Химерний білок розчинного рецептора інтерлейкіну-6/інтерлейкіну-6 (sil-6r/il-6), застосування даного злитого білка для одержання лікарського засобу для лікування раку, захворювань печінки, неврологічних захворю

1. Химерний білок розчинного рецептора інтерлейкіну-6 (sIL-6R) - інтерлейкіну-6 (IL-6) (sIL6R/IL-6), що включає злитий білковий продукт, отриманий шляхом злиття природної форми sIL6R і природної форми IL-6, де обидві форми глікозильовані в такий спосіб, як і природні форми sIL6R і IL-6. 2. Химерний білок sIL-6R/IL-6 за п.1, який відрізняється тим, що вказаний sIL-6R злито з IL-6 через молекулу пептидного лінкера. 3. Химерний білок sIL-6R/IL-6 за п.2, який відрізняється тим, що вказаний лінкер є дуже коротким неімуногенним лінкером, який складається приблизно з 3 амінокислотних залишків. 2 (19) 1 3 75321 4 11. Химерний білок sIL-6R/IL-6 за п.9, який відрізпресувати послідовність химерного білка sIL-6R/ILняється тим, що вказаний білок продукують в клі6, носієм якої є вказаний вектор, повністю процетинах яєчника китайського хом'яка (СНО). сувати експресований білок і секретувати його в 12. Химерний білок sIL-6R/IL-6 за будь-яким з пп.1культуральне середовище, в якому вирощуються 11, який відрізняється тим, що вказаний химервказані клітини. 24. Трансформовані клітини за п.23, які відрізняний білок має здатність інгібувати ріст надзвичайються тим, що вказані клітини є вищеописаними но злоякісних ракових клітин. 13. Химерний білок sIL-6R/IL-6 за п.12, який відріклітинами нирки ембріона людини 293 (НЕК293), зняється тим, що вказаний химерний білок має трансфекованими вектором pcDNA sIL-6R/IL-6, де здатність інгібувати ріст надзвичайно злоякісних вказані клітини здатні експресувати химерний бімеланомних клітин. лок sIL-6R/IL-6, повністю процесувати вказаний 14. Химерний білок sIL-6R/IL-6 за пп.1-11, який білок і секретувати вказаний білок у культуральне відрізняється тим, що вказаний химерний білок середовище, у якому ростуть вказані клітини, у має здатність стимулювати in vivo приживлювавигляді глікопротеїну з молекулярною масою біля ність клітин кісткового мозку людини при трансп85 кДа. лантації кісткового мозку. 25. Спосіб одержання химерного білка за будь15. Химерний білок sIL-6R/IL-6 за будь-яким з пп.1яким з пп.1-14, що передбачає вирощування тран11, який відрізняється тим, що вказаний химерсформованих клітин за п.23 або 24 в умовах, приний білок має здатність захищати печінку від гепадатних для експресії, процесування і секреції вкатотоксичних речовин. заного білка або його аналогів в культуральне 16. Послідовність ДНК, що кодує химерний білок середовище, у якому ростуть вказані клітини, і sIL-6R/IL-6 за будь-яким з пп.1-11. очищення вказаного білка від вказаного культура17. Вектор ДНК, який містить послідовність ДНК, льного середовища. 26. Спосіб за п.25, який відрізняється тим, що що кодує химерний білок sIL-6R/IL-6 за будь-яким з пп.1-11, де вказаний вектор може використовуочищення здійснюють імуноафінною хроматограватися для експресії вказаного химерного білка в фією, використовуючи моноклональні антитіла, клітинах ссавців. специфічні відносно sIL-6R. 18. Вектор ДНК за п.17, який відрізняється тим, 27. Застосування химерного білка sIL-6R/IL-6 за що вказаний вектор може використовуватися для будь-яким з пп.1-11 для одержання лікарського експресії зазначеного химерного білка в клітинах засобу для лікування раку шляхом інгібування ралюдини. кових клітин ссавців. 19. Вектор ДНК за п.17, який відрізняється тим, 28. Застосування химерного білка за будь-яким з що вказаний вектор може використовуватися для пп.1-11 для одержання лікарського засобу для експресії вказаного химерного білка в клітинах поліпшення приживлюваності клітин при транспСНО. лантації клітин кісткового мозку шляхом стимуля20. Вектор ДНК за пп.17-19, який відрізняється ції приживлюваності клітин кісткового мозку людитим, що, коли вказаний вектор експресований в ни. клітинах ссавців або людини, експресований хи29. Застосування химерного білка sIL-6R/IL-6 за мерний білок має послідовність, яка дозволяє повбудь-яким з пп.1-11 для одержання лікарського ністю процесувати химерний білок клітинами ссавзасобу для стимуляції кровотворення. ця або людини і секретувати повністю 30. Застосування химерного білка sIL-6R/IL-6 за процесований химерний білок з клітин в культурабудь-яким з пп.1-11 для одержання лікарського льне середовище, в якому вирощуються вказані засобу для лікування захворювань печінки. клітини. 31. Застосування химерного білка sIL-6R/IL-6 за 21. Вектор ДНК за будь-яким з пп.17-20, який відбудь-яким з пп.1-11 для одержання лікарського різняється тим, що зазначений вектор є плазмізасобу для лікування неврологічних захворювань. дою, що позначається тут як pcDNAsIL-6R/IL-6, яка 32. Фармацевтична композиція, що містить як аквключає вектор pcDNA3, що містить послідовність тивний інгредієнт химерний білок sIL-6R/IL-6 за ДНК, що кодує химерний білок sIL-6R/IL-6 під контбудь-яким з пп.1-11 і фармацевтично прийнятний ролем промотору цитомегаловірусу (CMV). носій, розріджувач або наповнювач. 22. Вектор ДНК за будь-яким з пп.17-20, який від33. Фармацевтична композиція за п.32 для лікурізняється тим, що вказаний вектор є плазмідою, вання різних видів раку. позначеною тут як pcDNA3 sIL-6R/IL-6, яка вклю34. Фармацевтична композиція за п.32 для поліпчає вектор pcDNA3 з послідовністю ДНК, що кодує шення приживлюваності клітин при трансплантації химерний білок sIL-6R/IL-6 під контролем промокісткового мозку. тору цитомегаловірусу (CMV), і де у вказану послі35. Фармацевтична композиція за п.32 для лікудовність ДНК, що кодує вказаний химерний білок вання хвороб печінки. sIL-6R/IL-6, введена лінкерна послідовність, що 36. Фармацевтична композиція за п.32 для лікукодує пептидний лінкер в сайті EcoRI, розташовавання неврологічних порушень. ному між послідовністю, яка кодує частину sIL-6R, і 37. Фармацевтична композиція за п.32 для поліппослідовністю, яка кодує частину IL-6 білка. шення кровотворення. 23. Трансформовані клітини ссавців, що містять вектор ДНК за будь-яким з пп.17-22, які здатні екс 5 Даний винахід належить до царини біологічної активності інтерлейкіну-6 (IL-6), яка залежить від агоністичної дії розчинного рецептора IL-6 (sIL-6R). Зокрема, даний винахід стосується нових химерних білків sIL-6R/IL-6, сконструйованих шляхом злиття природних форм sIL-6R та IL-6, і їх біологічно активних аналогів, які дозволяють ефективно лікувати рак шляхом пригнічення росту ракових клітин, покращують приживлюваність трансплантата кісткового мозку, є корисними для лікування хвороб печінки та інших порушень, зумовлених IL-6. Засновки винаходу і прототип Інтерлейкін-6 (IL-6) є добре відомим цитокіном, біологічна активність якого опосередкована системою мембранних рецепторів, що включає два різні білки, один з яких визначається як рецептор IL-6 (IL-6R або gp80), а інший - як gp130 [огляд Hirano et al., 1994]. Розчинні форми IL-6R (sIL-6R), які відповідають позаклітинному домену gp80, є природними продуктами організму людини, виявленими у вигляді глікопро-теїнів в крові та сечі [Novick et al., 1990, 1992]. Відмітна особливість молекул sIL-6R полягає в тому, що вони є сильнодіючими агоністами IL-6 в багатьох типах клітин, включаючи клітини людини [Taga et al., 1989; Novick et al., 1992]. Це пов'язане з тим, що, навіть без інтрацитоплазматичного домену gp80, sIL-6R здатний стимулювати димеризацію gp130 під дією IL-6, який в свою чергу опосередковує подальшу IL-6-специфічну трансдукцію сигналу і біологічні дії [Murakami et al., 1993]. Комплекс активних рецепторів IL-6 фактично являє собою шестичленну структуру, утворену двома ланцюгами gp130, двома IL-6R і двома лігандами IL-6 [Ward et al., 1994; Paonessa et al., 1995], в якій sIL-6R характеризується двома типами взаємодії з gp130, обидва з яких мають важливе значення IL-6-специфічної біологічної активності [Halimi et al., 1995]. Обробка sIL-6R приводить до підсилення біологічної активності IL-6 в багатьох типах клітин. Прикладом є пухлинні клітини, ріст яких пригнічується IL-6 значно більшою мірою при доданні sIL6R; такими клітинами, зокрема, є мієлолейкозні клітини М1 мишей [Taga et al., 1989], клітини T47D карциноми молочної залози людини [Novick et al., 1992] або недрібні клітини карциноми легені людини [Ganapathi et al., 1996]. IL-6 справляє антиметастатичну дію in vivo [Katz et al., 1995], sIL-6R також може посилювати in vivo протипухлинну дію IL-6 [Mackiewicz et al., 1995]. Іншою дією IL-6, що посилюється доданням sIL-6R, є стимуляція кровотворних стовбурових клітин з метою продукування змішаних колоній [Sui et al., 1995]. Крім того, автори даного винаходу встановили, що життєздатність первинних культур олігодендроцитів мозку підтримується лише комбінацією sIL-6R та IL-6 [Oh, 1997], у той час як IL-6 окремо виявляє слабку активність в таких культурах [Kahn and De Vellis, 1994]. Це відкриття показує, що IL-6 в поєднанні з sIL-6R може імітувати активність інших нейротропічних цитокінів, таких 75321 6 як війковий нейротропічний фактор (CNTF) або фактор пригнічення лейкозу (LIF), що також діє через gp130, як це має місце для IL-11 і онкостатину М [Hirano et al., 1994]. Було зроблено спробу одержати молекулу, яка могла б поєднувати вищезазначені функції IL6 та sIL-6R, в результаті якої було проголошено про продукування в рекомбінантних дріжджових клітинах злитого білка з усіченого сегменту послідовності IL-6R людини та IL-6, зв'язаних лінкером з високим вмістом гліцину [Fischer et al., 1997]. Цей злитий білок включає, по суті, лише Nдомен рецептора цитокіну IL-6R і С-домен рецептора цитокіну; таким чином в ньому практично повністю відсутній імуноглобуліноподібний (Ig) домен IL-6R та передмембранна область рецептора (область між С-доменом і трансмембранним доменом). В такому вигляді зазначений білок являє собою усічену форму sIL-6R, причому усічений sIL-6R в злитому білку зв'язаний вищезазначеним лінкером з високим вмістом гліцину практично зі всією зрілою формою IL-6. Окрім відсутності деяких частин природного sIL-6R, цей злитий білок, оскільки він одержаний в дріжджових клітинах, не має структури глікозилування, яка повинна була б бути у такого злитого білка, якщо б його було одержано в клітинах ссавця, наприклад в клітинах людини. Фактично цей продукований в дріжджах злитий білок має молекулярну масу, яка дорівнює приблизно 57кДа, на відміну від злитого продукту, що містить практично всі амінокислотні залишки природного sIL-6R та IL-6 і повністю глікозилованого в клітинах ссавців (наприклад, людини), що повинен мати передбачувану молекулярну масу близько 85кДа (див. наведений нижче приклад 2). Узвичаєна практика конструювання рекомбінантних білків, які можна використовувати для лікування людей, показує, що такі білки повинні якомога ближче відповідати природним формам білків, виявленим в організмі людини, для запобігання стимуляції антитіл та іншим побічним ефектам, характерним для штучних рекомбінантних продуктів. З цієї причини для одержання глікозилованих білків бажано використовувати рекомбінантні системи клітин ссавців, такі як інтерферонабо колонієстимулюючий фактор гранулоцитів [Chernajovsky et al., 1984, Holloway, 1994], в хімічній формі, яка найбільшою мірою подібна до природного продукту людини. Бактерії або мікроорганізми, наприклад такі, як дріжджі, які не глікозилуються належним чином, викликають також невірну укладку ланцюгів білка, що веде до виникнення імуногенних реакцій. Це особливо важливо для IL-6, який істотно модифікований посттрансляційно N- та O-глікозилуванням, а також фосфорилуванням [огляд Revel, 1989], і для природного sIL-6R з крові і сечі людини, що є глікопротеїном, в якому N- та С-кінцеві амінокислоти є постійними і їх значення встановлені [Novick et al., 1990 і патент США №5216128, що належить обом авторам, та відповідний європейський патент №ЕР 413908 В1]. 7 75321 8 З викладеного вище випливає, що зазначемає важливе значення для зменшення потенційний продукт злиття частини sIL-6R і IL-6 повинен ної імуногенності химерного білкового продукту. мати цілий ряд недоліків, зокрема, з точки зору Однак, можна використовувати дуже коротзастосування для лікування людини, через відсукий лінкер завдовжки близько три амінокислоти в тність у нього частини sIL-6R та продукування в точці з'єднання частин sIL-6R та IL-6 химерного дріжджах, що може стати причиною невірного білка. Такий короткий лінкер не повинен бути глікозилування білка. імуногенним епітопом. Крім того, можна викорисДосі не було описано злиту молекулу, що мітовувати більш довгі лінкери завдовжки приблизстить природний sIL-6R, виявлений в рідинах но до 30 амінокислот з метою поділу двох частин, організму людини, і природний IL-6 і яку одержаале в цьому випадку необхідно дотримуватися но в клітинах людини або інших ссавців. обережності і здійснити експериментальні досліТому метою даного винаходу є одержання дження біологічної ефективності та безпеки одетакої злитої молекули, що містить природні sILржаного продукту для гарантування того, що хи6R і IL-6 (в будь-якому порядку), яку продуковано мерні молекули з такими лінкерами не є в клітинах ссавців. імуногенними. Ще однією метою даного винаходу є застосуНасправді, при здійсненні даного винаходу вання такого злитого білка (химера sIL-6R/IL-6) було встановлено, що більш довгі лінкери не мадля пригнічення росту сильно метастатичних меють великого значення для активності химерного ланомних клітин в дуже низьких концентраціях, білка; це свідчить про той, що для правильної оскільки ці клітини є стійкими до впливу IL-6 або укладки химери не вимагається більш довгого sIL-6R окремо. лінкеру, особливо тоді, коли практично всі прироЩе однією метою цього винаходу є застосудні послідовності частин sIL-6R і IL-6 входять до вання такого злитого білка (химера sIL-6R/IL-6) химерної молекули (див. приклад 3 і Фіг.5, що для покращення приживлюваності in vivo кровотстосуються також порівняння химери sIL-6R/IL-6 з ворних стовбурних клітин при трансплантації кісдуже коротким (3 амінокислоти) лінкером і аналоткового мозку. гічної химери з більш довгим лінкером з 30 аміноЩе однією метою даного винаходу є застосукислот). вання такого злитого білка для лікування інших Ці злиті білки або химери sIL-6R/IL-6 ефектипорушень, зумовлених IL-6, наприклад хвороб вно продуковані згідно з цим винаходом в експечінки чи неврологічних порушень. пресуючих системах клітин ссавців, що дозволиЩе однією метою даного винаходу є фармало одержати глікозиловані продукти, які цевтичні композиції, що містять вищезазначений справляють сильну дію на пухлинні клітини, що злитий білок природних sIL-6R-IL-6 (химера sILзвичайно не реагують окремо на IL-6 або sIL-6R, і 6R/IL-6), для лікування раку, для застосування які покращують приживлюваність трансплантовапри трансплантації кісткового мозку і для лікуних клітин кісткового мозку людини (див. нижче і вання інших порушень, зумовлених IL-6, наприприклади 1-4). В таких трансплантатах кісткового клад хвороб печінки та неврологічних порушень. мозку химери sIL-6R/IL-6 мають важливе значенІнші цілі й об'єкти даного винаходу будуть роня для виживання і проліферації трансплантовазглянуті нижче або стануть очевидними з поданих некомітованих поліпотентних кровотворних льшого опису цього винаходу. стовбурних клітин. Крім того, з наведених нижче Згідно з цим винаходом одержано кілька злирезультатів експериментів та інших аналізів витих білків (химер), що містять практично всі припливає, що можна одержати різні аналоги химерродні sIL-6R з рідин організму людини і практично ного білка sIL-6R/IL-6 відповідно до цього винавсі зрілі форми природного IL-6 людини, які з'єдходу, які мають практично таку саму біологічну нані короткими лінкерними пептидами завдовжки активність, що і химера sIL-6R/IL-6, причому заблизько 3 амінокислотні залишки або більше, значені аналоги є химерами sIL-6R/IL-6, в яких наприклад 13 амінокислотних залишків (див. ниодин чи кілька амінокислотних залишків, вилучежче і приклади 1 та 2). Однак необхідно зазначині, додані або замінені іншими, і єдиним обмети, що в цих злитих білках лінкерні пептиди моженням таких аналогів є те, що вони повинні збежуть бути відсутні і частина sIL-6R може бути рігати більшу частину природної послідовності приєднана безпосередньо до частини IL-6. ОскіsIL-6R і IL-6. Наприклад, амінокислотні додання в льки лінкери, які являють собою штучні амінокисприродні послідовності sIL-6R і IL-6 обмежені лотні послідовності, можуть бути імуногенними приблизно 20 амінокислотами, і ці додання бажаепітопами, що викликають утворення антитіл у но здійснити на ділянці з'єднання між sIL-6R та ILсуб'єктів, які потребують, бажано мати безпосе6, тобто в молекулі лінкера. В аналогічний спосіб, редньо злиту химеру sIL-6R/IL-6, яка має необз послідовностей sIL-6R і IL-6 можна вилучити не хідну біологічну активність і в той же час максибільше 20-30 амінокислот. Заміни амінокислотних мально зменшує ймовірність індукування таких залишків в послідовностях sIL-6R і IL-6 іншими потенційно шкідливих антитіл при введенні такої амінокислотними залишками більш прийнятно химери. також обмежуються приблизно 20-30 амінокислоЗбереження всієї послідовності sIL-6R, вклютами. Всі вищезазначені делеції, додання й замічаючи Ig-подібний домен, виявлений в природній ни є прийнятними згідно з цим винаходом тільки молекулі, а також необхідне глікозилування та тоді, коли при експресії в клітинах ссавців модиінші посттрансляційні модифікації, що вносяться фіковані таким чином аналоги зберігають біологіклітинами людини або ссавця при продукуванні чну активність химери sIL-6R/IL-6, що складаєтьвищезазначеної химери в таких клітинах, також ся в основному з природних послідовностей, і 9 75321 10 таку ж структуру глікозилування цієї химери. білок і аналоги здатні стимулювати in vivo прижиТаким чином, даний винахід стосується хивлюваність кровотворних клітин людини при трамерного глікозилованого білка розчинного рецепнсплантації кісткового мозку. (XIII) Химерний білок sIL-6R/IL-6 і його біолотора інтерлейкіну-6 (sIL-6R)-iнтepлeйкiнy-6(IL6)(sIL-6R/IL-6) і його біологічно активних аналогів, гічно активні аналоги, де зазначений химерний що включають злитий білковий продукт, одержабілок і аналоги здатні захистити печінку від гепаний шляхом злиття практично всієї природної тотоксичних речовин. форми sIL-6R і практично всієї природної форми Даний винахід стосується також послідовносIL-6, причому зазначений sIL-6R/IL-6 і його аналоті ДНК, що кодує химерний білок sIL-6R/IL-6 і його ги глікозиловані аналогічно глікозилуванню прибіологічно активні аналоги відповідно до цього родних sIL-6R та IL-6. винаходу. Вищезазначений химерний білок відповідно Крім того, даний винахід стосується вектора до цього винаходу має такі варіанти: ДНК, що включає послідовність ДНК, яка кодує (I) Химерний білок sIL-6R/IL-6 і його біологічхимерний білок sIL-6R/IL-6 і його біологічно актино активні аналоги, в яких зазначений sIL-6R зливні аналоги відповідно до цього винаходу, причотий з IL-6 за допомогою молекули пептидного му зазначений вектор придатний для експресії лінкера. зазначеного химерного білка в клітинах ссавців. (II) Химерний білок sIL-6R/IL-6 і його біологічВектор ДНК відповідно до цього винаходу но активні аналоги за пунктом (I), в яких зазначевключає такі варіанти: (I) Вектор ДНК, придатний для експресії заний лінкер є дуже коротким неімуногенним лінкером завдовжки близько 3-4 амінокислотні значеного химерного білка в клітинах людини. (II) Вектор ДНК, де зазначений вектор ексзалишки. (III) Химерний білок sIL-6R/IL-6 і його біологіпресований в клітинах ссавців або людини, ексчно активні аналоги за пунктом (II), в яких зазнапресований химерний білок має послідовність, що дозволяє повністю процесувати химерний чений лінкер є трипептидом послідовності E-F-M білок клітиною ссавця або людини і секретувати (Glu-Phe-Met). (IV) Химерний білок sIL-6R/IL-6 і його біологіповністю процесований химерний білок з клітин в чно активні аналоги за пунктом (I), в яких зазнакультуральне середовище, де вирощуються зазначені клітини. чений лінкер є пептидом, який складається з 13 (III) Вищезазначений вектор ДНК, де зазнаамінокислотних залишків послідовності E-F-G-Aчений вектор визначається як плазміда G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-ValpcDNAsIL-6R/IL-6, яка включає вектор pcDNA3, Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met) (SEQ ID №1). (V) Химерний білок SIL-6R/IL-6, що визначащо містить послідовність ДНК, яка кодує химерний білок sIL-6R/IL-6 під контролем промотору ється як sIL-6R&Val/IL-6, з трипептидним лінкецитомегаловірусу (CMV). ром послідовності E-F-M між С-кінцевим залиш(IV) Вищезазначений вектор ДНК, де зазнаком Val-356 sIL-6R і N-кінцевим залишком Pro-29 чений вектор визначається як плазміда pcDNA IL-6, причому зазначений химерний білок має sIL-6R/L/IL-6, яка включає вектор pcDNA3, що послідовність, показану на Фіг.3. (VI) Химерний білок sIL-6R/IL-6, що визначамістить послідовність ДНК, яка кодує химерний білок sIL-6R/IL-6 під контролем промотору цитоється як sIL-6R5Val/L/IL-6, пептидний лінкер, який мегаловірусу (CMV), і в якому в зазначену посліскладається з 13 амінокислот послідовності E-Fдовність ДНК, що кодує зазначений химерний G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M між С-кінцевим залишком білок sIL-6R/IL-6 вставлено лінкерну послідовVal-356 sIL-6R і N-кінцевим залишком Рго-29 ILність, що кодує лінкерний пептид в сайті EcoRI, 6R, причому зазначений химерний білок має посрозташованому між послідовністю, яка кодує часлідовність, показану на Фіг.З, де трипептид постину sIL-6R, і послідовністю, яка кодує частину ILлідовності E-F-M в положеннях 357-359 на Фіг.З 6 білка. замінений зазначеною пептидною послідовністю, Аналогічним чином даний винахід стосується яка складається з 13 амінокислот. також трансформованих клітин ссавців, які міс(VII) Химерний білок sIL-6R/IL-6, де зазначетять вищезазначений вектор ДНК, що здатний ний білок продукований в клітинах ссавців у повекспресувати послідовність химерного білка sILністю процесованій формі . 6R/IL-6, що переноситься зазначеним вектором, (VIII) Химерний білок sIL-6R/IL-6, де зазначеповністю процесувати експресований білок і секний білок продукований у клітинах людини. ретувати його в культуральне середовище, де (IX) Химерний білок sIL-6R/IL-6, де зазначевирощуються зазначені клітини. ний білок продукований у клітинах яєчника китайОдним варіантом цих трансформованих кліського хом'яка (СНО). тин є описані тут клітини нирки ембріона людини (X) Химерний білок sIL-6R/IL-6 і його біологіч293 (НЕК293), трансфековані вектором pcDNA но активні аналоги, де зазначений химерний біsIL-6R/IL-6, зазначені клітини здатні експресувати лок і аналоги здатні пригнічувати ріст високозлохимерний білок sIL-6R/IL-6, повністю процесувати якісних ракових клітин. і секретувати зазначений білок в культуральне (XI) Химерний білок sIL-6R/IL-6 і його біологісередовище, де вирощуються зазначені клітини, чно активні аналоги, де зазначений химерний у формі глікопротеїну з молекулярною масою білок і аналоги здатні пригнічувати ріст злоякісблизько 85кДа. них меланомних клітин. Іншим варіантом трансформованих клітин є (XII) Химерний білок sIL-6R/IL-6 і його біолоописані тут клітини СНО (яєчника китайського гічно активні аналоги, де зазначений химерний 11 75321 12 хом'яка), трансфековані вектором pcDNA sILня хвороб печінки і неврологічних порушень або 6R/IL-6, зазначені клітини здатні експресувати для підсилення гемопоезу, або для інших цілей, химерний білок sIL-6R/IL-6, повністю процесувати пов'язаних з використанням IL-6 або sIL-6R. і секретувати зазначений білок в культуральне Даний винахід стосується також способу лісередовище, де вирощуються зазначені клітини, кування різних видів раку у ссавців, або для поку формі глікопротеїну з молекулярною масою ращення приживлюваності клітин при транспланблизько 85кДа. тації кісткового мозку, або для лікування хвороб Даний винахід стосується також способу печінки і неврологічних порушень, або для підсиодержання химерного білка або його біологічно лення гемопоезу, чи для інших цілей, пов'язаних активних аналогів, який включає вирощування застосуванням IL-6 або sIL-6R, який полягає в вищезазначених трансформованих клітин в умотому, що пацієнту вводять вищезазначену фарвах, прийнятних для експресії, процесування і мацевтичну композицію у вигляді прийнятної лісекреції зазначеного білка або його аналогів в карської форми і згідно з прийнятним способом культуральне середовище, де вирощуються завведення. значені клітини; і очистку зазначеного білка або Для запобігання неясності слід зазначити, що його аналогів від культурального середовища даний винахід стосується химери між IL-6 і sILімуноафінною хроматографією з використанням 6R, розташованим в будь-якому порядку, тобто моноклональних антитіл, специфічних відносно N-кінцеву і С-кінцеву частини можна поміняти до sIL-6R. місцями, і тоді химера являтиме собою білок IL-6Химерний білок відповідно до цього винаходу sIL-6R, хоча в цьому описі винаходу він визначамає ряд застосувань, які включають: ється як білок sIL-6R/IL-6. (I) застосування химерного білка sIL-6R/IL-6 Інші цілі та варіанти здійснення даного винаходу розглянуті нижче або є очевидними з подаабо його аналогів, солей і сумішей в якості інгібіторів ракових клітин. ного нижче докладного опису цього винаходу. (II) застосування аналогічно пункту (I) в якосСтислий опис креслень На Фіг.1 (А, В) подане схематичне зображенті інгібітору високо злоякісних меланомних клітин. (III) застосування химерного білка sIL-6R/IL-6 ня різних векторів, реагентів і стадій процесу, які використовуються для конструювання химерної або його аналогів, солей і сумішей в якості активмолекули ДНК, що кодує химерний білок, в якому ного інгредієнта для покращення приживлюванозбережена структура природної форми sIL-6R, сті кровотворних клітин людини при транспланщо закінчується у залишку Val 356, і послідовностації кісткового мозку. (IV) застосування химерного білка sIL-6R/IL-6 ті природної, зрілої, процесованої форми IL-6, яка слідує за нею, як це докладно описано в приабо його аналогів, солей і сумішей в якості активкладі 1. ного інгредієнта для підсилення гемопоезу, лікуНа Фіг.2 (А, В) показані результати аналізу з вання хвороб печінки і неврологічних порушень та для інших цілей, пов'язаних з використанням ідентифікації химери sIL-6R Val/IL-6 p86 електIL-6 або sIL-6R. рофорезом в поліакрила-мідному гелі (А) і на Химерний білок відповідно до цього винаходу основі профілю біологічної активності (В), при можна аналогічним чином застосовувати для цьому на Фіг.2А подане зображення гелю, забародержання лікарських засобів для ряду медичних вленого кумасі, на якому електрофорезом виявпоказань, зокрема химерний білок sIL-6R/IL-6 або лені фракції, очищені імуносорбційним методом його аналоги, солі і суміші можна застосовувати та елюйовані з колонок для афінної хроматоградля одержання лікарських засобів, призначених фії, заповнених зразком секретованого білка, для лікування різних видів раку шляхом пригніодержаного з культур клітин, трансфекованих чення росту ракових клітин, або для одержання вектором, що кодує химерний білок; і на Фіг.2В лікарського засобу для стимуляції приживлюванаведено репрезентативний графік біологічної ності кровотворних клітин при трансплантації активності (пригнічення росту меланомних клітин кісткового мозку, або для одержання лікарського F10.9) всіх вищезазначених фракцій, елюйованих засобу для підсилення гемопоезу, або для одерз колонок для афінної хроматографії, як це дожання лікарського засобу для лікування невролокладно описано в прикладах 2 і 3. гічних порушень, або для одержання лікарського На Фіг.З показано амінокислотну послідовзасобу для інших цілей, пов'язаних із застосуванність (однобуквений код) химери sIL-6R5Val/IL-6, ням IL-6 або sIL-6R. в якій вказані різні домени молекули, у тому числі Крім того, даний винахід стосується фармаN-кінцевий сигнальний пептид (лінія поверх посцевтичної композиції, яка містить в якості активлідовності), імуноглобуліноподібний (Ig-подібний) ного інгредієнта химерний білок sIL-6R/IL-6 або домен, N-домен рецептора цитокіну (підкреслейого аналог і фармацевтично прийнятний носій, ний), С-домен цитокіну (лінія поверх послідовносрозріджувач або наповнювач. ті) і передмембранна область рецептора (обФармацевтична композиція відповідно до ласть між С-доменом і трансмембранним цього винаходу включає такі варіанти: доменом), вся частина sIL-6R химери; а також (I) Фармацевтична композиція для лікування зріла частина химери IL-6 (підкреслена знизу), як різних видів раку ссавців. це описано в прикладах 1 і 2. (II) Фармацевтична композиція для покраНа Фіг.4 (А, В) показані фотографії меланомщення приживлюваності клітин при трансплантаних клітин F10.9 в культурі, необроблені (А) і обції кісткового мозку. роблені (В) химерним білком sIL-6R/IL-6 протягом (III) Фармацевтична композиція для лікуван4 днів, при цьому на Фіг.4В видні морфологічні 13 75321 14 зміни, викликані химерою sIL-6R/IL-6 в метаставності, що виявляється відносно до меланомних тичних меланомних клітинах (клітини F10.9), як клітин, зображених на Фіг.9, химерою 3е (темні це описано в прикладі 3. заштриховані зірочки), порівняно з химерою sILНа Фіг.5 подане графічне зображення ре6R/IL-6 (заштриховані квадрати) і двома мутанзультатів, які показують пригнічення росту мелатами (Mutt 39 (HD) - заштриховані ромби) і (Mutt номних клітин F10.9 химерним білком sIL-6R/IL-6, NHD - світлі заштриховані зірочки), як це описущо використовується в різних концентраціях від ється в прикладі 9. близько 0,12нг/мл до близько 150нг/мл, де химеДаний винахід стосується химерного білка ра IL-6R/IL-6, яка має лінкер завдовжки близько 3 sIL-6R/IL-6 і його біологічно активних аналогів, які амінокислоти, описана в прикладі 3, порівнюється містять практично всі природні форми sIL-6R і з химерою, яка має лінкер завдовжки 13 амінокипрактично всі природні форми IL-6, злиті одна з слот (IL-6R/IL-6). одною, в яких сайт злиття може бути лінкерним На Фіг.6 подане графічне зображення репептидом завдовжки 3 амінокислоти, при цьому зультатів, які показують відсутність пригнічуючої химерний білок sIL-6R/IL-6 і його аналоги мають ріст дії на меланомні клітини F10.9 окремо видітаку саму величину і структуру глікозилування, леного IL-6 (верхня пунктирна крива з не заштрищо і природні sIL-6R і IL-6. Встановлено, що хихованими квадратами) в концентраціях 0-40нг/мл мерний білок sIL-6R/IL-6, одержаний згідно з цим IL-6 і окремо виділеного sIL-6R (точка сходження винаходом в клітинах ссавців, зокрема в клітинах всіх кривих на вертикальній осі, де концентрація людини (див. наведені нижче приклади 1-4) або в IL-6 дорівнює нулю); а також дію, що спостерігаклітинах СНО (див. наведений нижче приклад 6), ється, пригнічення росту при спільному доданні ефективно експресується в таких клітинах, добре IL-6 і sIL-6R в різних концентраціях, де IL-6 має глікозилується і справляє сильну дію на пухлинні концентрацію від 10нг/мл до 40нг/мл та sIL-6R клітини, які зовсім не реагують на застосовувані доданий в трьох концентраціях, які дорівнюють окремо IL-6 або sIL-6R. 100нг/мл, 200нг/мл і 400нг/мл, на кожну концентЗокрема, згідно з цим винаходом виявлено рацію IL-6, як це показане трьома нижніми кри(див. наведені нижче приклади 1-3), що вищезавими (дві пунктирні криві з не заштрихованими значений химерний білок sIL-6R/IL-6 відповідно трикутниками і колами та суцільна крива з задо цього винаходу пригнічує ріст надзвичайно штрихованими квадратами), аналогічно призлоякісних клітин ссавців, таких як меланомні кладу 3. клітини F10.9, в більш низьких концентраціях поНа Фіг.7 зображено авторадіограму саузернрівняно з тими, які необхідні при використанні блотинга, що показує вимоги, які висуваються до суміші незлитих sIL-6R і IL-6. Це особливо важхимерного білка sIL-6R/IL-6 для покращення приливо з урахуванням того, що меланомні клітини живлюваності кровотворних стовбурових клітин F10.9 продовжують рости без зміни після їх облюдини при трансплантації кісткового мозку миробки окремо IL-6 або sIL-6R, і їх ріст припиняшам SCID-NOD (дві розташовані праворуч смуги, ється лише під впливом відносно високих доз що стосуються мишей, які одержували химерний суміші незлитих IL-6 і sIL-6R. Химерний білок sILбілок sIL-6R/IL-6 додатково до інших необхідних 6R/IL-6 відповідно до цього винаходу є значно факторів, SCF, FLT-3, порівнюються з трьома більш сильнодіючим інгібітором високозлоякісних розташованими ліворуч смугами, що стосуються меланомних клітин, ніж суміш його окремих часмишей, які одержували лише SCF і FLT-3 та SCF, тин, тобто суміш незлитих IL-6 і sIL-6R. Таким FLT-3, а також окремо виділені, тобто незлиті IL-6 чином, химерний білок відповідно до цього винаі sIL-6R), як це описується в прикладі 4. ходу особливо корисний в якості активного інгреНа Фіг.8 зображено графік Скетчарда, який дієнта для лікування різних видів раку. показує характеристики спорідненості химери sILВважається, що більш висока активність хи6R/IL-6 порівняно сумішшю IL-6 і sIL-6R, де знамерного білка sIL-6R/IL-6 пов'язана з його більш чення химери зображені заштрихованими квадвисокою спорідненістю до gp130 порівняно з суратами і значення суміші показані заштриховамішшю незлитих IL-6 і sIL-6R (приклад 7). ними ромбами, при цьому відношення нахилів Крім того, встановлено, що (див. наведений кривої становить 4:1. нижче приклад 4) химерна молекула sIL-6R/IL-6 На Фіг.9 зображений графік більш високої аквідповідно до цього винаходу є особливо користивності химери sIL-6R/IL-6 відносно до меланоною для підсилення приживлюваності клітин при мних клітин F10.9, порівняно з активністю суміші трансплантації кісткового мозку. Дійсно, при виsIL-6R+IL-6 або sIL-6R (без IL-6). конанні відомої методики трансплантації клітин На Фіг.10 показані результати захисту, який кісткового мозку людини мишам з важким комбізабезпечується химерою sIL-6R/IL-6 проти токсинованим імунодефіцитом (SCID), у яких фактор козу печінки, де цифрові величини представлястовбурових клітин (SCF) і Flt3-лiгaнд використані ють середнє значення 4 експериментів, заштридля стимуляції виживання і проліферації самих ховані квадрати стосуються IL-6-/-мишам, простих поліпотентних кровотворних стовбурових заштриховані ромби належать IL-6-/-мишам, які клітин, здатних протягом тривалого часу зберігаодержували IL-6, і заштриховані зірочки відповіти життєздатність в кістковому мозку реципієнта, дають IL-6-/-мишам, які одержували химеру. встановлено, що ці два фактори, SCF і Flt3На Фіг.11 зображена амінокислотна послідолiгaнд, є недостатньо активними, щоб стимулювність (однобуквений код) химери 3е IL-6-sILвати приживлюваність клітин людини в кістковому мозку миші-реципіента, і що трансплантація 6R Val, в якій підкреслено лінкер. виявляється успішною лише при додатковому На Фіг.12 зображений графік біологічної акти 15 75321 16 використанні химерного білка sIL-6R/IL-6. Це відлотних залишків, при цьому обидва химерні білки криття показує, що химерний білок можна ефекхарактеризуються практично однаковою біологічтивно використовувати при здійсненні такої транною активністю. сплантації. Використання в тих самих Даний винахід стосується також аналогів виекспериментах незлитих IL-6 і sIL-6R при роздіщезазначеного химерного білка sIL-6R/IL-6 відпольному доданні не дозволяє успішно стимулювавідно до цього винаходу, де аналоги мають практи трансплантацію кісткового мозку і при спільтично таку саму біологічну активність химерного ному доданні вони виявляються значно менш білка, оскільки містять лише природні послідовактивними, ніж химерний білок sIL-6R/IL-6, тобто ності sIL-6R і IL-6. Такі аналоги є білками, в яких при ефективній концентрації, що дорівнює може бути вилучено, додано або замінено до 30 100нг/мл, химерний білок sIL-6R/IL-6 ефективно амінокислотних залишків в частинах sIL-6R і/або стимулює трансплантацію кісткового мозку, у той IL-6 химерного білка з урахуванням того, що мочас як два окремі незлиті sIL-6R та IL-6, що додифікації такого типу не повинні істотно змінювадаються разом навіть в більш високих концентти біологічну активність аналогу химерного білка раціях (sIL-6R в концентрації 125-1250нг/мл, IL-6 відносно до самого химерного білка, при цьому в концентрації 50-200нг/мл), значно менш активчастина sIL-6R таких аналогів практично повністю но стимулюють таку трансплантацію. зберігає природну структуру (до процесування Вищезазначений химерний білок sIL-6R/IL-6 див. Фіг.3) сигнального пептиду, Ig-подібного довідповідно до цього винаходу більш прийнятно є мену, N-домену рецептора цитокіну, С-домену рекомбінантною глікозилованою химерою sILрецептора цитокіну і передмембранного домену 6R/IL-6, продукованою в клітинах людини або в рецептора. Аналогічно, такі аналоги химерного будь-якій прийнятній експресувальній системі білка повинні практично повністю зберігати приклітин ссавців, такій як клітини яєчника китайськородну зрілу форму частини IL-6. Різні аналоги го хом'яка (СНО), що здатна глікозилувати білки можуть істотно відрізнятися один від одного і від аналогічно клітинам людини і вносити такі самі основної молекули химерного білка (що містить посттрансляційні модифікації, що і клітини людилише природні послідовності sIL-6R і IL-6) в сайті ни. Важливою особливістю є те, що одержаний лінкерного пептиду, який з'єднує частини sIL-6R і таким чином химерний глікопротеїн процесоваIL-6 в химерному білку. Такий лінкер може мати ний і модифікований так само, як природні батьдовжину до 30 амінокислот і служить для віддіківські молекули sIL-6R і IL-6, виявлені в організмі лення частин sIL-6R і IL-6 одна від одної в химерлюдини, без зрізання і додання чужорідних, що ному білку. Що стосується такого лінкера, треба не трапляються не в природі, поліпептидних посдуже уважно вибирати його послідовність (і потім лідовностей, за винятком дуже короткого трипепвиконати біологічні випробування кожного такого тиду або більш довгого лінкерного пептиду, який аналогу прийнятними стандартними методами), вводиться між частинами sIL-6R і IL-6 химерного щоб помилковий вибір не став причиною невірної білка. укладки ланцюгів в химерному білку, в результаті Щоб одержати вищезазначений більш прийнчого він може втратити активність, або не призвів ятний химерний білок відповідно до цього винадо одержання аналогу химерного білка, проти ходу, необхідно врахувати такі особливості приякого імуногенний білок почне виробляти антитіродних sIL-6R і IL-6. Відомо, що IL-6R, наявний в ла в організмі пацієнта, внаслідок чого такий анаклітинних мембранах людини, продукується лог виявиться неефективним, принаймні, в якості кДНК, що кодує 468 амінокислот, які утворюють лікарського засобу середнього або тривалого сигнальний пептид, імуноглобуліноподібний (Ig) лікування. домен, домен зв'язування цитокіну, трансмембЩо стосується вищезазначених аналогів хиранну область і цитоплазматичний домен мерного білка відповідно до цього винаходу, ци[Yamasaki et al., 1988]. Розчинна форма sIL-6R ми аналогами є білки, в яких від одного до близьвиявлена в рідинах організму і подібно зрілому ко 30 амінокислотних залишків основного IL-6R, виділеному з мембран, має N-кінець, що химерного білка відповідно до цього винаходу відповідає залишку Leu-20 [Novick et al., 1990], і замінені іншими амінокислотними залишками або С-кінець, що відповідає залишку Val-356, безповилучені, або один чи кілька амінокислотних засередньо перед трансмембранною областю IL-6R лишків додані до первісної послідовності химер[див. спільний патент США №5216128 і європейного білка відповідно до цього винаходу (яка місський патент №413908 В1]. Щоб злити послідовтить лише природні послідовності sIL-6R і IL-6) ність sIL-6R з IL-6, після Val-356 вводять сайт без істотної зміни активності одержаних продуктів рестрикції EcoRI. Послідовність зрілого IL-6, яка порівняно з основним химерним білком відповідпочинається у залишку Рго-29 кДНК IL-6 і закінчуно до цього винаходу. Ці аналоги одержують віється у залишку Met-212 [Zilber-stein et al., 1986; домими методами синтезу і/або сайтспрямованоHirano et al., 1986], вводять слідом за сайтом го мутагенезу або будь-яким іншим відомим EcoRI. В сайт EcoRI можна, хоча і необов'язково, методом, придатним для цієї мети. ввести лінкерний пептид необхідної довжини, Будь-який такий аналог більш прийнятно має щоб відділити частини sIL-6R і IL-6 одна від одної послідовність амінокислот, яка достатньо точно в химерному білку. Як описано нижче, в якості відповідає амінокислотній послідовності основної можливих прикладів таких химерних білків одерхимери sIL-6R/IL-6, що надає йому практично жані два різні химерні білки, в сайт EcoRI одного таку саму активність. Таким чином, визначити у з яких введений трипептидний лінкер, а в інший даного аналогу наявність такої ж активності, що і введений лінкер, який складається з 13 амінокису основного химерного білка відповідно до цього 17 75321 18 винаходу, можна звичайним експериментуванамінокислот в химерному білку, що складається в ням, згідно з яким аналог випробовують на актиосновному з природних послідовностей sIL-6R і вність згідно з наведеними нижче прикладами IL-6, можуть включати тотожні амінокислоти, що 2-4. входять до групи зі схожими фізико-хімічними Аналоги химерного білка, які можна викорисвластивостями, завдяки чому при заміні членів товувати при здійсненні даного винаходу, або цієї групи зберігаються біологічні функції молекунуклеїнові кислоти, що їх кодують, включають ли [Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 обмежену сукупність відповідних послідовностей (1974)]. Очевидно, що інсерції і делеції амінокисв якості замінних пептидів або полінуклеотидів, лот можуть також здійснюватись в вищезазначеякі можуть бути одержані фахівцем у цій галузі них послідовностях без зміни їх функції, особливо без зайвого експериментування на основі полоякщо ці інсерції або делеції включають лише кіжень і вказівок, наведених в цьому описі винахолька амінокислот, наприклад менше тридцяти, ду. Для більш докладного ознайомлення з хімією більш прийнятно менше десяти, і не призводять і структурою білків зверніться до наукових [робіт до вилучення або зміни положення амінокислот, Schulz, G.E. et al., Principles of Protein Structure, що мають важливе значення для функціональної Springer-Verlag, New York, 1978; і Creighton, Т.Е., конформації, наприклад залишків цистеїну [AnfinProteins: Structure and Molecular Properties, W.H. sen, "Principles That Govern The Folding of Protein Freeman & Co., San Francisco, 1983], що включені Chains", Science, Vol. 181, pp. 223-230 (1973)]. в цей опис винаходу в якості посилання. Заміни в Аналоги, одержані в результаті таких делецій нуклеотидній послідовності, такі як більш прийняі/або инсерцій, входять до обсягу даного витні кодони, описані в [наукових роботах Ausubel находу. et al., supra, §§ A.I. 1-А. 1.24 і Sambrook et al., CurБільш прийнятні групи тотожних амінокислот подані в таблиці I. Ще більш прийнятні групи тоrent Protocols in Molecular Biology, Interscience тожних амінокислот наведені в таблиці II і найN.Y, §§ 6.3 і 6.4 (1987, 1992)], в додатках С і D. Більш прийнятні зміни, що вносяться в анабільш прийнятні групи тотожних амінокислот подані в таблиці III. логи відповідно до цього винаходу, відомі як "консервативні" заміни. Консервативні заміни Таблиця I Більш прийнятні групи тотожних амінокислот Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Lie Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Тотожна група Ser, Thr, Gly, Asn Arg, Gln, Lys, Glu, His Iie, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Gly, Ala, Thr, Pro Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr Gly, Thr, Pro, Ala Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Val, Leu, He Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Ser, Thr, Cys Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin Gln, Asp, Ser, Asn Glu, Gin, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp 19 75321 20 Таблиця II Ще більш прийнятні групи тотожних амінокислот Амінокислота Тотожна група Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Ser His, Lys, Arg Leu, Ile, Phe, Met Aia, Pro Thr Pro, Aia Val, Met, Ile Gly Ile, Met, Phe, Val, Leu Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Phe, Tyr Cys, Ser His, Gin, Arg Glu, Gln, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gln Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp Таблиця III Найбільш прийнятні групи тотожних амінокислот Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Приклади виконання замін амінокислот в білках, які можна використовувати для одержання аналогів химерного білка відповідно до цього винаходу, включають будь-які відомі методи, зокрема описані в [патентах США №№RE 33653, 4959314, 4588585 і 4737462, виданих Марку та ін.; №5116943, виданому Котсу та ін., №4965195, виданому Намену та ін., №4879111, виданому Чонгу та ін., і №5017691, виданому Лі та ін.; і білки з заміненим лізином, описані в патенті США №4904584 (Shaw et al.)]. Згідно з іншим більш прийнятним варіантом здійснення даного винаходу будь-який аналог химерного білка відповідно до цього винаходу має амінокислотну послідовність, яка практично відповідає амінокислотній послідовності вищеза Тотожна група Ser Arg Leu, Ile, Met Pro Thr Ala Val Gly Ile, Met, Leu Phe Tyr Cys, Ser His Gln Asn Lys Asp Glu Met, Ile, Leu Met значеного основного химерного білка. Термін "практично відповідає" означає аналоги з незначними змінами послідовності основного химерного білка, що не впливають на його основні характеристики, зокрема на його здатність пригнічувати проліферацію ракових клітин або стимулювати приживлюваність клітин при трансплантації кісткового мозку. Зміни, які звичайно входять у визначення "практично відповідає", одержують в результаті виконання звичайних методів мутагенезу ДНК, що кодує химерний білок відповідно до цього винаходу, які дозволяють одержати кілька незначних модифікацій, і тестування одержаних аналогів з метою виявлення необхідної активності, як це описувалося вище. Аналоги відповідно до цього винаходу вклю 21 75321 22 чають білки, закодовані нуклеїновою кислотою, мати таку саму активність, що і химерний білок такою як ДНК або РНК, що гібридизує з ДНК або відповідно до цього винаходу або його аналоги. РНК в суворих умовах і кодує химерний білок Даний винахід стосується також послідовносвідповідно до цього винаходу, який складається тей ДНК, які кодують вищезазначений химерний практично повністю з природних послідовностей, білок відповідно до цього винаходу і його аналоякі кодують sIL-6R і IL-6. Наприклад, така гібридиги, а також векторів ДНК, що несуть такі послідозуюча ДНК або РНК може кодувати той самий вності ДНК для експресії в клітинах підхожих ссабілок відповідно до цього винаходу, що має, навців, більш прийнятно людини. Одним з варіантів приклад, послідовність, показану на Фіг.З, але вектора відповідно до цього винаходу є плазміда відрізняється своєю нуклеотидною послідовністю pcDNA SIL-6R/IL-6, яка включає вектор pcDNA3 від природної нуклеотидної послідовності внаслі(Invitrogen), що містить злиті послідовності sILдок виродженості генетичного коду, тобто дещо 6R/IL-6, одержані під контролем промотору цитовідмінна послідовність нуклеїнових кислот може мегаловірусу (CMV). як і раніше кодувати ту ж амінокислотну послідоДаний винахід стосується також трансфорвність з урахуванням зазначеної виродженості. мованих клітин ссавців, більш прийнятно людини, Крім того, як вказувалося вище, число змін аміноклітин, здатних експресувати вищезазначені білкислот (делеції, додання, заміни) обмежена, прики відповідно до цього винаходу. Одним з варіанблизно, 30 амінокислотами, тому навіть при мактів таких трансформованих клітин є клітини нирки симальному числі, замін аналоги відповідно до ембріона людини 293 (НЕК 293, АТСС CRL 1573), цього винаходу все ж зберігають лідерну послітрансфековані pcDNA sIL-6R/IL-6, що секретують довність (до процесування), Ig-подібний домен, злиту химеру sIL-6R/IL-6 у вигляді глікопротеїну з N- і С-кінцеві домени рецептора цитокіну і передмолекулярною масою 85кДа. мембранну область рецептора (область між СЩе один варіант здійснення винаходу вклюкінцевим доменом і трансмембранним доменом) чає плазміду pcDNA sIL-6R/L/IL-6, яка відрізняв частині sIL-6R і практично всю частину IL-6. ється від вищезазначеної pcDNA sIL-6R/IL-6 Така нуклеїнова кислота буде кандидатом номер вставкою в сайт EcoRI коротких лінкерів, що коодин для визначення, чи кодує вона поліпептид, дують 10 додаткових амінокислот. Можна ввести який зберігає функціональну активність химерноцілий ряд послідовностей різної довжини, щоб го білка відповідно до цього винаходу. Термін оптимізувати відстань між sIL-6R і IL-6. "суворі умови" означає умови гібридизації і подаДо винаходу входить також химерний білок, в льшого промивання, які фахівці в цій галузі звиякому частина IL-6 передує sIL-6R (як це показачайно визначають як "суворі". Див. [Ausubel et al., не на Фіг.11). Current Protokols in Molecular Biolody, supra, InДаний винахід далі стосується способу одерterscience, N.Y., para. 6.3 arid 6.4 (1987, 1992) і жання і очистки химерного білка відповідно до Sambrook et al., supra]. Приклади суворих умов цього винаходу або його аналогів, який включає без будь-яких обмежень включають умови провирощування вищезазначених трансформованих клітин в умовах, прийнятних для експресії та секмивання при температурі на 12-20 C нижчій від реції химерного білкового продукту в культуральрозрахованої температури досліджуваного гібрине середовище і подальшу очистку секретованоду, наприклад 2 SSC і 0,5% SDS протягом 5 го білка імуноафінною хроматографією з хвилин, 2 SSC і 0,1% SDS протягом 15 хвилин; використанням моноклональних антитіл 34.4 про0,1 SSC і 0,5% SDS при 37 C протягом 30-60 ти sIL-6R, як це описане в наведених нижче прихвилин і потім 0,1 x SSC і 0,5% SDS при 68°С кладах 2 і 5. протягом 30-60 хвилин. Фахівцям у цій галузі поВинахід стосується також фармацевтичної винно бути зрозуміло, що суворість умов залекомпозиції, що містить в якості активного інгредіжить також від довжини послідовностей ДНК, єнта химеру sIL-6R/IL-6, її аналоги, суміші або олігонуклеотиних зондів (10-40 основ) або змішасолі і фармацевтично прийнятний носій, розріних олігонуклеотидних зондів. У випадку змішаджувач або наповнювач. Одним з варіантів фарних зондів бажано використовувати хлорид тетмацевтичної композиції відповідно до цього винараметиламонію (ТМАС) замість розчину хлориду і ходу є фармацевтична композиція для цитрату натрію (SSC). Див. [Ausubel], вище. підсилення дії IL-6, для лікування різних видів Термін "солі" означає як солі карбоксильних раку, для стимуляції приживлюваності клітин при груп, так і солі з приєднанням кислоти по аміногтрансплантації кісткового мозку, для підсилення рупі химерного білка відповідно до цього винахогемопоезу, зокрема тромбоцитопоезу, для лікуду або його аналогів. Солі карбоксильної групи вання неврологічних порушень і хвороб печінки, можуть бути одержані відомими методами і та для інших цілей, пов'язаних з використанням включають неорганічні солі, наприклад солі наIL-6 або споріднених цитокінів. трію, кальцію, амонію, заліза або цинку тощо, і Фармацевтичні композиції відповідно до цьосолі з органічними основами, одержані, наприго винаходу одержують у вигляді лікарських клад, при взаємодії з амінами, такими як триетаформ, змішуючи химерний білок або його аналоноламін, аргінін або лізин, піперидин, прокаїн ги з фізіологічно прийнятними носіями і/або статощо. білізаторами і/або наповнювачами, і одержують Солі з приєднанням кислоти включають, надозовану форму, наприклад за допомогою ліофіприклад, солі з мінеральними кислотами, такими лізації в дозуючих пробірках. Способом введення як хлористоводнева або сірчана кислоти, і солі з може бути будь-який відомий спосіб введення, органічними кислотами, такими як оцтова або прийнятний для аналогічних засобів і залежить щавлева кислоти. Всі ці солі повинні, звичайно, 23 75321 24 від стану захворювання, яке треба лікувати, нарагований електрофорезом в агарозному гелі, приклад внутрішньовенно, внутрішньом'язово, клонують в новому векторі pBS/SK, відкритому в підшкірно, шляхом місцевої ін'єкції, місцевого EcoRV сайта MCS (pBS/SK-sIL-6R-RV на Фіг.1). застосування або безперервного вливання тощо. Вищезазначену, раніше одержану ДНК Кількість активної сполуки, що вводиться, залеpBS/SK-IL-6R піддають полімеразній реакції синжить від способу введення, захворювання і стану тезу ланцюга (PCR), щоб ампліфікувати фрагпацієнта. Місцеві ін'єкції, наприклад, вимагають мент завдовжки 368п.о. між верхньою затравкою меншої кількості білка в розрахунку на масу тіла, 1137-1156 і нижньою затравкою 1505-1488. Нижніж внутрішньовенне вливання. ню затравку синтезують за допомогою сайта Даний винахід стосується також застосуванEcoRI, який розташований відразу ж після кодона ня химерного білка відповідно до цього винаходу, валіну-356 IL-6R (див. Фіг.1), оскільки раніше буйого аналогів або сумішей для лікування різних ло встановлено, що цей залишок валіну є аміновидів раку, для стимуляції приживлюваності клікислотою з карбоксильним кінцем природної фотин при трансплантації кісткового мозку, для підрми розчинного sIL-6R, що виділяється в сечі силення гемопоезу, особливо тромбоцитопоезу, людини [Novick et al., 1990; Oh et al., 1996; патент для лікування неврологічних порушень, для захиСША №5216128, що належить обом авторам, і сту тканин печінки у суб'єктів, які страждають на європейський патент №ЕР 413908 В1]. Продукт некрози, що викликаються хімічними речовинами полімеразної реакції синтезу ланцюга розрізають (наприклад, тетрахлорметаном, алкоголем, паEcoRV і EcoRI та лігують в pBS/SK-sIL-6R-RV між рацетамолом) або іншими причинами (наприсайтом EcoRV IL-6R і сайтом EcoRI MCS (Фіг.1). клад, вірусною інфекцією, хірургічним втручанОдержану плазміду pBS-sIL-6R- Val-RI укорочуням) і для інших цілей, пов'язаних з ють, щоб вилучити 5'-кінцеві нетрансльовані посвикористанням IL-6 або споріднених цитокінів. лідовності шляхом лігування сайта HindIII MCS з Аналогічно даний винахід стосується також хисайтом Ncol у пари основ 410 IL-6R (обидва саймерного білка, його аналогів або сумішей, що ти спочатку дефосфолірують), що дозволяє одезастосовуються для одержання лікарських засоржати pBS-sIL-6R- Val-RI-NcoI (Фіг.1). бів, призначених для лікування вищезазначених Послідовність IL-6 виділяють з плазміди порушень або згідно з розглянутими вище покаpKK(2-7, що була сконструйована аналогічно заннями. описаному способу [Chen et al., 1988] шляхом Окрім вищезазначених способів лікування вставки кДНК IFN-(2/IL-6, вирізаної BstNI, химеру і/або ДНК, що її кодує, можна також вико[Zilberstein et al., 1986] в сайт EcoRI експресуючористовувати для виконання процедур ex-vivo і го вектора рКК223-2 E.coli [Pharmacia, Uppsala, генотерапії. Sweden], використовуючи синтетичний олігонукДаний винахід далі більш докладно описулеотид з сайтом EcoRI, за яким слідує кодон меється в наведених нижче прикладах, які не обметіоніну і кодон проліну-29 IL-6, що закінчується в жують його обсяг, та на кресленнях, що досайті BstNI (EcoRII). кДНК-вставка pKK(2-7 IL-6 даються. закінчується через 7 пар основ після термінуючоПриклад 1: Конструювання експресуючого го кодона в сайті NlalV, за яким через 11 пар освектора химери sIL-6R5Val/IL-6 нов розміщений сайт HindIII вектора рКК-223-3 На Фіг.1 зображений схематичний графік по(Фіг.1). ДНК сККв2-7 розрізають HindIII, дефосслідовності технологічних операцій, що виконуфолірують і знову розрізають EcoRI, після чого ються для конструювання експресуючого вектокДНК IL-6 вставляють в pBS-sIL-6R- Val-RI-NcoI ра, який несе послідовність, що кодує химерний для злиття зрілої послідовності IL-6 (яка починабілок sIL-6R5Val/IL-6, включаючи всі початкові і ється у проліну-29) з IL-6R відразу ж після валінупроміжні вектори, різні реагенти та стадії реакції. 356, при цьому вони розділені всього 3 кодонами Ця методика конструювання включає методи, (Glu-Phe-Met). Одержану плазміду pBS/SK-sILдобре відомі в галузі конструювання вибраних 6R/IL-6 (Фіг.1) знову розрізають в сайтах Sali та експресуючих векторів [див., наприклад, Noti MCS і цю вставку клонують в сайті EcoRV Sambrook et al., 1989]. Суть цієї методики можна pcDNA3 [Invitrogen Corporation, San Diego, коротко описати так. California]. Одержана плазміда pCDNA3-sIL-6R/ILБібліотеку кДНК, одержану з клітин T47D ка6 (Фіг.1) містить вставку внизу від сильного прорциноми молочної залози людини, клонують в мотору цитомегаловірусу (CMV), за якою слідує бактеріофагу лямбда ( ) gtll і тестують олігонуксайт поліаденілування, який забезпечує ефектилеотидними зондами, виділеними з послідовності вну транскрипцію химери sIL-6R5Val/IL-6. ЗбереIL-6R, за методом Ямасакі та ін. [Yamasaki et al., ження 5'-кінця sIL-6R в химері гарантує, що при 1988]. Виділяють один клон к днк gtll, який має експресії в клітинах ссавців функція сигнального повну послідовність, що кодує IL-6R людини. пептиду і процесування N-кінця химерного білка Вставку вирізають з gtll за допомогою EcoRI і будуть такими самими, як у природного sIL-6R. клонують в сайті множинного клонування (MCS) Як вказувалося вище, перевагою конструкції фагіміду Е. coli Blue Script pBS/SK [Stratagene sIL-6R5Val/IL-6 є те, що вона одержана в резульCloning Systems, LaJolla, California]. Плазміду таті злиття природних форм sIL-6R і IL-6 у тому pBS/SK-IL-6R (Фіг.1) розрізають EcoRI, дефосфовигляді, як вони існують в організмі людини, без лірують і знову розрізають EcoRV, щоб виділити використання чужорідних поліпептидних послідо5'-фрагмент IL-6R, який складається з 959 пар вностей. Однак збереження сайта EcoRI в консоснов (п.о.) і закінчується в сайті EcoRV рецептотрукції sIL-6R Val/IL-6 (Фіг.1) дозволяє легко ввера IL-6R (координата 1203). Цей фрагмент, екстсти сегменти лінкерного поліпептиду між 25 75321 26 частинами sIL-6R і IL-6. Крім того, була сконструка електрофорезом в поліакриламідному гелі з йована ще одна конструкція з лінкерною послідододецилсульфатом натрію показує наявність хавністю завдовжки 13 амінокислот Glu-Phe-Glyрактерної смути білка, забарвленої кумасі блакиAla-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, введетним (Фіг.2). Молекулярна маса цього білка доріною між Val-356 sIL-6R і Pro-29 IL-6 (sILвнює 85 кілодальтонам, як це і передбачалось в результаті злиття глікозилованих форм sIL6R Val/L/IL-6). 6R5Val (60кДа за визначенням Oh et al., 1996) і Приклад 2: Експресія химери sIL-6R5Val/lL-6 глікозилованого IL-6 (23-26кДа за визначенням в клітинах людини Zilberstein et al., 1986). Амінокислотна послідовЗдійснюючи стандартні методи культивуванність sIL-6R/IL-6 складається з 543 амінокислот, ня клітин ссавців, трансфекції клітин і аналізу які після процесування сигнальних пептидів датрансфекованих клітин щодо експресії нововвеють змогу завбачити білок завдовжки 524 аміноденої послідовності ДНК, призначеної для екскислоти або з молекулярною масою близько пресії (для ознайомлення з цими методами див., 58кДа (Фіг.3). Значно більший розмір химери sILхнаприклад, Sambrook et al., 1989ї), вищезазна6R/IL-6, одержаний з рекомбінантної ДНК в клітичену плазмідну конструкцію (Приклад 1) викориснах людини, свідчить про те, що глікозилування товують для трансфекції клітин людини і оцінюохоплює значну частину молекули. ють міру її експресії. Коротко говорячи, Приклад 3: Пригнічення химерою sIL-6R/IL-6 використовують такі методики. росту і диференціації метастатичних меланомних Клітини НЕК 293 людини (АТСС CRL 1573, клітин трансформовані первинні клітини нирки ембріона Клон F10.9, виділений з меланомних клітин людини) трансфекують ДНК плазмідної конструкВ16, утворює надзвичайно метастатичні пухлини ції pCDNA3-sIL-6R/IL-6 (описаної у наведеному у мишей C57Black/6, які викликають загибель вище Прикладі 1). Культури НЕК 293, що перебутварин від легеневих метастазів протягом 2-3 вають в логарифмічній фазі росту, обробляють місяців [Katz et al., 1995]. Додання химерного білтрипсином і висівають в 9см чашки Нунка ка sIL-6R/IL-6 в культуру клітин F10.9 викликає (2,5 106 клітин/чашку). У наступний день здійсістотну морфологічну зміну в клітинах і пригнічує нюють трансфекцію 10мкг ДНК pCDNA3-sIL-6R/ILїх ріст (Фіг.4). Клітини F10.9, оброблені цієї химе6 у спосіб осадження СаРО4 [Sambrook et al., рою, витягуються, у них з'являються дендритні 1989], через 1 годину середовище замінюють вирости, що виступають, які нагадують веретеносередовищем DMEM, що містить 10% фетальну подібну диференцировку меланоцитів або гліателячу сироватку (FCS), і продовжують культивульних клітин ембріона. вання протягом ще 16 годин. Після заміни цього Ріст клітин визначають в кількісному відносередовища середовищем DMEM, що містить 2% шенні через 4 дні після посіву 3 x 103 клітин в FCS, секретовані білки збирають протягом двох лунки 96-лункового мікро-планшета в 0,2мл сеподальших періодів по 48 годин. Клітинний дебріс редовища RPMI 1640, що містить 10% FCS. Клівилучають центрифугуванням зі швидкістю 1000 тини витримують в 12,5% глутаровому альдегіді обертів/хвилину протягом 10 хвилин і супернапротягом 30 хвилин, промивають у воді та забартант аналізують за методом ELISA для sIL-6R, влюють 0,1% кристалічним фіолетовим протягом використовуючи поліклонільні антитіла кролика 30 хвилин. Після ретельного промивання і сушки проти sIL-6R і миші МсАВ 17.6 [Novick et al., барвник екстрагують 10% оцтовою кислотою і 1991]. Встановлено, що концентрація, яка доріввизначають оптичну щільність при 540нм. Ця хинює 1,2мкг/мл еквівалентів sIL-6R, є показником мера пригнічує ріст клітин залежно від дози до дуже ефективної експресії химерного білка sILповного пригнічення їх росту навіть при такій ни6R/IL-6 в трансфекованих клітинах людини. зькій концентрації, як 10нг/мл химерного білка Імуносорбційну очистку секретованого химе(р85) (Фіг.5). Обидва химерні білки sIL-6R5Val/ILрного білка (sIL-6R/IL-6) здійснюють моноклона6 і sIL-6R5Val/L/IL-6 (химера з більш довгим лінльним антитілом 34.4, специфічним відносно епікером між частинами sIL-6R і IL-6, див. Приклад топу в позаклітинному домені sIL-6R людини 1) мають однакову активність. Цей результат та[Novick et al., 1991; Halimi et al., 1995]. Клітини кож показує, що довжина лінкерного пептиду між гібридоми 34.4 вирощують в черевній порожнині частинами sIL-6R і IL-6 в цій химері не справляє мишей та імуноглобулінову (Ig) фракцію одержувпливу на активність химери, оскільки химера ють з асцитної рідини осадженням сульфатом sIL-6R Val/IL-6 має дуже короткий лінкер завдовамонію. Для іммобілізації МсАВ 34.4 використожки 3 амінокислоти, а химера sIL-6R5Val/L/IL-6 вують Affigel-10 [Bio-Rad Labs, Richmond, Califorмає більш довгий лінкер, який складається з 13 nia] (15мг Ig, зв'язаного з 1мл Affigel-10). Суперамінокислот, але обидві ці химери мають практинатанти, що містять білки, секретовані з клітин чно однакову активність пригнічення росту метаНЕК 293, трансфекованих pCDNA3-sIL-6R/IL-6, статичних клітин. На відміну від цього, ані IL-6, адсорбують на колонках МсАВ 34.4 (0,3мл колонка для 15мл супернатанта). Після промивання ані sIL-6R Val окремо не пригнічують ріст мелафізіологічним розчином з фосфатним буфером номних клітин (Фіг.6), що свідчить про унікальну (PBS) зв'язані білки елююють 25мм лимонної активність химерного білка sIL-6R/IL-6 (р85). Щоб кислоти, pH 2,5, відразу ж нейтралізують 1M розодержати аналогічний ефект, необхідно викорисчином буферу на основі HEPES, pH 8,5 і діалізутовувати суміш 200-400нг/мл IL-6 і 125нг/мл sILють протягом ночі (приблизно 8-12 годин) проти 6R Val (Фіг.6). При обчисленні в молярній концеPBS. нтрації для максимального пригнічення росту Аналіз підданого імуносорбційній очистці білклітин F10.9 необхідно 7,5nM IL-6 і 2nM sIL 27 75321 28 стовбурових клітинах 6R Val порівняно всього з 0,12nМ химери sILМононуклеарні кров'яні клітини з пуповини 6R/IL-6. людини фракціонують, відділяючи мононуклеарні Активність химерного білка sIL-6R/IL-6 р85 з клітини низької щільності (NMC) в апараті Ficollпригнічення росту клітин досліджують під час Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), та імуносорбційної очистки на колонках МсАВ 34.4 обробляють мінінабором MACS (Miltney Biotec, (див. Приклад 2). Характер активності відповідає Bergisch Gladbach, Germany) для одержання поінтенсивності смуги р85, що спостерігається в пуляції клітин CD34+ 80% чистоти. Ці клітини парізних фракціях, одержаних при виконанні електсують на іммобілізованому моноклональному рофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсуантитілі проти CD38 або сортують за методом льфатом натрію, результати якого наведені на сортування активованих флуоресценцією клітин, Фіг.2. в результаті чого одержують популяцію Приклад 4: Роль химери sIL-6R/IL-6 в CD34+CD38-, що відповідає приблизно 0,1% вихіприживлюваності трансплантованих клітин кістдних клітин. Ці очищені стовбурові клітини (20000 кового мозку клітин) приміщують в суспензійні культури в Приживлюваність кровотворних стовбурових 0,5мл середовища RPMI, що містить 10% фетаклітин з кісткового мозку людини можна дослільну телячу сироватку (FCS), 1% бичачий сироджувати після їх трансплантації мишам з важким ватковий альбумін з 50нг/мл фактора стовбурокомбінованим імунодефіцитом (SCID) [Vormoor et вих клітин (SCF) і 100нг/мл flt3-ліганду (FL) al., 1994]. Мишей SCID-NOD піддають опромінен(обидві речовини надані фірмою R&D Systems, ню сублетальними дозами та ін'єкують в хвостову Minneapolis, MN) . В половину культур додають вену 3 105 клітин CD34+ кісткового мозку людини. 100нг/мл химери sIL-6R/IL-6, решту культур виДо ін'єкування очищені клітини CD34+ витримурощують без цієї химери. Культури інкубують при ють протягом 3 днів в рідких культурах з різними 37 C в 5% СО2 протягом 6 днів. Кількість репопукомбінаціями цитокінів. Через один місяць мишей люючих клітин кісткового мозку визначають шляумертвляють і видаляють у них кістки для одерхом ін'єкування (внутрішньовенно) всіх клітин з жання клітин кісткового мозку. Приживлюваність культур in vitro мишам NOD-SCID, підданим клітин людини у мишей-реципієнтів SCID-NOD опроміненню сублетальними дозами. Мишей визначають за методом гібридизації саузернтримають в стерильних умовах. Через 6 тижнів блотингом з ДНК людини, що повторюється. мишей умертвляють і видаляють кістковий мозок Встановлено, що фактор стовбурових клітин з довгих кісток. Клітини кісткового мозку (ВМ) ку(SCF, steel-фактор або ckit-ліганд) і Flt3-лiгaнд льтивують на пластинах з напівтвердої 0,9% ме(ліганд рецептора тирозинкінази flt3/flk2) мають тилцелюлози, що містять 30% FCS, 50кМ важливе значення для виживання і проліферації більшості первинних поліпотентних кровотворних меркапто-етанолу, 50нг/мл SCF, 5нг/мл IL-3, стовбурових клітин, здатних протягом тривалоді5нг/мл GM-CSF, 6мк/мл еритропоетину (всі речоючому приживленню в кістковому мозку реципієвини надані фірмою R&D Systems). Культури міснта McKenna et al., 1995]. Як показано на Фіг.7, ці тять також сироватку людину, яка запобігає росту колоній мишей. Результати (Таблиця IV) показудва фактори самі по собі є недостатніми для стимуляції приживлюваності клітин людини в кісють, що додання химери sIL-6R/IL-6 до суспентковому мозку мишей-реципієнтів SCID-NOD. зійних культур викликає 30-50-кратне збільшення Щоб виявити приживлюваність клітин на значуколонієутворюючих клітин (CFU) людини у трансщих рівнях, необхідно додати химерний білок sILплантованих мишей порівняно з SCF і FL, які ви6R/IL-6. Химера sIL-6R/IL-6, що додається в кількористовуються окремо. Це вказує на велике збікості 100нг/мл, є значно більш активною, ніж вильшення кількості SCID-репопулюючих ділені окремо IL-6 (50-200нг/мл) і sIL-6R (125стовбурових клітин, присутніх в суспензійних ку1250нг/мл) (Фіг.7). Необхідність використання льтурах на 6-й день порівняно з 0-м днем. За химери sIL-6R/IL-6 вказує на те, що цей білок має відсутності химери sIL-6R/IL-6, SCF і FL не викливажливе значення для виживання і проліферації кають збільшення кількості стовбурових клітин некомітованих поліпотентних кровотворних стовпри знаходженні в суспензійній культурі протягом бурових клітин, які приживаються в кістковому 6 днів. ДНК клітин кісткового мозку, виділену у мозку і створюють в ньому нову популяцію клітин, трансплантованих мишей NOD/SCID, аналізують з чого випливає, що цей білок може бути корисза методом саузерн-блотинга, як це описано в ним у випадку клінічних операцій з трансплантації прикладі 4. Кількість виділеної ДНК людини в 10 кісткового мозку. раз більша у мишей, яким були введені клітини, Вперше продемонстровано, що химера sILкультивовані з химерою, порівняно з мишами, 6R/IL-6 має принаймні два нещодавно виявлені яким були введені клітини без химери. види активності: Колонієутворюючі клітини-попередники з кіст(I) При доданні разом з факторами SCF і Flt3кового мозку мишей NOD/SCID, як показано в Таблиці IV, збільшують кількість кровотворних лігандом в кровотворні первинні недиференційовані клітини людини ця химера стимулює їх виклітин різних мієлоїдних ліній (макрофаг і грануживання і проліферацію; та лоцит), а також еритроїдних і лімфоїдних ліній (II) Ця химера є активною (і очевидно основ(наприклад, CD19+, CD56+), тільки тоді, коли кроною) в моделі in vivo трансплантації кісткового в'яні клітини людини були культивовані з химемозку людини мишам з імунодефіцитом. рою sIL-6R/IL-6 до трансплантації. Приклад 5: Химера sIL-6R/IL-6 активна на максимально очищених первинних кровотворних Таблиця IV Стовбурові клітини людини, здатні репопулювати кістковий мозок мишей NOD/SCID Додання в суспензійну культуру клі+ тин CD34 CD38 людини з пуповинної крові SCF+FL SCF+FL+SIL-6R/IL-6 Кількості колоній кровотворних клітин людини, утворених з кісткового мозку, трансплантованого мишам NOD/SCID 4 2-3 50-100 Дні культивування 0 6 6 В додаткових експериментах проводять порівняння впливу sIL-6R/IL-6 на популяцію клітин CD34+CD38+ пуповинної крові і на добре очищені стовбурові клітини CD34+ CD38-. Розмноження in vitro під дією sIL-6R/IL-6 добре очищених клітин відбувається значно інтенсивніше, ніж менш очищених клітин (Таблиця V). Це свідчить про те, що більш прийнятною мішенню для розмноження sIL-6R/IL-6 є передусім первинні стовбурові клітини. Таблиця V Розмноження in vitro кровотворних стовбурових клітин Посіяна популяція клітин (20000 клітин) + + + + CD34 CD38 + CD34 CD38 CD34 CD38 + CD34 CD38 Кількість клітин на 6-ий день під дією SC+FL Експеримент 1 780000 42000 Експеримент 2 330000 3000 Збереження in vitro репопулюючої активності кісткового мозку вимірюють по збільшенню довжини суспензії культур добре очищених стовбурових клітин CD34+CD38- до ін'єкування мишам NOD/SCID. Приживлюваність клітин оцінюють на основі відносного вмісту ДНК людини в кістковому мозку мишей-реципієнтів через 6 тижнів після внутрішньовенного введення культивованих клітин. При доданні sIL-6R/IL-6 до SCF і FL в культури клітин висока приживлюваність (>1% ДНК людини) спостерігається навіть через два тижні культивування, причому приживлюваність є вищою, ніж в некультивованих клітинах. На відміну від цього, експерименти з культурами, що містять SCF, FL, GM-CSF, IL-3, показують, що SCIDрепопулюючі клітини не зберігаються через один тиждень культивування [Bhata, М. et al., J. Exp. Med. 186, 619-624, 1997]. Ці результати свідчать про те, що sIL-6R/IL-6 стимулює розмноження і збереження первинних стовбурових клітин людини, здатних приживатись в кістковому мозку реципієнта. Стовбурові клітини, розмножуючись, залишаються активними в недиференційованому стані. Химера sIL-6R/IL-6 є новим засобом культивування кровотворних клітин, що приживаються. Досить ймовірно, що ця химера дозволить використовувати ретровірусні вектори для введення генів у стовбурові клітини, що приживаються, згідно з схемою генотерапії. До цього часу така обробка стовбурових клітин людини була неможливою, оскільки ці первинні клітини не зберігалися in vitro у фазі клітинного циклу, як це необхідно для інтеграції ретровірусної ДНК. Химера sIL-6R/IL-6 дозволяє вирішити Кількість клітин на 6-ий день під дією SC+FL+SIL-6R/IL-6 675000 ( 0,86) 153000 ( 3,6) 507000 ( 1,5) 18000 ( 6,0) цю проблему. Приклад 6: Одержання химери IL-6R/IL-6 в клітинах СНО ДНК плазміди pcDNA3 іIL-6R/IL-6, показану на Фіг.1, котрансфекують в клітини яєчника китайського хом'яка (СНО) разом з ДНК плазміди pDHFR за методом [Могу et al., ДНК 5, 181-193, 1986]. Разом з іншими трансфектантами, що вирощуються в 50нМ метотрексату, виділяють клон L12-[IL-6R/IL-6]. Встановлено, що цей клон залишається стійким протягом кількох пасувань, тому напівконфлюєнтні культури звичайно секретують в культуральне середовище 2,5мкг/мл химери IL6R/IL-6. Для очистки химери IL-6R/IL-6 3,25 літри середовища з культур клону L12 в 2% бичачої сироватки концентрують до 200мл. Одержану речовину адсорбують на 18мл колонці з моноклональним антитілом 34.4 проти sIL-6R людини, зв'язаного з гранулами Affigel 10, та елюють у відомий спосіб [Novick et al., Hybridoma, 10, 137-146, 1991]. Елюат, що містить 25мм лимонної кислоти, відразу ж нейтралізують буфером на основі HEPES 1, pH 8,6. Білки концентрують на мембрані Amicon для вирізання фрагменту з молекулярною масою 10кДа до кінцевої концентрації 1мг/мл. В результаті виконання електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію виявлено одну смуту з молекулярною масою 85кДа, що відповідає химері IL-6R/IL-6. Глікозилування підтверджене зменшенням розміру після обробки глікозидазою (Boehringer, Mannheim). Встановлено, що біологічна активність СНО-продукованої химери IL 31 75321 32 6R/IL-6 залишається стабільною протягом придля захисту тканин печінки у пацієнтів, які страждають на некроз внаслідок впливу хімічних речонаймні 5 місяців при 4 С. Як правило, химеру вин (наприклад, алкоголю, парацетамолу) або з зберігають при -70 С. інших причин (наприклад, вірусний гепатит). Приклад 7: Спорідненість химери IL-6R/IL-6 Приклад 9: Конструювання і активність химедо gp130 ри IL-6/sIL-6R Val СНО-продуковану химеру IL-6R/IL-6 і суміш Сконструювали химерну молекулу, в якій чаIL-6 і sIL-6R людини порівнюють щодо зв'язуванстина IL-6 розташована в N-кінцевій області і часня з розчинною формою gp130 (sgp 130), яка є тина sIL-6R знаходиться в С-кінцевій області. другим ланцюгом системи рецепторів для IL-6. 96-лунковий титраційний мікропланшет (Nunc) Плазміду pBS-sIL-6R Val вирізають в сайті Sau3a (1086п.о.) і в сайті HindIII слідом за термінуючим покривають моноклональним антитілом проти gp130 людини і додають 50нг/мл sgpl30 (обидві кодоном після Val-356 (див. приклад 1). Лінкер, речовини надані фірмою R&D Systems, Minneapoщо містить три сайти рестрикції: Spei, Smai і lis). Химеру IL-6R/IL-6 промивають в фізіологічBamHl, синтезовано так: ному розчині з фосфатним буфером і вводять в Spei Smai BamHl різні лунки в різних концентраціях від 0,1 до 5' СТ AGT GGG CCC GGG GTG GCG GG 50нг/мл. В окремі лунки додають rhuIL-6 (AresA CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG 5' Serono, Geneva) в кількості 500нг/мл разом з sIL(SEQ ID №2) Сайт Sau3a sIL-6R лігують з BamHl лінкера і 6R Val людини в концентраціях від 2 до 500нг/мл. клонують в сайті множинного клонування плазміКультури інкубують протягом ночі при 4 C і доди Bluescript pBS SK. Послідовність IL-6 ампліфідають поліклональне антитіло кролика проти ILкують полімеразною реакцією синтезу ланцюга з 6R [Oh et al., Cytokine, 8, 401-409, 1996], а потім ДНК pKK 2-7, використовуючи затравки (ініціююIg кози проти кролика, кон'югований з пероксидачий кодон підкреслено): зою хріну, яку виявляють кольоровою реакцією Spei (Sigma, St. Louis). На Фіг.8 показаний графік СкеВерхня 5' GA СТА GTA GCT ATG ААС ТСС тчарда одержаних результатів. Встановлено, що ТТС ТС (SEQ ID №3) спорідненість химери IL-6R/IL-6 до gp130 в 4 рази НаеIII вища, ніж у двох частин молекули, що додаються Нижня 5' AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC С окремо (6,3 10-11М порівняно з 2,6 10-10 М). Цей (SEQ ID №4) результат відповідає очікуваному і пояснює більш Продукт полімеразної реакції синтезу ланцювисоку активність химери відносно до меланомга, вирізаний Spei та НаеIII, вводять між сайтом них і кровотворних клітин порівняно з комбінацією Spei та Smai вищезазначеного лінкера. Інший IL-6+sIL-6R (Фіг.9 та Приклад 4). лінкер BamHl-Ncoi з внутрішнім сайтом Smai синПриклад 8: Химера IL-6/IL-6 захищає від гетезують так: патотоксичності Smai Ін'єкування мишам тетрахлорметану (ССl4) 3' GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG викликає широкий некроз печінки, що призводить CCC GGG C[NcoI] до загибелі тварин [Slater Т.F. et al., Philos, Trans. [BamHI] GC CCG CCG CCC CCT CCT CCC R. Soc. Biol. Sei., 311, 633-645, 1985]. Коли миGGG CCC GGT AC 5' шам з генетичним дефіцитом IL-6 (JL-6-/-) вводять (SEQIDN0:3) відносно низькі дози ССІ4 (2-3мл/кг маси тіла) у Цю послідовність клонують між BamHI попевигляді внутрішньочеревної ін'єкції, смертність реднього лінкера і Ncol 1464 послідовності IL-6R. через 24 години становить приблизно 70% Фрагмент IL-6R від Smai 867 до Ncoi 1464 вво(Фіг.10). Ін'єкування СНО-продукованої химери ILдять між Smai другого лінкера та Ncoi IL-6R. Оде6R/IL-6 за одну годину до введення ССІ4 і через 4 ржану химерну ДНК секвенують і знову клонують години після введення ССІ4 захищає тварин, і в pCDNA3 для експресії в клітинах НЕК 293 лючерез 24 години не спостерігається жодного видини. Амінокислотна послідовність цієї химери 3е падку загибелі тварин. На відміну від цього, ін'єIL-6-IL-6R показана на Фіг.11 (лінкер підкреслекування вільного rhuIL-6 не справляє ніякої дії но). Химеру 3е очищають афінною хроматогра(Фіг.10). Химера IL-6R/IL-6 є ефективною в дозах, фією на моноклональному антитілі проти IL-6 (за що складають 2-3мкг/ін'єкцію, що в молярному методом Novick et al., Hybridoma 8, 561-567, відношенні в 10 разів менше, ніж неефективна 1989). Електрофорез в поліакриламідному гелі з доза IL-6. При більш високих дозах ССІ4 (напридодецилсульфатом натрію дозволяє виявити клад, 3,5мл/кг на Фіг.10) ця химера також справсмугу, що відповідає молекулярній масі 75кДа. ляє захисну дію, причому смертність в цьому виБіологічна активність химери 3е IL-6-IL-6R, падку нижча, ніж при введенні IL-6 або без спрямована на пригнічення росту меланомних введення цитокіну. Відмінність між показниками клітин F10.9, показана на Фіг.12. Ця химера має смертності у мишей, яким була введена ця химевиражену активність при порівнянні з химерою ILра і яким вона не була введена, при однаковому 6R/IL-6 (препарат 1-3), яке виконують при здійсвпливі ССІ4, є значущою при р