(17):2141-2146 19 (1996)), а інші методи для одержання пептидних похідних сполук даного винаходу описані у роботі Hruby, et al., Biochem. J., 268(2):249-262 (1990). Таким чином, пептидні сполуки даного винаходу також слугують основою для одержання пептидних міметиків зі схожою біологічною активністю. С. Кінцеві модифікації Фахівцям у даній галузі відомо, що існує різновид способів для конструювання пептидних сполук із такою самою або схожою бажаною біологічною активністю, що й відповідна пептидна сполука, але з більш сприятливою активністю, ніж пептидна сполука, у відношенні до розчинності, стабільності та схильності до гідролізу і протеолізу. Дивись, наприклад, Morgan, et al., Ann. Rep. Med. Chem., 24:243-252 (1989). Нижче описані способи одержання пептидних сполук, модифікованих по Nкінцевій аміногрупі, С-кінцевій карбоксильній групі, та/або зміни одного або кількох амідних зв'язків у даному пептиді на неамідний зв'язок. Зрозуміло, що дві або більше таких модифікацій можуть бути сполучені в одній структурі пептидноі сполуки (наприклад, модифікація по С-кінцевій карбоксильній групі та включення -СН2-карбаматного зв'язку між двома амінокислотами у даній пептидній сполуці). 1. N-кінцеві модифікації Пептидні сполуки, типово, синтезують як вільні кислоти, але, як зазначалось вище, вони можуть бути легко отримані як амід або ефір. Можна також модифікувати аміно та/або карбокси кінець пептидних сполук даного винаходу для продукування інших сполук даного винаходу. Модифікації аміно кінця включають метилування, ацетилювання, додавання бензилоксикарбонільної групи, або блокування аміно кінця за допомогою блокувальної групи, що містить карбоксилатну функціональну групу, яка визначається як RCOO-, де R вибирається із групи, котра складається із нафтилу, акридинілу, стероїдилу та схожих груп. Модифікації карбокси кінця включають заміну вільної кислоти карбоксамідною групою або формування циклічного лактаму на даному карбокси кінці для запровадження структурних обмежень. Модифікації аміно кінця є такими, як зазначено вище, і включають алкілування, ацетилювання, додавання карбобензоїльної групи, утворення сукцинімідної групи і т.д. (Дивись, наприклад, Murray, et al., Burger's Medicinal Chemistry and Drug th Discovery, 5 ed., Vol. 1, Manfred Ε Wolf, ed., John Wiley and Sons, Inc. (1995)). Зокрема, N-кінцева аміногрупа може потім піддаватись реакції у наступний спосіб: (а) з утворенням амідної групи формули RC(O)NH-, де R є таким як визначено вище, за реакцією з галоїдангідридом або симетричним ангідридом. Типово, дана реакція може проводитись шляхом контактування приблизно еквімолярної або надлишкової кількості (наприклад, приблизно 5 еквівалентів) галоїдангідриду з пептидом в інертному розріджувачі (наприклад, дихлорометані), що містить, краще, надлишок (наприклад, приблизно 10 еквівалентів) третинного аміну, такого як діізопропілетиламін, для вилучення кислоти, котра генерується підчас реакції. Умови реакції в інших відношеннях звичайні (наприклад, кімнатна 96418 20 температура, протягом 30 хвилин). Алкілування кінцевої аміногрупи для запровадження Nзаміщення нижчим алкілом з наступною реакцією з галоїдангідридом, як описано вище, дає N-алкіл амідну групу формули RC(O)NR-; (b) з утворенням сукцинімідної групи за реакцією з сукциновим ангідридом. Як і раніше, може бути застосована приблизно еквімолярна кількість або надлишок сукцинового ангідриду (наприклад, приблизно 5 еквівалентів), і дана аміногрупа перетворюється у сукцинімід з використанням методів, що добре відомі у даній галузі, включаючи використання надлишку (наприклад, десять еквівалентів) третинного аміну, такого як діізопропілетиламін, у придатному інертному розчиннику (наприклад, дихлорометані). Дивись, наприклад, Wollenberg, et al., патент США за номером 4612132, на який у даному тексті зроблено повне посилання. Зрозуміло, що сукцинова група може бути заміщена, наприклад, алкілом або -SR замісниками, котрі одержуються у звичайний спосіб, із запровадженням заміщеного сукциніміду в N-кінці даного пептиду. Такі алкільні замісники одержуються за реакцією нижчого олефіну з малеїновим ангідридом у спосіб, що описаний Wollenberg, et al., вище, і -SR замісники одержуються за реакцією RSH з малеїновим ангідридом, де R є таким як описано вище; (c) з утворенням бензилоксикарбоніл-ΝH- або заміщеної бензилоксикарбоніл-NH-групи за реакцією з приблизно еквівалентною кількістю або надлишком CBZ-C1 (тобто бензилоксикарбонілхлорид) або заміщеного CBZ-C1 у придатному інертному розріджувачі (наприклад, дихлорометані), що містить, краще, третинний амін для вилучення кислоти, котра генерується підчас цієї реакції; (d) з утворенням сульфонамідноі групи за реакцією з еквівалентною кількістю або надлишком (наприклад, 5 еквівалентів) R-S(O)2Cl у придатному інертному розріджувачі (дихлорометані) для перетворення кінцевого аміну у сульфонамід, де R є таким як визначено вище. Краще, коли інертний розріджувач містить надлишковий третинний амін (наприклад, десять еквівалентів), такий як діізопропілетиламін, для вилучення кислоти, котра генерується підчас реакції. Умови реакції в інших відношеннях звичайні (наприклад, кімнатна температура, протягом 30 хвилин); (e) з утворенням карбаматноі групи за реакцією з еквівалентною кількістю або надлишком (наприклад, 5 еквівалентів) R-OC(O)Cl або ROC(O)OC6H4-p-MO2 у придатному інертному розріджувачі (наприклад, дихлорометані) для перетворення кінцевого аміну у карбамат, де R є таким як визначено вище. Краще, коли даний інертний розріджувач містить надлишок (наприклад, приблизно 10 еквівалентів) третинного аміну, такого як діізопропілетиламін, для вилучення будь-якої кислоти, котра генерується підчас реакції. Умови реакції в інших відношеннях звичайні (наприклад, кімнатна температура, протягом 30 хвилин); та (f) з утворенням групи сечовини за реакцією з еквівалентною кількістю або надлишком (наприклад, 5 еквівалентів) R-N=C=O у придатному інертному розріджувачі (наприклад, дихлорометані) для перетворення кінцевого аміну у групу сечови 21 ни (тобто RNHC(O)NH-), де R є таким як визначено вище. Краще, коли даний інертний розріджувач містить надлишок (наприклад, приблизно 10 еквівалентів) третинного аміну, такого як діізопропілетиламін. Умови реакції в інших відношеннях звичайні (наприклад, кімнатна температура, протягом 30 хвилин). 2. С-кінцеві модифікації При одержанні пептидних сполук, де С-кінцева карбоксильна група замінюється ефіром (тобто C(O)OR, де R є таким як визначено вище), застосовуються смоли, котрі використовувались для одержання пептидних кислот, і захищений пептид бічного ланцюга розщеплюється основою та відповідним спиртом, наприклад, метанолом. Потім захисні групи бічного ланцюга вилучаються у звичайний спосіб, шляхом обробки фторидом водню для одержання потрібного ефіру. При одержанні пептидних сполук, де С-кінцева карбоксильна група замінюється амідом 3 4 C(O)NR R , як тверда підкладка для синтезу пептиду використовується бензгідриламінова смола. По завершенню синтезу обробка фторидом водню для вивільнення пептиду із підкладки прямо приводить до утворення вільного пептидного аміду (тобто С-кінець являє собою -С(О)NH2). Як альтернатива, використання хлорометильованої смоли підчас синтезу пептиду у сполученні з реакцією з аміаком для відщеплення захищеного пептиду бічного ланцюга від підкладки дає вільний пептидний амід, а реакція з алкіламіном або діалкіламіном дає захищений алкіламід або діалкіламід 1 (тобто С-кінець являє собою -C(O)NRR , де R та 1 R є такими як визначено вище). Захист бічного ланцюга потім знімається у звичайний спосіб шляхом обробки фторидом водню з утворенням амідів, алкіламідів або діалкіламідів. Можливо також циклізувати пептидні сполуки даного винаходу або ввести дезаміно чи декарбокси залишок у кінці даної пептидної сполуки, так що кінцева аміно або карбоксильна група відсутня, для зниження чутливості до протеаз або для обмеження конформації даної пептидної сполуки. Скінцеві функціональні групи пептидних сполук даного винаходу включають амід, амід нижчий алкіл, амід ди(нижчий алкіл), нижчий алкокси. гідрокси та карбокси, і їх похідні нижчого ефіру та фармацевтично прийнятні солі. Окрім попередніх N-кінцевих та С-кінцевих модифікацій, пептидні сполуки даного винаходу, включаючи пептидоміметики, можуть бути модифіковані або ковалентним чином сполучені з одним або кількома із різновиду гідрофільних полімерів. Встановлено, що коли пептидні сполуки дериватизовані гідрофільним полімером, їх розчинність та періоди піврозпаду при циркуляції підвищені і їх імуногенність маскована. Попереднє може бути реалізовано з невеликим, якщо воно взагалі має місце, зниженням їх зв'язувальної активності. Небілкові полімери, придатні для застосування згідно з даним винаходом, включають, проте не обмежуючись цим, поліалкілефіри, прикладом яких слугують поліетиленгліколь та поліпропіленгліколь, полімолочна кислота, полігліколева кислота, поліоксиалкени, полівініловий спирт, полівінілпіро 96418 22 лідон, целюлоза та похідні целюлози, декстран та похідні декстрану і т.д. Загалом, такі гідрофільні полімери мають середню молекулярну вагу, що варіює від приблизно 500 до приблизно 100000 Да, краще, від приблизно 2000 до приблизно 40000 Да, і навіть ще краще, від приблизно 5000 до приблизно 20000 Да. У варіантах, яким віддається перевага, такі гідрофільні полімери мають середню молекулярну вагу приблизно 5000 Да, 10000 Да та 20000 Да. Пептидні сполуки даного винаходу можуть бути дериватизовані або сполучені з такими полімерами з використанням будь-яких методів, що розглянуті у роботах Zallipsky, S., Bioconjugate Chem., 6:150-165 (1995); Monfardini, С, et al., Bioconjugate Chem., 662-69 (1995); патент США за номером 4640835; патент США за номером 4496689; патент США за номером 4301144; патент США за номером 4670417; патент США за номером 4791192; патент США за номером 4179337 або WO 95/34326, на які у даній заявці зроблені повні посилання. У варіанті даного винаходу, якому віддається перевага, пептидні сполуки дериватизуються поліетиленгліколем (PEG). PEG є лінійним, водорозчинним полімером із повторюваних етиленоксидних одиниць з двома кінцевими гідроксильними групами. PEG класифікують за молекулярною вагою, котра звичайно варіює від приблизно 500 Да до приблизно 40000 Да. У варіанті даного винаходу, якому віддається перевага, застосовані PEG мають молекулярну вагу, що варіює від 5000 Да до приблизно 20000 Да. PEG, сполучений з пептидними сполуками даного винаходу, може бути як розгалуженим так і нерозгалуженим. (Дивись, наприклад, Monfardini, С, et al., Bioconjugate Chem., 6:62-69 (1995)). PEG є у продажу від фірми Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.) (тепер частина Nektar Therapeutics (San Carlom CA), Sigma Chemical Co. та інших компаній. Такі PEG включають, проте не обмежуючись цим, монометоксиполіетиленгліколь (MePEG-OH), монометоксиполіетиленгліколь-сукцинат (MePEG-S), монометоксиполіетиленгліколь-сукцинімідил сукцинат (MePEG-S-NHS), монометоксиполіетиленглікольамін (MePEG-NH2), монометоксиполіетиленгліколь-трезилат (MePEG-TRES) та монометоксиполіетиленгліколь-імідазоліл-карбоніл (MePEG-IM). У короткому викладі, в одному варіанті гідрофільний полімер, котрий застосовується, наприклад, PEG, накривається, краще, в одному кінці нереакційною групою, такою як метокси або етокси група. Потім даний полімер активується в іншому кінці шляхом реакції з придатним активатором, таким як ціанурогалоіди (наприклад, ціануровий хлорид, бромід або фторид), діімідазол, ангідридний реагент (наприклад, дигалосукциновий ангідрид, такий як дибромосукциновий ангідрид), ацилазид, р-діазонійбензиловий ефір, 3-(рдіазонійфенокси)-2-гідроксипропіловий ефір) і таке подібне. Потім активований полімер піддають реакції з пептидною сполукою даного винаходу з одержанням пептидної сполуки, що дериватизована полімером. Як альтернатива, функціональна група у пептидних сполуках даного винаходу може бути 23 активована для реакції з даним полімером, або зазначені дві групи можуть бути поєднані в узгодженій реакції сполучення з використанням відомих методів сполучення. Легко зрозуміти, що пептидні сполуки даного винаходу можуть бути дериватизовані PEG з використанням множини інших реакційних схем, що відомі і застосовуються фахівцями у даній галузі. Коли пептидні сполуки дериватизовані гідрофільним полімером, їх розчинність та циркуляційні періоди піврозпаду підвищуються, а імуногенність знижується. Попереднє може бути реалізовано з невеликою, якщо це взагалі має місце, втратою біологічної активності. У варіантах, яким віддається перевага, дериватизовані пептиди мають активність, що відрізняється від немодифікованих пептидів у 0,1-0,01 разів. У варіантах, яким віддається ще більша перевага, дериватизовані пептиди мають активність, що відрізняється від немодифікованих пептидів у 0,1-1 разів. У варіантах, яким віддається навіть ще більша перевага, дериватизовані пептиди мають активність, що перевищує активність немодифікованих пептидів. D. Модифікації остова Інші способи для одержання пептидних похідних сполук даного винаходу описані у роботі Hruby, et al., Biochem J., 268(2: 249-262 (1990), на яку у даній заявці зроблено посилання. Так, пептидні сполуки даного винаходу також слугують структурними моделями для непептидних сполук зі схожою біологічною активністю. Фахівцям у даній галузі відомо, що існує різновид способів для конструювання сполук з такою самою або схожою біологічною активністю як і первинна пептидна сполука, але з більш сприятливою активністю, ніж дана первинна сполука, у відношенні до розчинності, стабільності та чутливості до гідролізу та протеолізу. Дивись, Morgan et al., Ann. Rep Med Chem., 24:243-252 (1989), на яку у даному тексті зроблено посилання. Ці способи включають заміну пептидного остова остовом, що складається із фосфонатів, амідатів, карбаматів, сульфонамідів, вторинних амідів та N-метиламіно кислот. Придатні реагенти включають, наприклад, амінокислотні аналоги, де карбоксильна група даної амінокислоти замінена на складову, що придатна для формування одного із вищезазначених зв'язків. Подібно до цього, заміна амідо зв'язку у пептиді на фосфонатний зв'язок може проводитись у спосіб, викладений у патентах США за номерами 5359115 та 5420328, на які у даній заявці зроблені повні посилання. Е. Утворення дисульфідних зв'язків Сполуки даного винаходу можуть існувати у циклізованій формі з внутрішньомолекулярним дисульфідним зв'язком між тіоловими групами уведених цистеїнів, якщо останні присутні. Як альтернатива, для утворення димерноі (або вищої олігомерної) сполуки може бути запроваджений внутрішньомолекулярний дисульфідний зв'язок між тіоловими групами цистеїнів. Один або кілька цистеїнових залишків можуть також бути заміщені гомоцистеїном. V. Застосування 96418 24 Пептидні сполуки даного винаходу корисні in vitro як унікальні інструменти для розуміння біологічної ролі ТРО, включаючи оцінку багатьох чинників, що, як вважають, впливають і піддаються впливу, на продукування ТРО і процес зв'язування рецептора. Пептидні сполуки даного винаходу також корисні у розробці інших сполук, котрі зв'язуються з і активують ТРО-R, оскільки пептидні сполуки даного винаходу запроваджують важливу інформацію відносно співвідношення між структурою та активністю, що має полегшити таку розробку. Дані пептидні сполуки також корисні як конкурентні зв'язувальні речовини у скринінгових пробах щодо нових ТРО рецепторних агоністів. У таких пробних варіантах пептидні сполуки даного винаходу можуть використовуватись без модифікації або можуть бути модифіковані у множину способів; наприклад, шляхом мічення, таким як ковалентне або нековалентне приєднання складової, котра прямо або опосередковано дає виявлюваний сигнал. У будь-якій із цих проб дані матеріали можуть піддаватись прямому або опосередкованому міченню. Можливості для прямого мічення включають групи міток, такі як: радіоактивні мітки, такі як 125 І, ферменти (патент США за номером 3645090), такі як пероксидаза та лужна фосфатаза, і флуоресцентні мітки (патент США за номером 3940475), що можуть використовуватись для моніторингу змін інтенсивності флуоресценції, зсуву довжини хвилі або поляризації флуоресценції. Можливості для опосередкованого мічення включають біотинілювання однієї складової з наступним зв'язуванням з авідином, сполученим із однією із зазначених вище груп міток. Пептидні сполуки можуть також включати спейсери або лінкери у випадках, де дані пептидні сполуки мають бути приєднані до твердої підкладки. Крім того, виходячи із їх здатності зв'язуватись з ТРО рецепторами, пептидні сполуки даного винаходу можуть бути використані як реагенти для виявлення ТРО рецепторів на живих клітинах, зв'язаних клітинах, у біологічних рідинах, у тканинних гомогенатах, в очищених природних біологічних матеріалах і т.д. Наприклад, шляхом мічення таких пептидних сполук можна ідентифікувати клітини, що мають на своїх поверхнях TPO-R. Крім того, виходячи із їх здатності зв'язувати ТРО рецептор, пептидні сполуки даного винаходу можуть бути використані у in situ забарвленні, FACS (флуоресцентно-активоване сортування клітин), вестерн-блоттінгу, ELISA і т.д. Крім того, виходячи із їх здатності зв'язуватись з ТРО рецептором, пептидні сполуки даного винаходу можуть бути використані при очищенні рецепторів або при очищенні клітин, що експресують ТРО рецептори на поверхні клітин (або всередині клітин із штучно збільшеною проникністю мембрани). Пептидні сполуки даного винаходу можуть також використовуватись як комерційні реагенти для різних медичних дослідницьких та діагностичних застосувань. Такі застосування включають, проте не обмежуючись цим: (1) використання як калібрувального стандарту для кількісного визначення активностей можливих ТРО агоністів у ряді функ 25 ціональних проб, (2) використання для підтримки проліферації та росту ТРО-залежних клітинних ліній, (3) використання у структурному аналізі ТРО-рецептора шляхом сумісної кристалізації, (4) використання для дослідження механізму трансдукція сигналу/активація рецептора для ТРО, та (5) інші дослідницькі і діагностичні застосування, де переважно активується ТРО-рецептор або проводиться калібрування такої активації щодо відомої величини для ТРО агоніста, і таке подібне. Пептидні сполуки даного винаходу можуть використовуватись для in vitro розповсюдження мегакаріоцитів та їх комітованих попередників як у сполученні з додатковими цитокінами, так і самих по собі. Дивись, наприклад, DiGiusto, et al., PCT публікація за номером 95/05843, на яку у даному тексті зроблено посилання. Хіміотерапія та радіаційна терапія спричиняють тромбоцитопенію, вбиваючи більш зрілу популяцію мегакаріоцитів, що піддаються швидкому поділу. Проте, ці терапевтичні обробки можуть також спричинити зниження кількості та життєздатності незрілих, менш мітотично активних мегакаріоцитних клітин-попередників. Таким чином, послаблення тромбоцитопенії за допомогою ТРО або сполук даного винаходу може бути прискорено шляхом інфузії пацієнтам після хіміотерапії або радіаційної терапії популяції його або її власних клітин, збагачених мегакаріоцитами та незрілими попередниками in vitro культури. Пептидні сполуки даного винаходу можуть також бути призначені теплокровним тваринам, включаючи людей, для активації TPO-R in vivo. Таким чином, даний винахід охоплює способи терапевтичного лікування пов'язаних з ТРО розладів, що включають застосування пептидної сполуки даного винаходу у кількостях, достатніх для імітації впливу ТРО на TPO-R in vivo. Наприклад, пептидні сполуки даного винаходу можуть застосовуватись для лікування різновиду гематологічних розладів, включаючи, проте не обмежуючись цим, тромбоцитарні розлади та тромбоцитопенію, зокрема, у зв'язку з трансфузіями кісткового мозку, радіаційною терапією та хіміотерапією. У деяких варіантах даного винаходу ТРО антагоністи, краще, спочатку призначаються пацієнтам, що піддаються хіміотерапії або радіаційній терапії, з наступним призначенням ТРО агоністів даного винаходу. Активність сполук даного винаходу може бути оцінена або in vitro або in vivo в одній із множинних моделей, котрі описані у роботі McDonald, Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992), на яку у даній заявці зроблено посилання. Згідно з одним варіантом, композиції даного винаходу придатні для лікування тромбоцитопенії, пов'язаної з трансфузіями кісткового мозку, радіаційною терапією або хіміотерапією. Дані пептидні сполуки будуть призначатись, типово, профілактично перед хіміотерапією, радіаційною терапією або трансплантацією кісткового мозку, або після такої експозиції. Відповідно, даний винахід також запроваджує фармацевтичні композиції, що включають, як активний інгредієнт, принаймні одну із пептидних сполук даного винаходу сумісно з фармацевтич 96418 26 ним носієм або розріджувачем. Зазначені пептидні сполуки даного винаходу можуть застосовуватись за пероральною, пульмонарною, парентеральною (шляхом внутрішньом'язової, інтраперитонеальної, внутрішньовенної (IV) або підшкірної ін'єкції), інгаляційною (за допомогою порошкових препаратів), трансдермальною, назальною, вагінальною, ректальною або сублінгвальною схемами, і можуть складатись у вигляді лікарських форм, відповідних кожній схеми застосування. Дивись, наприклад, Bernstein, et al., РСТ патентна публікація за номером WO 93/25221; Pitt et al., PCT патентна публікація за номером WO 94/17784; та Pitt, et al., європейська патентна публікація за номером 613683, на які у даному тексті зроблені посилання. Тверді лікарські форми для перорального застосування включають капсули, таблетки, пілюлі, порошки та гранули. У таких твердих лікарських формах активна пептидна сполука змішується з принаймні одним інертним фармацевтично прийнятним носієм, таким як цукроза, лактоза або крохмаль. Такі лікарські форми можуть також містити, як у звичайній практиці, додаткові речовини, інші, ніж інертні розріджувачі, наприклад, мастила, такі як стеарат магнію У випадку капсул, таблеток та пілюль дані лікарські форми можуть також містити буфери. Таблетки та пілюлі можуть додатково готуватись з ентеросолюбільними покриттями. Рідкі лікарські форми для перорального застосування включають фармацевтично прийнятні емульсії, розчини, суспензії, сиропи, еліксири, що містять інертні розріджувачі, котрі звичайно використовуються у даній галузі, такі як вода. Окрім зазначених інертних розріджувачів дані композиції можуть також включати ад'юванти, такі як змочувальні агенти, емульсифікатори та суспендуючі агенти, і підсолоджувачі, ароматизатори та парфуми. Препарати згідно з даним винаходом для парентерального застосування включають стерильні водні або неводні розчини, суспензії або емульсії. Прикладами неводних розчинників або наповнювачів є пропіленгліколь, поліетиленгліколь, рослинні олії, такі як оливкова олія та кукурудзяна олія, желатин та органічні ефіри для ін'єкцій, такі як етилолеат. Такі лікарські форми можуть також містити ад'юванти, такі як консерванти; змочувальні агенти, емульсифікатори та диспергатори. Вони можуть бути стерилізовані, наприклад, шляхом фільтрації через утримуючий бактерії фільтр, шляхом уведення стерилізуючих агентів у дані композиції, шляхом опромінення або нагрівання даних композицій. Вони також можуть продукуватись з використанням стерильної води або деякого іншого стерильного середовища для ін'єкції безпосередньо перед застосуванням. Композиції для ректального або вагінального застосування являють собою, краще, супозиторії, котрі можуть містити, на додаток до активної речовини, наповнювачі, такі як кокосове масло або супозіторний віск. Композиції для назального або сублінгвального застосування також готуються зі стандартними наповнювачами, що добре відомі у даній галузі. 27 Композиції, що містять пептидні сполуки, можуть призначатись для профілактичного та/або терапевтичного лікування. У терапевтичних застосуваннях композиції призначаються пацієнту, що вже потерпає від хвороби, як описано вище, у кількості, достатній для того, щоб вилікувати або принаймні частково призупинити симптоми даної хвороби та її ускладнень. Кількість, адекватна для здійснення цього, визначається як "терапевтично ефективна доза". Кількості, що ефективні для здійснення цього застосування, будуть залежати від тяжкості даного захворювання та ваги і загального стану пацієнта. Композиції даного винаходу можуть також бути мікроінкапсульовані за методом, наприклад, Тісе and Bibi (у Treatise on Controlled Drug Delivery, ed. A. Kydonieus, Marcel Dekker, New York (1992), pp. 315-339). У профілактичних застосуваннях композиції, що містять пептидні сполуки даного винаходу, призначаються пацієнту, схильному до або, інакше, які мають ризик даної конкретної хвороби. Така кількість визначається як "профілактично ефективна доза". У цьому застосуванні точні кількості знову залежать від стану здоров'я пацієнта та його ваги. Кількості пептидної сполуки, необхідні для ефективної терапії, будуть залежати від багатьох різних чинників, включаючи засоби застосування, сайт, який є мішенню, фізіологічний стан даного пацієнта та інші призначені ліки. Таким чином, дози мають підбиратись для забезпечення оптимальної безпеки та ефективності. Типово, дози, що застосовувались in vitro, можуть слугувати корисним показником щодо кількостей, придатних для in situ застосування цих реагентів. Випробування на тваринах ефективних доз для лікування конкретних розладів буде слугувати додатковим предикативним показником доз для людини. Різні міркування описані, наприклад, у роботах Gilman, et al. (eds), Goodman and Gilman's: The Pharmacological th Basis of Therapeutics, 8 ed., Pergamon Press (1990); and Remington's Pharmaceutical Sciences, lh 7 Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1985), на які у даній заявці зроблені посилання. Пептидні сполуки даного винаходу ефективні у лікуванні опосередкованих ТРО станів при їх застосуванні в області доз від приблизно 0,001 мг до приблизно 10 мг/кг ваги тіла за добу. Специфічна застосована доза регулюється конкретним станом, що піддається лікуванню, схемою застосування, так само як і рішенням практикуючого клініциста у залежності від таких чинників як тяжкість даного стану, вік та загальний стан пацієнта, і таке подібне. Приклад 1 Твердофазовий синтез пептидних сполук Пептидні сполуки даного винаходу можуть бути синтезовані, наприклад, з використанням методів твердофазового синтезу Merrifield (дивись, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. Edition, Pierce Chemical, Rockford, Ill. (1984) та Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1963)) або Applied Biosystems Inc. Model 431А або 433A peptide synthesizer. Пептидні сполуки можуть скла 96418 28 датись з використанням стандартних протоколів Applied Biosystems Inc. Synth Assist 1.0.0 або Synth Assist 2.0.2. Кожне сполучення може проводитись протягом 2x30 хвилин з HBTU (2-(1Нбензатриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуроній гексафторофосфат) та HOBt (1гідроксибензотриазол). Смолою може слугувати НМР смола (ргідроксиметил феноксиметил)полістирольна смола PAL (Milligen/Biosearch), котра являє собою структуровану полістирольну смолу з 5-(4'-Fmocамінометил-3,5'-диметилоксифенокси) валеріановою кислотою як лінкером. Використання PAL смоли приводить до утворення карбоксильної кінцевої амідної функціональної групи при відщепленні даного пептиду від смоли. Після відщеплення НМР смола дає складову карбонової кислоти у С-кінці кінцевого продукту. Більшість реагентів, смол та захищених амінокислот (вільних або на даній смолі) може бути поставлена фірмою Millipore або Applied Biosystems Inc. Підчас процедури сполучення для захисту аміногрупи може використовуватись Fmoc група. Захист первинного аміну на амінокислотах може бути забезпечений Fmoc та захисними групами бічного ланцюга, такими як t-бутил для серину, тирозину, глутаміновоі кислоти та треоніну; тритіл для глутаміну; Рmс (2,2,5,7,8-пентаметилхроман6-сульфоніл) для аргініну; N-t-бутилоксикарбоніл для триптофану; N-тритіл для гістидину і S-тритіл для цистеїну. Відокремлення пептидних сполук від смоли та одночасне депротектування функціональних груп бічного ланцюга може досягатись шляхом обробки реактивом К або незначними його модифікаціями. Як альтернатива, у синтезі цих пептидів з амідованим карбоксильним кінцем цілком складений пептид може бути розщеплений сумішшю 90% трифторооцтової кислоти, 5% етандитіолу, і 5% води, спочатку при 4°C, з поступовим підвищенням до кімнатної температури. Депротектовані пептидні сполуки можуть бути осаджені діетиловим ефіром. Очищення може проводитись за методом препаративної високопродуктивної рідинної хроматографії з оберненою фазою на силікагелевій з C18 зв'язкою колонці з градієнтом ацетонітрил/вода у 0,1% трифторооцтовій кислоті. Гомогенні пептидні сполуки можуть бути проаналізовані з використанням швидкісної мас-спектрометрії з атомним бомбардуванням або мас-спектрометрії з електророзпиленням, і амінокислотного аналізу, де це можливо. У варіанті, якому віддається перевага, пептидні сполуки даного винаходу димеризуються з використанням стандартних синтетичних процедур, відомих фахівцям у даній галузі. Згідно з цими синтетичними схемами, фахівцям у даній галузі буде не важко одержати димерні пептидні сполуки у відповідності до даного винаходу. Крім того, фахівцям у даній галузі зрозуміло, що зазначені димерні субодиниці можуть бути легко зчеплені з використанням відомих методологій та лінкерів. Приклад 2 PEGілування пептидних сполук 29 PEGілування пептидної сполуки даного винаходу може проводитись з використанням добре відомих способів. Наприклад, пептидна сполука даного винаходу може бути розчинена у 100 мМ біцину рН 8,0 при концентрації 10 мг/мл, додана до 1,25-кратного мольного надлишку порошкового PEG2 (що є у продажу від фірми Shearwater Polymers, Inc. (Huntsvilie, Ala .тепер Nektar Therapeutics (San Carlo, CA) і піддана перемішуванню при кімнатній температурі до завершення реакції, типово, 1-2 години. Моніторинг даної реакції здійснюється за допомогою високопродуктивної рідинної хроматографії з оберненою фазою з використанням 40-65% ацетонітрильного градієнта на колонці YMC ODS AQ. Коли реакція завершена, даний розчин додають до другого 1,25 мольного надлишку порошкового PEG2, і даний процес повторюється 4 рази з використанням, загалом, 5 молей PEG2 на кожен моль даного пептиду. Даний розчин 2-кратно розводять PBS для зниження в'язкості і завантажують у колонку superdex 200 (Pharmacia), що попередньо була урівноважена та промита PBS. Фракції із розділювальної колонки можуть бути проаналізовані за методом високопродуктивної рідинної хроматографії з оберненою фазою. Фракції, що містять ди-PEG поліпептид, котрий елююється перед будь-якою моно-PEG пептидною сполукою, можуть збиратись та зберігатись при 5°C або піддаватись ліофілізації. Приклад 3 Передклінічні дослідження на тваринах тромбопоетичної активності ТРО PEGільованої Сполуки No 1 ТРО Сполука No 1 не поділяє жодної гомології послідовностей з ендогенним ТРО, зменшуючи ризик утворення антитіл, що перехресно реагують з ендогенним ТРО. ТРО Сполука No 1 була PEGільована для зниження кліренсу та додаткового зниження антигенності Цей Приклад описує передклінічні дослідження тромбопоетичної активності PEGільованої ТРО Сполуки No 1 на тваринах. Для досліджень використовувались нормальні самці щурів Wistar (джерело). Для даних передклінічних досліджень можуть також використовуватись й інші тварини, такі як собаки, миші, мавпи і т.д. Усі процедури, що включали тварин, проводились у приміщенні для тварин у повному узгодженні з Американською асоціацією щодо оцінки та ухвалення догляду за лабораторними тваринами (AAALAC) та Порадником щодо догляду та використання лабораторних тварин (NIH). Нормальних самців щурів Wistar (віком 10 тижнів, з вагою тіла у межах від 230 до 367 г при дозуванні) піддавали лікуванню одиничними внутрішньовенними дозами ТРО Сполуки No 1 при 30, 100 або 300 мкг/кг (40 щурів/групу). Перед дозуванням, за 96, 144, 192, 240, 288 та 312 годин після дозування приблизно по 0,5 мл крові відбирали шляхом проколу яремної вени не підданих анестезії щурів (5 щурів на часову точку, ЕДТА як антикоагулянт), і кількість тромбоцитів оцінювали з використанням автоматизованої системи гематологічного аналізу. Перед кожним відбором проби крові тварини голодували протягом ночі при наявності води. 96418 30 Одиничні внутрішньовенні дози PEGільованої ТРО Сполуки No 1 (30, 100 або 300 мкг/кг) давали, згідно з самою першою оцінкою після дозування на 4 добу (Фігура 6), підвищені кількості периферичних тромбоцитів у нормальних самців щурів Wistar. Кількості тромбоцитів оцінювали кожні 2 доби протягом наступних 2 тижнів і порівнювали з кількостями перед дозуванням. Доза 300 мкг/кг індукувала найбільше зростання кількості тромбоцитів, що поверталась до базової кількості на 14 добу. Приклад 4 Клінічні дослідження фази І тромбопоетичної активності PEGільованої ТРО Сполуки No 1 Дослідження фази І проводились для вивчення толерантності, фармакодинаміки та фармакокінетики PEGільованої ТРО Сполуки No 1. Цей приклад описує дослідження фази І PEGільованої ТРО Сполуки No 1 після окремої внутрішньовенної ін'єкції у здорових добровольців чоловіків. Дослідження фази І PEGільованої ТРО Сполуки No 1 та інших сполук згідно з даним винаходом після множинних внутрішньовенних ін'єкцій або застосування інших засобів та/або до пацієнта, який потребує такого лікування, може здійснюватись з використанням протоколів, що відомі фахівцеві у даній галузі. Сорок добровольців були рандомізовані для отримання PEGільованої ТРО Сполуки No 1 або плацебо у вигляді одиничної внутрішньовенної болюсної ін'єкції у відношенні 62. Вісім суб'єктів були рандомізовані у відношенні 6:2 для одержання одиничної ін'єкції PEGільованої ТРО Сполуки No 1 або плацебо, з дозами у межах 0,375, 0,75, 1,5, 2,25 або 3 мкг/кг. Фармакодинамічна реакція PEGільованої ТРО Сполуки No 1 визначалась як зростання кількості тромбоцитів. Рівні PEGільованої ТРО Сполуки No 1 визначались у плазмі, збідненій на тромбоцити, з використанням атестованого твердофазового імуноферментного аналізу. Рівні ендогенного ТРО, ΕΠΟ, IL-6 та IL-11 вимірювались у зазначені моменти часу з використанням стандартних імуноаналізів. Для визначення утворення антитіл проти пептидної складової PEGільованої ТРО Сполуки No 1 був використаний біосенсорний імуноаналіз (технологія ВіаСоrе). Вплив на тромбоцитну функцію вимірювався шляхом моніторингу індукованої колагеном агрегації тромбоцитів за 4 години та за 12 діб після застосування PEGільованої ТРО Сполуки No 1. РК аналіз виявив залежну від дози кінетику PEGільованої ТРО Сполуки No 1, хоча при дозах 0,75 мкг/кг або нижче концентрації PEGільованої ТРО Сполуки No 1 у плазмі були, загалом, нижче порогу кількісного визначення 6,25 нг/мл (Фігура 7). Чотири суб'єкти у дозовій групі 0,375 мкг/кг і один суб'єкт у дозовій групі 3,0 мкг/кг PEGільованої ТРО Сполуки No 1 на мали виявлюваних рівнів у плазмі. Середні значення Смакс варіювали від 10,9 нг/мл при 0,75 мкг/кг PEGільованої ТРО Сполуки No 1 до 61,7 нг/мл при 3,0 мкг/кг PEGільованої ТРО Сполуки No 1 (Таблиця 1). РК дані при 0,375 мкг/кг внутрішньовенно ТРО Сполуки No 1 не були одержані. Середній кінцевий період піврозпаду PEGільованої ТРО Сполуки No 1 31 96418 варіював від приблизно 18 до 36 годин. Медіанне tmax значення варіювало від 0,09 до 2 годин. Зростання Смакс зі збільшенням дози було приблизно пропорційним дозі, але спостерігалось очевидне 32 зростання нормалізованого AUC0-24 значення зі збільшенням дози, що передбачає більш високе, ніж пропорційне, зростання з дозою. Таблиця 1 Зведення результатів РК аналізу Смакс (нг/мл) 1/2 (годин) AUCoo (нг. годин/мл Доза 0,75 мкг/кг N 6 1 0 Середнє 10,9 Не визначено Не визначено Мін-Макс BLQ-18,8 18,6 Не визначено Доза 1,5 мкг/кг N 6 2 1 Середнє 20,9 Не визначено Не визначено Мін-Макс 7,53-28,5 13,1-22,5 475 Доза 2,25 мкг/кг N 6 2 3 Середнє 39,7 Не визначено 1561 Мін-Макс 13,1-59,1 29,8-48,5 1551-1569 Доза 3,0 мкг/кг, за виключенням суб'єкта 1027, котрий не мав вимірної концентрації N 6 4 3 Середнє 61,7 36,1 2257 Мін-Макс 53,9-76,0 27,7-51,3 1773-2764 t Реакція тромбоцитів на застосування PEGільованої ТРО Сполуки No 1 була схожа з результатами, опублікованими для rhTPO та AMG531. Кількість тромбоцитів збільшувалась у залежності від дози, сягаючи пікових рівнів на 1012 добу, і верталась до базових значень протягом 3-4 тижнів (Фігура 8). Середні пікові кількості тромбоцитів варіювали від 315x10 /л при 0,375 9 мкг/кг внутрішньовенно до 685x10 /л при 3 мкг/кг внутрішньовенно, і середня максимальна кількість тромбоцитів зростала відносно базового значення від 1,4-крат при 0,375 мкг/кг до 3,2-крат при 3,0 мкг/кг (Таблиця 2). Принаймні 50% збільшення кількості тромбоцитів спостерігалось у 4 із AUC0-24 (нг. годин/мл) 0 Не визначено Не визначено 4 311 268-359 4 678 655-694 5 965 823-1124 6 суб'єктів, що отримували PEGільовану ТРО Сполуку No 1 при дозі 0,75 мкг/кг, тоді як 2-кратне збільшення кількості тромбоцитів спостерігалось у приблизно 3 із 6 суб'єктів при дозі 1,5 мкг/кг, і т.д. Доза 0,75 мкг/кг внутрішньовенно була вибрана як початкова доза для клінічного дослідження фази II. Окрім змін у кількості тромбоцитів, впливу на інші зрілі клітини, циркулюючі у крові, не спостерігалось (дані не наведені). Крім того, застосування PEGільованої ТРО Сполуки No 1 не впливало на тромбоцитарну функцію ані у момент застосування ані за 12 діб після введення дози, на час появи нових тромбоцитів. Таблиця 2 Зведення даних аналізу на кількість тромбоцитів PEGільована ТРО сполука No 1 N n (>1.5х) n (>2х) n (>3х) n (>4х) 9 PIt0 (10 /L) 1) 9 Pltmax (10 /L) Pltmax/PIt0 1) 1) 0 (мкг/кг) 0,375 (мкг/кг) 0,75 (мкг/кг) 1,5 (мкг/кг) 2,25 (мкг/кг) 3,0 (мкг/кг) 10 0 0 0 0 192/203 (163-233) 230/225 (189-271) 1.14/1.13 (1.04-1.38) 6 3 0 0 0 223/205 (159-304) 315/309 (214-482) 1.42/1.42 (1.08-1.81) 6 3 1 0 0 212/212 (155-264) 347/335 (232-495) 1.63/1.63 (1.15-2.12) 6 4 3 0 0 228/230 (200-258) 430/458 (238-597) 1.91/2.13 (1.01- 2.59) 6 4 4 0 0 215/203 (193-261) 454/500 (254-576) 2.15/2.33 (1.28-2.98) 6 5 5 4 1 208/200 (150-284) 685/750 (188-979) 3.21/3.50 (1.25-4.52) Оцінювався ефект застосування PEGільованої ТРО Сполуки No 1 на фактори росту, що, як відомо, мають тромбопоетичну активність. Ендогенні ТРО рівні підвищувались у зале жній від дози манері, досягаючи пікових рівнів на 3-ю добу після введення дози (Фігура 9). Значних змін у рівнях у крові IL-6, IL-11 та ЕРО не спостерігалось. 33 Тромбоцитарна функція, котра оцінювалась як індукована колагеном агрегація тромбоцитів у суцільній крові, не відрізнялась у періоди між лікуваннями. Жоден із суб'єктів не мав серйозних несприятливих подій або токсичності, що обмежує дозу Найбільш часто спостерігались такі несприятливі події як легкий головний біль та втома, і вони мали місце як після активного лікування так і застосування плацебо Антитіла 96418 34 проти PEGільованої ТРО Сполуки No 1 не виявлялись. Ці результати вказують, що PEGільована ТРО Сполука No 1 добре переносилась в області випробуваних доз. Хоча вище був поданий опис лише варіантів даного винаходу, яким віддається перевага, зрозуміло, що можливі модифікації та варіації даного винаходу без відхилення від його суті та передбачуваного обсягу. 35 96418 36 37 96418 38 39 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 96418 Підписне 40 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601