Спосіб поліпшеного приживлення гемопоетичних стовбурових клітин

Реферат: Винахід стосується способу поліпшеного приживлення гемопоетичних стовбурових клітин шляхом попередньої обробки ex vivo, що включає стадію змішування зразка, що містить UA 113284 C2 (12) UA 113284 C2 гемопоетичні стовбурові клітини, щонайменше з одним аналогом простацикліну разом з неспецифічним цАМФ-активуючим агентом, переважно вибраним з холерного токсину й форсколіну для одержання суміші, стадію інкубування зазначеної суміші протягом періоду часу, достатнього для стимулювання Gальфаs-шляху передачі сигналу в зазначених клітинах, і необов'язково стадію виділення зазначених стимульованих клітин. Винахід також стосується композиції для ех vivo посиленого приживлення гемопоетичних стовбурових клітин. UA 113284 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід пропонує новий спосіб поліпшеного приживлення гемопоетичних стовбурових клітин шляхом попередньої обробки ex vivo, що включає стадії одержання зразка, який містить гемопоетичні стовбурові клітини, додавання аналога простацикліну для одержання суміші, стадію інкубації зазначеної суміші протягом періоду часу, достатнього для стимуляції G альфа sшляху передачі сигналу в зазначених клітинах, і необов'язково виділення зазначених стимульованих клітин. Додатково, надається композиція, що містить трепростиніл, для використання при лікуванні індивідуумів, що зазнають трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин. Гемопоетичні стовбурові клітини (HSC) є первинними клітинами, здатними до регенерації всіх компонентів крові протягом життя індивідуума, урівноважуючими своє самовідновлення з диференціюванням клітин-нащадків. Місце розташування HSC переміщається в ході розвитку, і вони циркулюють протягом всього життя ссавців, входячи й виходячи із кровотоку, щоб зайняти нішу кісткового мозку в ході послідовних стадій хоумінгу, приживлення й утримання. Хоумінг є процесом, шляхом якого донорні стовбурові клітини потрапляють у кістковий мозок, а приживлення стовбурових клітин має на увазі їхній ріст у кістковому мозку. Гемопоетичні стовбурові клітини мають лікувальні можливості завдяки своїй здатності відновлювати клітини крові й імунної системи у реципієнтів трансплантата. Крім того, HSC мають здатність утворювати клітини інших тканин, таких як мозок, м'язи й печінка. Методи аутологічної і алогенної трансплантації кісткового мозку людини в цей час використовуються в якості терапії таких захворювань, як лейкемія, лімфома, та інших небезпечних для життя захворювань. Для таких операцій повинна бути виділена велика кількість донорного кісткового мозку, щоб забезпечити достатню кількість HSC для приживлення. Для заселення ніші кісткового мозку in vivo гемопоетичними стовбуровими клітинами необхідний Gαs-перетворений сигнал (1). Ці недавні дані підтверджують більш ранні in vitro експерименти, що показали, що активація Gs сприяє виживанню й диференціюванню гемопоетичних стовбурових клітин (2,3). Gs являє собою єднальну гуаніновий нуклеотид субодиницю гетеротримірного G-білка, який стимулює всі 9 ізоформ мембранозв’язаної аденілатциклази ссавців. Gs може бути конститутивно активована ex vivo/in vitro за допомогою обробки клітин холерним токсином, оскільки холерний токсин АДФ-рибозилює каталітичний 186/187/201/202 залишок аргініну (R , точний номер аргініну залежить від сплайс-варіанта Gs); інтактний залишок аргініну необхідний для гідролізу GTP і приводить до дезактивації Gs (4). Поліпшене приживлення дійсно може спостерігатися після попередньої обробки гемопоетичних стовбурових клітин холерним токсином: у кістковому мозку налічувалося приблизно у два рази більше (Lin ) клітин-попередників, якщо препарат стовбурових клітин був попередньо оброблений холерним токсином (1). Однак для препаратів стовбурових клітин для пацієнтів, що зазнають трансплантації кісткового мозку, холерний токсин був би вкрай несприятливим. Холерний токсин (CT), особливо його нетоксичний фрагмент пентамірної B субодиниці (CTB), є мукозним ад'ювантом, що мають сильні імуномодулюючі властивості як in vivo, так і in vitro, і являє собою один з найбільш сильних мукозних імуногенів. Холерний токсин і CTB викликають сильне утворення IgA антитіл у кишечнику й тривалу імунологічну пам'ять. На цій підставі CTB став важливим компонентом недавно розроблених пероральних вакцин проти холери й діареї, викликаної ентеротоксигенними E. coli. Сильну імуногенність CT і CTB у значній мірі можна пояснити їхньою здатністю зв'язуватися з рецепторами на поверхні слизової оболонки кишечнику. Додатково, протягом природногоходу інфекції пентамірна частина B молекули токсину зв'язується з поверхнею епітеліальних клітин кишечнику й швидко ендоцитується разом з A субодиницею. Будучи ендоцитованою, каталітично активна A-субодиниця відділяється від пентамірної частини B і проникає в клітину крізь пору, утворену B-субодиницею. Усередині клітини вона постійно рибозилює Gs альфа-субодиницю гетеротримірного G-білку, приводячи + + до конститутивної продукції цАМФ. Це, у свою чергу, приводить до секреції H2O, Na , K , Cl і HCO3 у просвіт тонкого кишечнику, що обумовлює швидку дегідратацію й інші особливості, обумовлені холерою. При внутрішньовенному уведенні холерний токсин поглинається більшістю клітин (тільки деякі клітини захищені специфічними бар'єрами, таким як гематоенцефалічний бар'єр). Відповідно, при цьому буде спостерігатися збільшення цАМФ у більшості клітин тіла й безліч побічних ефектів (від тахікардії до вазодилатації, м'язового тремору, гіперглікемії і т.д.). Таким чином, ці ефекти роблять холерний токсин недоцільним для медичного застосування відносно стимуляції гемопоетичних стовбурових клітин. Однак, терапевтична значимість стимулювання стовбурових клітин є істотною при виконанні гетерологічної трансплантації кісткового мозку (тобто гемопоетичних стовбурових клітин, узятих 1 UA 113284 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в імуносумісних донорів) і є стандартною процедурою, використовуваної для лікування людей, що страждають від лейкемії, для лікування людей з генетичними дефектами в компартменті клітин крові (наприклад, гемоглобінопатією, такою як таласемія; порушеннями функції нейтрофільних гранулоцитів і т.д.). Це також важливо у зв'язку з тим, що аутологічна трансплантація кісткового мозку є стандартною процедурою, яка використовується для того, щоб збільшити терапевтичне вікно цитотоксичних лікарських засобів, і тим самим уможливити високодозову інтенсивну хіміотерапію (5,6). Гемопоетичні стовбурові клітини експресують усі чотири рецептори простагландину E (EP14). Попередня обробка гемопоетичних стовбурових клітин (диметильованим) простагландіном E2 збільшує їхнє приживлення (7,8). Цей вплив опосередковує канонічним Gs-залежним шляхом передачі сигналу, оскільки цАМФ-індукована aктивація протеїнкінази A (PKA) синергічна з Wnt-залежними сигналами стабілізації -катеніну (9). Імплантація мононуклеарних клітин (MNCs) аутологічного кісткового мозку (BM) може бути поліпшена за допомогою берапросту натрію на моделі кролика згідно Otsuka et al. Метою цього дослідження була підтримка розвитку артерій при периферичній ішемії й ішемії міокарду. Гемопоетичні стовбурові клітини, однак, являють собою специфічний тип клітин кісткового мозку (16). Комбінація терапії стовбуровими клітинами й фармакологічного лікування описане Madonna et al., коли простациклін випробовували в ADSC міокардіальному приживленні після внутрішньокоронарного введення (17). Ishii M. et al. розкривають, що вповільнене вивільнення простацикліну збільшує проангіогенну функцію мезенхімальних стовбурових клітин і ріст м'язових клітин в ішемічній тканині (18). WO2006/017169 описує імплантуємий сенсор з біологічно сумісним покриттям для контролювання росту тканини, яке може містити, серед іншого, аналоги простацикліну. Інгібуюча дія цикапросту або ілопросту на синтез тканинного фактора, фактора некрозу пухлини й інтерлейкіну-1 у клітинах THP1 людини описане в Crutchley D. et al. (19). Локалізація стовбурових клітин після трансплантації є критичним показником успішності трансплантації. У цей час для трансплантації необхідно велика кількість стовбурових клітин, оскільки стовбурові клітини не завжди успішно приживаються в кістковому мозку, і є довгий період аплазії кісткового мозку, що приводить до зниження зрілих клітин крові. Таким чином, дотепер затребуваним є надання способів і композицій для стимуляції HSC з метою збільшення хоумінгу, приживлення й утримання виділених HSC у кістковомозкових нішах суб'єктів, що зазнають трансплантації кісткового мозку. Дана проблема вирішується за допомогою варіантів здійснення дан-ого винаходу. Короткий опис винаходу Зненацька було показано, що синтетичні аналоги простацикліну I2 (PGI 2), наприклад, трепростиніл, ілопрост, берапрост і цикапрост, здатні збільшувати рівень цАМФ у гемопоетичних стовбурових клітинах, що збільшує приживлення стовбурових клітин у кістковому мозку. Аналог простацикліну, такий як трепростиніл, забезпечує кілька переваг у порівнянні із простагландіном E2: (i) це стабільний аналог простацикліну/PGI2, який також стимулює EP2- і EP 4-рецептори (10). Таким чином, він має можливість стимулювати безліч G s-сполучених рецепторів без залучення інгібуючих (т.б., Gi-сполучених) EP3-рецепторів, які інгібують нагромадження цАМФ. Для останнього повним агоністом є диметил-PGE2 (1). Напроти, трепростиніл є лише низькоафінним агоністом EP3-рецепторів. (ii) так як вони є метаболічно більш стабільними, ніж природні простацикліни, трепростиніл, ілопрост, берапрост і цикапрост можуть викликати більш тривалі ефекти при застосуванні in vivo і, таким чином, підтримувати більш ефективне приживлення у кістковому мозку. (iii) тривале/повторне введення аналога простацикліну, зокрема, трепростинілу, ілопросту, берапросту й цикапросту, добре переноситься. Даний винахід надає новий спосіб поліпшеного приживлення гемопоетичних стовбурових клітин шляхом попередньої обробки ex vivo стадії, що включає: а) одержання зразка, що містить гемопоетичні стовбурові клітини, і b) додавання, щонайменше, одного аналога простацикліну для одержання суміші, c) інкубації зазначеної суміші протягом періоду часу, достатнього для стимуляції G альфа sшляху передачі сигналу в зазначених клітинах, і необов'язково d) виділення й необов'язково очищення зазначених стимульованих клітин. 2 UA 113284 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно до одного варіанту здійснення винаходу аналог простацикліну вибирають із групи трепростинілу, ілопросту, цикапросту й берапросту або їх фармацевтично прийнятних солей. Відповідно до винахідницького способу також може надаватися суміш стимульованих і нестимульованих стовбурових клітин. Зокрема, зразок є кістковим мозком. Стовбурові клітини можуть походити з будь-якого відомого джерела, зокрема, вони можуть бути HSC, виділеними з периферичної крові, пуповинної крові або кісткового мозку. Відповідно до винаходу трепростиніл може бути похідним, обраним із групи кислотних похідних, проліків, поліморфів або ізомерів. Аналогічно, ілопрост, цикапрост або берапрост можуть бути похідними із групи кислотних похідних, проліків, їхніх поліморфів або ізомерів. Відповідно до альтернативного варіанта здійснення винаходу зразок може бути змішаний, щонайменше, з одним аналогом простацикліну разом з неспецифічним цАМФ-активуючим агентом, переважно обраним з холерного токсину й форсколіну. Відповідно до окремого варіанта здійснення винаходу композиція, що містить аналог простацикліну, надається для використання при лікуванні індивідуумів, що страждають від захворювань кісткового мозку, які можуть зазнати трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин. Відповідно до окремого варіанта здійснення винаходу аналог простацикліну вибирають із групи трепростинілу, ілопросту, цикапросту або берапросту або їх фармацевтично прийнятних солей. Відповідно до кращого варіанта здійснення композиція містить трепростиніл. Зокрема, індивідууми є індивідуумами, що страждають від лейкозу, дефекту компартменту клітин крові, трансплантації кісткового мозку після хіміотерапії або опромінення. Відповідно до додаткового варіанта здійснення винаходу дефект компартменту клітин крові є гемоглобінопатією або порушенням функції нейтрофільних гранулоцитів. Композиція винаходу також може використовуватися для лікування індивідуумів, що страждають від захворювань кісткового мозку, які зазнають трансплантації гемопоетичних клітин, шляхом уведення аналога простацикліну протягом, щонайменше, семи днів після трансплантації кісткового мозку. Зокрема, використовується аналог простацикліну, обраний із групи трепростинілу, ілопросту, цикапросту й берапросту, більш конкретно, трепростиніл. Відповідно до додаткового варіанта здійснення надається композиція, що містить аналог простацикліну й стимульовані гемопоетичні стовбурові клітини. Відповідно до додаткового варіанта здійснення надається композиція, що містить трепростиніл або його фармацевтично прийнятну сіль і стимульовані гемопоетичні стовбурові клітини. Зокрема, для застосування на тваринах або в дослідженнях на тваринах композиції винаходу можуть додатково містити форсколін або холерний токсин. Винахідницькі композиції можуть бути фармацевтичними композиціями. Винахідницька композиція може вводитися будь-яким способом, відомим у даній області техніки, зокрема, вона може бути приготовлена для внутрішньовенного або підшкірного введення. Аналог простацикліну може надаватися в перорально доступній формі, обраній із групи форм із тривалим вивільненням, таблеток або капсул. Кількість аналогів простацикліну залежить від терапевтичного застосування або способу приготування стимульованих HSC. Як правило, для терапевтичного застосування ефективна кількість трепростинілу становить, щонайменше, 1,0 нг/кг ваги тіла. Фігури + Фігура 1. Дослідження Lin клітинної популяції, утриманої магнітними частками. Вісь x (позначена APC-C7-A) показує флуоресценцію, зареєстровану за допомогою суміші антитіл до маркерів напрямку диференціювання: CD3ε для T-клітин, CD45R(=B220) для B-клітин, CD11b і Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) для мієлоїдного (моноцитарного/гранулоцитарного) напрямку диференціювання, Ter-119 для еритроїдного напрямку диференціювання. Вісь y являє собою флуоресценцію, зареєстровану відносно антитіл до рецептора мишачого фактора стовбурових клітин c-Kit. Очевидно, що лівий верхній квадрант (який показує клітини, негативні за c-Kit+ і маркером напрямку диференціювання) збіднений клітинами. Фігура 2. Дослідження Lin клітинної популяції, яка не зв'язалася з магнітними частками. Як на Фіг. 1, вісь x (позначена APC-C7-A) указує флуоресценцію, зареєстровану за допомогою суміші антитіл до маркерів напрямку диференціювання: CD3ε для T-клітин, CD45R(=B220) для веток, CD11b і Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) для мієлоїдного (моноцитарного/гранулоцитарного) напрямку 3 UA 113284 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 диференціювання, Ter-119 для еритроїдного напрямку диференціювання. Вісь y являє собою флуоресценцію, зареєстровану відносно антитіл до рецептора мишачого фактора стовбурових клітин c-Kit. Очевидно, що нижній квадрант (який показує клітини, негативні за c-Kit і позитивні за маркерами напрямку диференціювання) збіднений клітинами, і що клітини переважно виявляються у верхньому лівому квадранті, де мали очікувати позитивні за c-Kit і негативні за маркерами напрямку диференціювання клітини. + Фігура 3 показує дослідження Lin (Фіг. 3A) і Lin клітинних популяцій (Фіг. 3B) на наявність Sca-1 і c-Kit. Панелі 3A і 3B демонструють клітини, утримані на магнітних частках (охарактеризовані на Фіг. 1), що й перебувають в елюаті (охарактеризовані на Фіг. 2). Вони були пофарбовані, як зазначено в розділі Методи, і проаналізовані на наявність одночасно c-Kit (PerCP-Cy5-5-A, вісь y) і Sca-1 (PE-Cy7-A, вісь x). Очевидно, що позитивні за маркерами напрямку диференціювання клітини, проаналізовані на панелі А, виявляються в лівому нижньому квадранті, т.б. вони позбавлені як c-Kit, так і Sca-1. Напроти, клітини на Панелі B переважно перебувають у верхніх квадрантах, т.б. вони мають високі рівні або c-Kit (верхній лівий квадрант) або й c-Kit і Sca-1 (верхній правий квадрант), як і передбачалося для популяції гемопоетичних стовбурових клітин і некомітованих попередників. + + Фігура 4. Нагромадження циклічного АМФ в (Lin , c-Kit , Sca-1 ) гемопоетичних стовбурових клітинах після стимуляції форсколіном, трепростинілом, ілопростом, берапростом або 5 комбінацією форсколіну й простаноїдів. Lin клітини (7*10 /аналіз) інкубували у присутності 3 [ H]аденіну для того, щоб попередньо метаболічно позначити пул аденінових нуклеотидів відповідно до Meтодів. Клітини інкубували під час відсутності (лівий стовпчик, позначений 0) і в 3 присутності зазначених сполук. Накопичений [ H]цАМФ очищали шляхом послідовної хроматографії на колонках з Dowex AG50-X8 і оксидом алюмінію й визначали кількість методом рідинно-сцинтиляційних вимірів. Дані є середнім ± S.D. (середньоквадратичне відхилення) (n=4). Фігура 5. Крива концентрація-відповідь для індукованого трепростинілом нагромадження + + цАМФ в (Lin , c-Kit , Sca-1 ) гемопоетичних стовбурових клітинах. Умови аналізу відповідали позначенням на Фіг. 4. Дані є середнім ± S.D. (n=2). Фігура 6. Ex vivo обробка гемопоетичних стовбурових клітин трепростинілом приводить до поліпшеного приживлення кісткового мозку в летально опромінених мишей. Гемопоетичні стовбурові клітини, приготовлені як на Фіг. 3, попередньо обробляли зазначеними сполуками (FSK, форсколін) відповідно до Meтодів. Кількість лейкоцитів була визначена за допомогою FACS. Зазначене число досліджених тварин. Фігура 7. Відношення Ly5.2 і Ly5.1 позитивних клітин крові через 16 тижнів після трансплантації кісткового мозку. Ly5.1 клітини були попередньо оброблені CTX або трепростинілом і форсколіном. Фігура 8. Відношення Ly5.2 і Ly5.1 позитивних клітин крові через 16 тижнів після трансплантації кісткового мозку. Ly5.2 клітини були попередньо оброблені CTX або трепростинілом і форсколіном. Докладний опис винаходу Надані методи й способи збільшення хоумінгу й приживлення HSC у мікрооточенні кісткового мозку мають цілком визначене біологічне й медичне значення. Локалізація стовбурових клітин після трансплантації вкрай важлива для клінічних процедур, тому що на сьогоднішній день для клінічної трансплантації потрібні величезні кількості стовбурових клітин, що приводить, таким чином, до необхідності більших кількостей донорських клітин. Такі способи також досить корисні, оскільки значне число аутологічних донорських трансплантатів містить недостатню кількість стовбурових клітин, або HSC. Також пацієнти часто не можуть знайти гістосумісних донорів, що підкреслює необхідність способів і композицій для зниження числа HSC, необхідних для успішної трансплантації. Можливість поліпшити хоумінг і приживлення HSC in vitro або ex vivo дає можливість відбору меншої кількості клітин у донорів, тим самим зменшуючи час і дискомфорт, пов'язані зі збором кістковомозкових/периферичних стовбурових клітин, і збільшуючи число добровільних донорів HSC. Даний винахід, таким чином, надає новий спосіб поліпшеного приживлення HSC шляхом попередньої обробки HSC ex vivo, що включає стадії: a) одержання зразка, що містить гемопоетичні стовбурові клітини; b) додавання, щонайменше, одного аналога простацикліну для одержання суміші; c) інкубації зазначеної суміші протягом періоду часу, достатнього для стимуляції G альфаs-шляху передачі сигналу в зазначених клітинах; d) необов'язково, виділення зазначених стимульованих клітин або використання зазначеної суміші, що містить зазначені стимульовані клітини, для подальшого використання, наприклад, для лікування або трансплантації. 4 UA 113284 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зокрема, аналог простацикліну вибирають із групи трепростинілу, ілопросту, берапросту й цикапросту або їх фармацевтично прийнятних солей. Трепростиніл є синтетичним аналогом простацикліну. Трепростиніл комерційно доступний як Ремодулін™. Трепростиніл є мононатрієвою сіллю (1R,2R,3aS,9aS)-[[2,3,3a,4,9,9а-гексагідро2-гідрокси-1-[(3S)-3-гідроксиоктил]-1H-бенз[f]інден-5-іл]окси]оцтової кислоти. Ілопрост комерційно доступний як "Іломедин" і є 5-{(E)-(1S,5S,6R,7R)-7-гідрокси-6[(E)(3S,4RS)-3-гідрокси-4-метил-1-октен-6-ініл]-бі-цикло[3.3.0]oктан-3-іліден}-валеріановою кислотою. Берапрост є 2,3,3a,8b-тетрагідро-2-гідрокси-1-(3-гідрокси-4-метил-1-октен-6-ініл)-1Hциклопента(b)бензофуран-5-бутановою кислотою. Цикапрост є 2-[(2E)-2-[(3aS,4S,5R,6aS)-5-гідрокси-4-[(3S,4S)-3-гідрокси-4-метилнону-1,6диініл]-3,3a,4,5,6,6a-гексагідро-1H-пентален-2-іліден]етокси]-оцтовою кислотою. Відповідно до винахідницького варіанта здійснення, щонайменше, два, зокрема, щонайменше, три різні аналоги простацикліну можуть використовуватися для зазначеного способу. Aльтернативно, два, три, чотири, п'ять або шість, або навіть більше різних аналогів простацикліну можуть використовуватися для зазначеного способу. Даний спосіб переважно надає стимульовані клітини, які можуть безпосередньо вводитися індивідуумам і які не проявляють яких-небудь небажаних побічних ефектів завдяки більшим кількостям неселективних цАМФ-стимулюючих агентів. Відповідно до додаткового варіанта здійснення винаходу надається спосіб поліпшеного приживлення гемопоетичних стовбурових клітин за допомогою попередньої обробки ex vivo, що включає наступні стадії: a. одержання зразка, що містить гемопоетичні стовбурові клітини й b. додавання aналога простацикліну й форсколіну для одержання суміші c. інкубації зазначеної суміші протягом періоду часу, достатнього для стимуляції G альфа sшляху передачі сигналу в зазначених клітинах і необов'язково d. виділення зазначених стимульованих клітин і необов'язково e. виділення й/або концентрування зазначених стимульованих клітин. Відповідно до окремого варіанта здійснення винаходу співвідношення аналога простацикліну й форсколіну може приблизно становити 1:3. HSC, оброблені форсколіном і аналогами простацикліну, можуть бути очищені перед реімплантацією, однак, ці HSC також можуть бути реімплантовані без додаткових стадій очищення, тому що невеликі кількості форсколіну можуть бути присутніми, але не викликати які-небудь негативні побічні ефекти. Альтернативно, до стовбурових клітин може додаватися комбінація трепростинілу з одним із числа ілопросту, берапросту або цикапросту. Альтернативно, трепростиніл може додаватися у комбінації з більш ніж одним або, наприклад, із двома, трьома, чотирма або п'ятьма іншими аналогами простацикліну, наприклад, без обмеження, ілопростом, берапростом або цикапростом або їх фізіологічно прийнятними солями. Відповідно до окремого варіанта здійснення для використання при дослідженнях на тваринах або лікуванні тварин, агент, що підсилює цАМФ (енхансер), такий як форсколін і/або холерний токсин, може бути додатково доданий до HSC, або суміші HSC/трепростиніл, ілопрост, цикапрост або берапрост до інкубації. Період часу, необхідний для стимулювання G aльфа s-шляху передачі сигналу в зазначених клітинах, може бути обмірюваний за допомогою відомих методів, наприклад шляхом вимірів цАМФ, яких існує безліч варіацій: RIA, метод резонансного переносу енергії флуоресценції (FRET) з EPAC (epac1) (Ponsiouen B. et al., EMBO reports, 5, 12, 1176-1180 (2004)), радіохімічні методи і т.д. Стимульовані клітини, у яких має місце G aльфаs-шлях передачі сигналу, можуть бути відібрані або відділені від нестимульованих клітин способами, відомими в даній області техніки, такими як цАМФ-репортер на основі FRET. Відповідно до варіанта здійснення винаходу час інкубації становить приблизно від 1 до 60 хв., переважно приблизно від 2 до 30 хв. цАМФ-залежний шлях є шляхом, необхідним для надання сприяння приживленню гемопоетичних стовбурових клітин. Винахідниками було показано, що аналог простацикліну здатний викликати підвищення цАМФ у гемопоетичних стовбурових клітинах. Це досягається за рахунок активації безлічі рецепторів, т.б. IP- і EP-рецепторів, що призводить до підвищення G альфаs-передачі сигналу. Відповідно, аналоги простацикліну, подібні трепростинілу, ілопросту, цикапросту або берапросту більш ефективно збільшують рівень цАМФ. Відповідно до конкретного варіанта здійснення трепростиніл є кращим аналогом простацикліну, використовуваним відповідно до способу даного винаходу. Альтернативно, у певних способах і композиціях винаходу також може бути доданий, 5 UA 113284 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше, один агент, обраний з енхансера циклічного АМФ (цАМФ) або ліганду рецептора простагланліну EP. Приклади енхансерів цАМФ включають, але не обмежуються цим, дибутирил цАМФ (DBцАМФ), форболовий ефір, форсколін, скларелін, 8-бром-цАМФ, холерний токсин (CT), амінофілін, 2,4 динітрофенол (DNP), норепінефрин, епінефрин, ізопротеренол, ізобутилметилксантин (IBMX), кофеїн, теофілін (диметилксантин), дофамін, роліпрам, простагландин E1, простагландин E2, гіпофізарний активуючий аденілатциклазу поліпептид (PACAP) і вазоактивний поліпептид кишечнику (VIP), поряд з іншими, відомими в даній області техніки, можуть бути додані до стовбурових клітин, або сумішей стовбурові клітини/трепростиніл або стовбурові клітини/трепростиніл, ілопрост, цикапрост і/або берапрост перед інкубацією. Приклади енхансерів цАМФ також включають цАМФ і аналоги цАМФ, такі як sp-5,6-DCl-BIMPS (BIMPS), у числі інших. Відповідно до окремого варіанта здійснення винаходу форсколін і/або холерний токсин або A субодиниця холерного токсину додатково додаються до стовбурових клітин або до суміші стовбурові клітини/трепростиніл перед інкубацією. В окремому варіанті здійснення зазначені енхансери цАМФ використовуються для проведення обробки стовбурових клітин тварин або для проведення досліджень на тваринах з урахуванням приживлення стовбурових клітин. Щодо аналогів простацикліну, відповідно до даного винаходу термін "аналоги простацикліну" включає також похідні й аналоги зазначених речовин. Терміни "aналог" або "похідне" відносяться до хімічної молекули, яка подібна з іншою хімічною речовиною за структурою й функцією окремим елементом, що часто структурно відрізняється, або групою, яка може відрізнятися внаслідок модифікації більш, ніж однієї групи (наприклад, 2, 3 або 4 груп), якщо вона зберігає ту ж саму функцію як вихідна хімічна речовина. Такі модифікації є звичайними для фахівців і включають, наприклад, додаткові або заміщені хімічні фрагменти, такі як складні ефіри або аміди кислоти, захисні групи, такі як бензильна група для спирту або тіолу, і тре-бутоксилкарбонільні групи для аміну. Також включаються модифікації алкільних бічних ланцюгів, такі як алкільні заміщення (наприклад, метил, диметил, етил і т.д.), модифікації рівня насиченості й ненасиченості бічних ланцюгів і введення модифікованих груп, таких як заміщений феніл і феноксигрупа. Похідні також можуть включати коньюгати, такі як молекули біотину або авідину, ферменти, такі як пероксидаза хріну й таке інше, і радиоізотопно-мічені, біолюмінесцентні, хемолюмінесцентні або флуоресцентні фрагменти. Крім того, фрагменти можуть бути додані до описаних тут речовин для зміни їх фармакокінетичних властивостей, наприклад, для збільшення часу напівжиття in vivo або ex vivo, або збільшення їх здатності проникати в клітину, у числі інших бажаних властивостей. Також включаються проліки, відомі як посилюючі численні бажані властивості фармацевтичних препаратів (наприклад, розчинність, біологічну доступність, властивості, необхідні при виробництві, і т.д.). Термін "похідне" також включає зміни вихідної послідовності, включаючи додавання, видалення й/або заміщення, які надають функціонально еквівалентні або функціонально поліпшені молекули. Відповідно до окремого варіанта здійснення винаходу похідний трепростинілу вибирають із групи кислотних похідних трепростинілу, проліків трепростинілу, поліморфів трепростинілу або ізомерів трепростинілу. Аналогічно, ілопрост, цикапрост або берапрост можуть бути похідними із групи кислотних похідних, проліків, їхніх поліморфів або ізомерів. Термін "гемопоетичні стовбурові клітини" (HSC) або більш загальний термін "стовбурові клітини" слід розуміти як еквівалентні терміни в описі даного винаходу, які звичайно відносяться до плюрипотентних або мультипотентних "стовбурових клітин", які дають початок типам клітин крові, включаючи мієлоїдний (наприклад, моноцити й макрофаги, нейтрофіли, базофіли, еозинофіли, еритроцити, мегакаріоцити/тромбоцити, дендритні клітини) і лімфоїдний напрямки диференціювання (наприклад, T-клітини, B-клітини, NK-клітини), і інших, відомих у даній області техніки. "Стовбурові клітини", як правило, характеризуються здатністю утворювати безліч типів клітин (т.б. мультипотентністю) і здатністю до самовідновлення. Однак також можуть включатися олігопотентні й уніпотентні попередники. "Гемопоез" звичайно відноситься до процесу клітинного диференціювання або утворення спеціалізованих клітин крові з HSC. У ході розвитку гемопоез переміщається з ембріональної печінки в кістковий мозок, який потім залишається місцем гемопоезу протягом всієї зрілості. Після усталення в кістковому мозку HSC не розподіляються безладно по всій порожнині кістки. У значній мірі, HSC звичайно виявляються в безпосередній близькості до ендостальної поверхні. Число більш зрілих стовбурових клітин збільшується при віддаленні від поверхні кістки. 6 UA 113284 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Гемопоетичні тканини містять клітини, здатні до довгочасної й короткочасної регенерації, a також комітовані мультипотентні, олігопотентні й уніпотентні клітини-попередники. Зокрема, зразок, що містить HSC, може являти собою кістковий мозок. HSC можуть бути отримані відомими способами з будь-якого джерела, яке, як відомо, містить HSC, зокрема, з периферичної крові, пуповини або пуповинної крові, плаценти й кісткового мозку. Альтернативно, також можливі такі джерела, як ембріональна печінка, ембріональна селезінка й аорта-гонадо-мезонефрос тварин. HSC людського походження є кращими для способів і композицій винаходу. Наприклад, HSC можна знайти в кістковому мозку дорослих, включаючи стегнові кості, шийку стегна, ребра, грудину й інші кістки. HSC можна одержати безпосередньо шляхом відбору зі стегна за допомогою голки й шприца або із крові, часто після попередньої обробки цитокінами, такими як G-CSF (гранулоцитарні колонієстимулюючі фактори), які викликають вивільнення клітин з кістково-мозкового компартменту. HSC можуть бути ідентифіковані відповідно до певних фенотипічних або генотипічних маркерів. Наприклад, HSC можуть бути ідентифіковані за їхнім малим розміром, відсутністю маркерів напрямку диференціювання (lin), низькому фарбуванню (бічна популяція) вітальними 10 барвниками, такими як родамін 123 (rho ) або Hoechst 33342, і присутності різних антигенних маркерів на їхній поверхні, багато з яких належать до групи кластера диференціювання (наприклад, CD5, CD11b, CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, GR-1 (=Ly-6G/C), 7-4, Ter119 і c-kit). HSC переважно є негативними за маркерами, які звичайно використовуються для визначення напрямку диференціювання, і, таким чином, часто відносяться до lin(-) клітин. + + + Більша частина HSC людини може бути охарактеризована як CD5 , CD45R (B220) , CD11 , GR+ + + + lo/~ + 1 , CD34 , CD59 , Thyl/CD90 , CD38 , C-kit/CD117 і lin( ). Однак, не всі стовбурові клітини + + враховуються за допомогою цих комбінацій, оскільки певні HSC є CD347 і CD38 . Також деякі дослідження припускають, що на поверхні найбільш ранніх стовбурових клітин може бути відсутній c-kit. Для очищення lin(-) HSC за допомогою проточної цитометрії, або FACS, може використовуватися набір антитіл до маркерів напрямку диференціювання зрілих клітин відносно виснаження lin(+) клітин або пізніх мультипотентних попередників (MPP), включаючи, наприклад, антитіла до CD3епсилон, CD5, CD45R, CD11b, CD16, GR-1, 7-4 і Ter-119, CD 13, CD32 і CD33, CD71, CD 19, CD61, Mac-1 (Cdl lb/CD18), Gr-I, 117Ra, CD3, CD4, CD5 і CD8 у числі інших, відомих у даній області техніки. У даній області техніки відомі додаткові способи очищення, наприклад, способи, що використовують певні характерні риси "сигнальних молекул активації лімфоцитів" (SLAM) сімейства молекул клітинної поверхні. HSC, будь то клітини з пуповинної крові, кісткового мозку, периферичної крові або іншого джерела, можуть рости або розмножуватися в будь-якому підходящому, комерційно доступному або виготовленому на замовлення певному середовищі, із сироваткою або без сироватки. HSC з людського джерела являють собою кращі варіанти здійснення винаходу. Наприклад, у певних варіантах здійснення в безсивороточному середовищі може застосовуватися альбумін і/або трансферин. Крім того, можуть бути включені цитокіни, такі як Flt-3 ліганд, фактор стовбурових клітин (SCF) і тромбопоетин (TPO), у числі інших. HSC також можуть вирощуватися в судинах, таких як біореактори. Середовище, що підходить для ex vivo експансії HSC, також може містити підтримуючі HSC клітини, такі як стромальні клітини (наприклад, лімфоретикулярні стромальні клітини), які можуть бути отримані, наприклад, при дезагрегації лімфоїдної тканини, і які демонструють підтримку in vitro, ex vivo і in vivo збереження, росту й диференціювання HSC, а також їх нащадків. "Пуповинна кров" або "кров з пупочної вени" звичайно має відношення до відносно невеликої кількості крові (приблизно до 180 мл), отриманої від немовляти, яка вертається в неонатальну циркуляцію. Пуповинна кров багата HSC і може бути зібрана й збережена для наступного використання відповідно до методів, відомих у даній області техніки. Tерміни "ex vivo" або "in vitro" відносяться до активностей, що мають місце поза організмом, таких як експериментальні роботи або вимірювання, зроблені в або на живій тканині в штучному навколишньому середовищі поза організмом, переважно з мінімальними змінами природних умов. У деяких варіантах здійснення такі тканини або клітини можуть бути зібрані й заморожені, і пізніше розморожені для обробки ex vivo. Експерименти з культурою тканини або процедури, що тривають довше декількох днів з використанням живих клітин або тканини, у більшості випадків прийнято вважати процедурами "in vitro", хоча цей термін може використовуватися взаємозамінним чином з терміном ex vivo. Перерахування "ex vivo уведення," "ex vivo обробка" або "ex vivo терапевтичне використання" відносяться в основному до медичних процедур, у яких один або більше органів, клітин або тканин отримані від живого або тільки що померлого суб'єкта, необов'язково очищені/збагачені, піддані обробці або операції з метою вплинути на 7 UA 113284 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стовбурові клітини (наприклад, стадія ex vivo уведення, яка припускає інкубацію клітин з композицією даного винаходу для збільшення здатності HSC прищеплюватися), і потім уведені тому ж самому або іншому живому суб'єктові після необов'язкової обробки або процедури. Такі ex vivo терапевтичні варіанти застосування також можуть включати необов'язкову стадію in vivo обробки або методичну стадію, таку як уведення композиції винаходу один або більше разів живому суб'єктові після введення органа, клітин або тканини. Для цих варіантів здійснення передбачається й місцеве, і системне застосування відповідно до добре відомих у даній області техніки методами. Кількість трепростинілу або кількість суміші, що містить трепростиніл і стимульовані стовбурові клітини, необов'язково разом з додатковими засобами, що вводиться суб'єктові, залежить від характерних рис цього суб'єкта, таких як загальний стан здоров'я, вік, стать, вага тіла й переносимість лікарських засобів, а також ступінь, вага й тип реакції на трепростиніл і/або клітинний трансплантат. Відповідно до конкретного варіанта здійснення винаходу композиція, що містить аналог простацикліну надається для використання при лікуванні індивідуумів, що зазнають трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин. Відповідно до кращого варіанта здійснення композиція містить аналог простацикліну, обраний із групи трепростинілу, ілопросту, цикапросту й берапросту або їх фармацевтично прийнятних солей, конкретніше, вона містить трепростиніл. Винахідницька композиція також може містити трепростиніл разом з одним або більше з числа ілопросту, цикапросту або берапросту. Aльтернативно, композиція може містити ілопрост у комбінації з одним або більше з числа трепростинілу, цикапросту або берапросту або їх фармацевтично прийнятних солей. Aльтернативно, композиція може містити берапрост у комбінації з одним або більше з числа трепростинілу, цикапросту або ілопросту, або їх фармацевтично прийнятних солей. Aльтернативно, композиція може містити цикапрост у комбінації з одним або більше з числа трепростинілу, берапросту або ілопросту або їх фармацевтично прийнятних солей. Зазначені суб'єкти можуть страждати від якої-небудь хвороби кісткового мозку, т.б. захворювання, при якому нормальна архітектура кісткового мозку «зміщена» злоякісними новоутвореннями, апластичною анемією або інфекціями, що призводять до зниження продукції клітин крові й тромбоцитів. Зазначені захворювання кісткового мозку можуть являти собою, наприклад, лейкоз, дефект компартменту клітин крові або необхідність трансплантації кісткового мозку після хіміотерапії або лікування опроміненням. Конкретніше, дефект компартменту клітин крові може бути гемоглобінопатією, подібною до таласемії, або порушеннями функції нейтрофільних гранулоцитів. Крім того, цей винахід передбачає використання для лікування індивідуумів, що страждають від захворювання кісткового мозку, наприклад, внаслідок хіміотерапії або опромінення, і при цьому, зазнають трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин, шляхом уведення, щонайменше, одного аналога простацикліну протягом обмеженого періоду часу після трансплантації кісткового мозку. Лікування суб'єктів, що зазнають трансплантації кісткового мозку, з використанням, щонайменше, одного аналога простацикліну, щонайменше, одного аналога простацикліну разом з одним або більше, зокрема, двома, більш конкретно, трьома енхансерами цАМФ або суміші, що містить, щонайменше, один, зокрема два, більш конкретно три аналоги простацикліну, і стимульованих стовбурових клітин, необов'язково разом з додатковими засобами, такими як один або більш енхансерів цАМФ, також розглядається даним винаходом. Конкретніше, енхансер цАМФ може бути форсколіном. Щонайменше, один аналог простацикліну може використовуватися для поліпшення приживлення людських HSC під час трансплантації кісткового мозку або після відновлення кісткового мозку з використанням HSC. Прискорене приживлення скорочує період, під час якого суб'єкти чутливі до потенційно летальних інфекцій, кровотечі й інших серйозних ускладнень. Отже, аналог простацикліну повинен бути корисним методом лікування, призначеним для попередньої обробки донорного кісткового мозку з метою збільшення приживлення кісткового мозку (т.б. шляхом зменшення числа необхідних клітин і скорочення тривалості аплазії кісткового мозку). Зокрема, аналог простацикліну вибирають із групи трепростинілу, ілопросту, цикапросту або берапросту або їх фармацевтично прийнятних солей. Конкретніше, трепростиніл є кращим для застосування аналогом простацикліну. Тривале лікування суб'єктів протягом декількох днів після трансплантації кісткового мозку аналогом простацикліну повинне давати в результаті поліпшені клінічні результати у вигляді поліпшення приживлення (т.б. шляхом зменшення числа необхідних клітин і скорочення тривалості аплазії кісткового мозку). 8 UA 113284 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Tаким чином, відповідно до конкретного варіанта здійснення лікування проводять протягом, щонайменше, п'яти днів після трансплантації, конкретніше протягом, щонайменше, 10 днів, ще конкретніше протягом, щонайменше, 14 днів після трансплантації. Відповідно до альтернативного варіанта здійснення винаходу розглядається композиція, що містить один або більш ніж один, аналог простацикліну й стимульовані гемопоетичні стовбурові клітини. Альтернативно, у певних варіантах здійснення до композиції може додаватися засіб, обраний з енхансера циклічного АМФ (цАМФ) або ліганду рецептора простагландіну EP. Відповідно до окремого варіанта здійснення винахідницька композиція також може містити форсколін. Зокрема, композиції винаходу є фармацевтичними композиціями. У зазначених композиціях можуть міститися додаткові фармацевтично прийнятні ексципієнти (допоміжні речовини), відомі в даній області техніки. Кількість аналога простацикліну залежить від терапевтичного засобу або методу приготування стимульованих HSC. Зокрема, ефективну кількість трепростинілу для терапевтичних варіантів застосування становить, щонайменше, 1,0 нг/кг ваги тіла. Винахідницька композиція може вводитися суб'єктові будь-яким способом, застосовуваним і відомим у даній області техніки. Конкретніше, забезпечується внутрішньовенне або підшкірне введення. Зазначена композиція може перебувати у формі для перорального приймання, обраної із групи форм із тривалим вивільненням, таблеток або капсул. Попередній опис стане повністю зрозумілим на підставі наступних прикладів. Однак, такі приклади є лише характерними прикладами застосування на практиці одного або більше варіантів здійснення даного винаходу, і їх не слід розумітияк обмежуючі винахід рамки. Приклади Приклад 1 Mатеріали й методи Виділення кістковомозкових стовбурових клітин Десять мишей (C57BL/6) умертвляли зсувом шийних хребців. Трубчасті кістки задніх кінцівок (тобто стегнові й великогомілкові) звільнили від м'язів і сполучної тканини й промили середовищем RPMI, використовуючи шприц і голку 27½ G. Клітинну суспензію звільнили від видимої сполучної тканини, зібрали й перенесли в центрифужні пробірки. Клітини зібрали центрифугуванням (1200 об./хв./~100 g протягом 5 хв.) і ресуспендували в 3 мл буферу, лізуючого еритроцити (0,15 M NH4Cl; 10 мM KHCO3; 0,1 мM EDTA, значення pH від 7,2 до 7,4). Суспензію клітин інкубували протягом 2 хв. при 20 °C, а потім 4 хвилини на льоду. Після цього, додали RPMI (10 мл) і клітини зібрали центрифугуванням і підрахували. Типово вихід клітин 7 становив 3*10 /мишу. Клітини ресуспендували в крижаному PBS (фосфатно-сольовому буфері), що містить 2% 8 FCS (ембріональна теляча сироватка) при щільності клітин 2,5*10 клітин/мл, до яких додали суміш біотинільованих антитіл (набір "Lineage Cell Depletion Kit" від Miltenyi Biotec), що містить лінієспецифічні антитіла до CD5, CD45R (B220), CD11b, GR-1 (=Ly-6G/C), 7-4 і Ter-119 при 8 відношенні 0,1 мл розчину антитіл на 10 клітин. Клітини інкубували з антитілами протягом 20 хв. на льоду й осадили центрифугуванням. Після ресуспендування до суспензії клітин додали 8 8 (3,3*10 клітин/мл) вторинні антибіотин-покриті мікробусини (0,2 мл/10 клітин, надані з набором ("Lineage Cell Depletion Kit" від Miltenyi Biotec), а суміш інкубували протягом 15 хв. на льоду. Після цього зразок розвели в MACS-буфері (30 мл), клітини зібрали центрифугуванням і ресуспендували в 6 мл MACS-буферу. Цю суспензію завантажили на попередньо заправлені LS колонки, які містили феромагнітні частки, покриті сумісним із клітинами пластмасовим матеріалом. Як правило, використовували три колонки (2 мл суспензії клітин/колонка). Елюат містив клітини, негативні за лінійним маркером (клітини Lin ), тоді як лінійно-комітовані клітини втримувалися на колонці. Клітини осаджували центрифугуванням і ресуспендували в мл PBS. 5 Типовий вихід становив 7*10 Lin клітин/миша. Флуоресцентно-активуєме сортування клітин (FACS-аналіз) Антитіла, використовувані для фарбування маркерів клітинної поверхні, були отримані з наступних джерел: набір мишачих лінійних антитіл був отриманий від Becton Dickinson Biosciences (BD 559971, що містить у біотинованій формі анти-CD3ε, анти-CD11b, анти-CD45R, анти-Ly-6G/Ly-6c, анти-Ter-119), афінно очищені щурячі антимишачі CD16/CD32 (mouse Fcγ II/III block, BD 553142) і флуоресцентний барвник стрептавідин-алофікоцианін-Cy7 (стрептавідин APC-Cy7, BD554063) також були від компанії Becton Dickinson Biosciences. Фікоеритрин(PE)-Cy 7-мічені антимишачі Ly6A/E (=антиген стовбурових клітин-1 = Sca1) PE-Cy7 (катал. № 25-5981 9 UA 113284 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 82) і PE-Cy5 антимишачі CD117 (c-Kit) (катал. № 15-1171-81) були від компанії ebiosciences. 6 Відразу після MACS 1*10 лінійно-позитивних (Lin+) і негативних (Lin-) клітин перенесли в FACS пробірки й тримали на льоду в 50 мк PBS. У цей час наступні FACS антитіла розвели (1:50) і змішали в PBS: анти CD16/CD32 очищені (для блокування Fc-рецепторів), біотинільовані анти-CD3ε, біотинільовані анти-CD11b, біотинільовані анти-CD45R, біотинільовані анти-Ly6G/Ly-6C і біотинільовані анти-Ter-119, мічені стрептавідином APC-Cy7, PE-Cy 7-мічені антиSca-1, PE-Cy 5-мічені анти-c-kit. Цей майстер-мікс (суміш) (50 мкл) додавали до кожного зразка, який потім перемішували за допомогою слабкого струшування й інкубували за 4 °C у темряві протягом 15 хв. Після цього, клітини збирали центрифугуванням, промивали в 2 мл PBS і ресуспендували в PBS. Зразки аналізували на приладі FACS Canto II (Becton Dickinson). Використовували установку дискримінаційного вікна як зазначено далі: "ворота" для живих клітин були встановлені шляхом реєстрації переднього й бічного розсіювання. Живі клітини додатково розрізняли на основі експресії лінійних маркерів (т.б., CD11b, CD45R, Ly-6G/Ly-6C, Ter-119). Це давало можливість установлення «воріт» для Lin клітин, які додатково аналізували відносно експресії Sca-1 і c-Kit. Аналіз нагромадження [3H]цАМФ – + Lin /sca1 -клітини інкубували в 1 мл середовища для стовбурових клітин (Stem Span SFEM, Stem Cell Tech #09650), що містить по 0,5 мг/л бензилпеніциліну й стрептоміцину, по 50 нг/мл мишачого фактора стовбурових клітин (mSCF), людського Flt-3, hIL-11 50 нг/мл, m-Il3 (10 нг/мл) 3 (усе від компанії Preprotech), 10 мкг/мл аденозиндезамінази (Roche) і [ H]аденін (Perkin Elmer, 1 мкCi/мл). Преінкубація тривала протягом 4 год. при 37 °C. Потім клітини стримулювали різними речовинами (форсколіном, трепростинілом і іншими простаноїдами; холерним токсином) протягом 1 год. Потім клітини осадили центрифугуванням (5 хв. при 100 g), середовище вилучили й осад лізували в крижаній 2,5% хлорній кислоті (0,9 мл), що містить 0,1 мM цАМФ, тримали на льоду протягом 1 год. і нейтралізували 4,2 M KOH (0,1 мл)). Клітини, позитивні за лінійними маркерами, попередньо інкубували аналогічним чином, але в середовищі, що містило RMPI замість безсивороточного середовища для стовбурових клітин. АМФ і цАМФ розділили за допомогою послідовної хроматографії на колонках, що містять Dowex AG50-X8 і нейтральний окис алюмінію (12). Той факт, що відмінності можна бачити тільки в присутності форсколіну, є технічною проблемою - без підвищення чутливості форсколіном (тобто при його відсутності) сигнал є недостатнім, щоб бачити які-небудь відмінності між різними сполуками, т.б. ілопростом, берапростом і трепростинілом. Підвищення чутливості означає, що клітини стають більш чутливими (сенсибілізуються) до рецепторної відповіді, тому що ці клітини містять надзвичайно низький рівень цАМФ. По концентраційній кривій (Фіг. 5) для трепростинілу можна бачити, що збільшення цАМФ є істотним без додавання форсколіну. Трансплантація кісткового мозку Ізогенних мишей-реципієнтів піддавали летальному опроміненню. Якщо цих мишей не врятувати шляхом внутрішньовенного введення гемопоетичних стовбурових клітин, вони гинуть + + протягом перших двох тижнів. Lin (Sca1 і c-Kit ) гемопоетичні стовбурові клітини були приготовлені, як описано вище, і були попередньо оброблені ex vivo за відсутності та у присутності 10 мкM трепростинілу, комбінації трепростиніл + 30 мкM форсколін (FSK), 10 мкг/мл 5 холерного токсину протягом 1 год. при 37 °C. Після цього, клітини (3x10 /миша) уводили через хвостову вену. Підрахунок лейкоцитів проводили за допомогою FACS. Підрахунок лейкоцитів проводили кожні 5 днів, починаючи з 9 дня (коли кількість лейкоцитів була ~1 г/л). Результати Очищення гемопоетичних стовбурових клітин Використання методу на основі MACS дозволяє утримати позитивні за лінійними маркерами + (Lin ) клітини на магнітних частках і дає можливість виділення клітин, негативних за лінійними маркерами (Lin ): властивості клітинної популяції були охарактеризовані за допомогою FACS. MACS-затримана популяція клітин дійсно була збагачена клітинами, які були пофарбовані лінійно-специфічними маркерами й були позбавлені рецептора стовбурових клітин c-Kit/CD117 (Фіг. 1). На противагу цьому, клітини, виділені з елюату колонки, переважно були виявлені у верхньому лівому квадранті, т.б., вони показували високий рівень c-Kit і були позбавлені APCCy7-a флуоресценції, що свідчило про виснаження лінійних маркерів (Фіг. 2). Популяції клітин додатково оцінювали шляхом подвійного фарбування й c-Kit і Sca-1 (антиген стовбурових клітин-1): лінійно-позитивні клітини були позбавлені цих двох маркерів (Фіг. 3A), у той час як лінійно-негативна фракція експресувала високі рівні c-Kit або комбінації c 10 UA 113284 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Kit і Sca-1 (Фіг. 3B). + + Нагромадження циклічного АМФ у клітинах c-Kit і Sca1 + + Пул аденінових нуклеотидів гемопоетичних стовбурових клітин (c-Kit і Sca-1 популяція, 3 дивися Фіг. 3B) метаболічно позначили [ H]аденіном і перевірили їхню відповідь на трепростиніл і інші агоністи простагландинового рецептора. Оскільки ці клітини показують досить помірну цАМФ-відповідь, фермент сенсибілізували шляхом використання форсколіну. Цей дитерпен зв'язується в псевдосубстратній щілині між каталітичними C1 і C2 доменами аденілатциклази й робить різні ізоформи ферменту більш легко реагуючими на стимулюючий G білок Gs (13-15). Як видно з Фіг. 4, трепростиніл, берапрост і ілопрост як такі (per se) викликали помірне нагромадження цАМФ, порівнянне за величиною з нагромадженням, викликаним форсколіном 30 мкM. Однак, у комбінації з форсколіном трепростиніл викликав збільшення рівня цАМФ, що перевершує збільшення, викликане IP-(I простаноїд) рецептор-специфічними сполуками ілопрост і берапрост. Це можна пояснити, якщо взяти до уваги дію трепростинілу на EP(E простаноїд)-рецептори (10). Трепростиніл викликав залежне від концентрації нагромадження цАМФ у межах від 0,1 дo 10 мкM (Фіг. 5). Значення EC50 перебувало в межах 0,3 мкM. + Трепростиніл виявився нездатним підвищити рівень цАМФ в Lin фракції гемопоетичних клітин (дані не показані). + + Відновлення кісткового мозку гемопоетичними стовбуровими клітинами (Lin , c-Kit , Sca1 ) 5 Летально опромінених мишей відновлювали за допомогою внутрішньовенної ін'єкції 3*10 + + Lin , c-Kit , Sca1 клітин. Кількість лейкоцитів починала збільшуватися з найнижчого рівня на 9 день і повільно збільшувалася протягом наступних декількох тижнів. Рівень лейкоцитів у день 60 після ін'єкції гемопоетичних стовбурових клітин був обраний у якості релевантної кінцевої крапки, тому що через 60 днів циркулюючі лейкоцити могли продукуватися гемопоетичними стовбуровими клітинами, що тільки прижилися. Як видно на Фіг. 6, миші, ін'єктовані попередньо обробленими трепростинілом гемопоетичними стовбуровими клітинами, мали значно вищі рівні циркулюючих лейкоцитів, ніж ті, що одержали оброблені носієм гемопоетичні стовбурові клітини (p