Способи лікування, профілактики та діагностики інфекції helicobacter cerdo

1. Композиція, яка включає фармацевтично прийнятний розчинник і принаймні один імуноген Н. cerdo. 2. Композиція за п.1, де принаймні один імуноген Н. cerdo забезпечується лізатом Н. cerdo. 3. Композиція за п.2, де лізат Н. cerdo одержаний шляхом протеолітичного переварювання бактерій Н. cerdo. 4. Композиція за будь-яким з пп.1-3, яка додатково включає ад'ювант. 5. Спосіб лікування або запобігання інфекції Helicobacter у свині, який включає введення терапевтично ефективної кількості композиції за будь-яким з пп.1-4. 6. Спосіб за п.5, де інфекція Helicobacter є інфекцією Helicobacter cerdo. 7. Спосіб за будь-яким з пп.5, 6, де названа композиція вводиться парентерально. 8. Спосіб лікування або запобігання інфекції Helicobacter cerdo у свині, який включає парентеральне введення терапевтично ефективної кількості композиції за будь-яким з пп.1-4. 9. Спосіб виробництва композиції, який включає: (а) забезпечення принаймні одного імуногену Helicobacter cerdo; і (б) комбінування названого імуногену Н. cerdo з фармацевтично прийнятним розчинником. 10. Спосіб за п.9, де принаймні один названий імуноген Н. cerdo забезпечується лізатом Н. cerdo. 2 (19) 1 3 84284 4 25. Застосування композиції за будь-яким з пп.1-4 або лізату Н. cerdo за пп.21 або 22 у способі виявлення інфекції Helicobacter у свині. 26. Застосування за п.25, при якому інфекцією Helicobacter є інфекція Н. cerdo. Даний винахід належить головним чином до бактеріальних імуногенів. Зокрема, винахід має відношення до Helicobacter cerdo, нового патогену, ізольованого з домашньої свині, і способів лікування, профілактики та діагностики інфекції Helicobacter з використанням імуногенних білків і нуклеїнових кислот, одержаних з H. cerdo. Хвороба шлунка - важлива причина захворюваності та джерело економічних втрат у свинарстві [O'Brien, J. (1992) "Gastric ulcer" p.680. In A.D. Leman, B.E. Straw, W.L. Mengeling, and S.D. D'Allaire (ed.), Diseases of swine. Wolfe, London, United Kingdom]. Хоча причина хвороби шлунка раніше не була встановлена, її найчастіше відносили до неправильної дієти та/або стресу [O'Brien, J. (1992) "Gastric ulcer" p.680. In A.D. Leman, B.E. Straw, W.L. Mengeling, and S.D. D'Allaire (ed.), Diseases of swine. Wolfe, London, United Kingdom]. B 1984 року з'ясувалося, що при гастритах/виразках у людини етіологічним агентом є Helicobacter pylori (Hp), що згодом було підтверджено наявністю цього агента у пацієнтів з гастритом [Marshall and Warren (1984) Lancet 1: 13111314]. Зараз Hp загально визнаний одним з первинних шлункових патогенів, а вивчення цього виду бактерій і спектра хвороб, асоційованих з ним, стало основним напрямком у гастроентерології людини [Suerbaum and Michetti (2002) N. Eng. J. Med. 347: 1175-1186]. Hp є причиною хронічного поверхневого (активного) гастриту типу В [Buck (1990) Clin. Micro. Rev. 3: 1-12; Blaser (1992) Gastroenterol. 102: 720-727; Consensus Statement, 1994, NSAID], незалежної виразки шлунка [Peterson (1991) N. Eng. J. Med. 324: 1043-1047; Moss and Calam (1992) Gut 33: 289-292, Leung et al. (1992) Am. J. Clin. Pathol. 98: 569-574; Forbes et al. (1994) Lancet 343: 258-260], атрофічного гастриту [Nomura et al. (1991) N. Eng. J. Med. 325: 1132-1136, Parsonnet et al. (1991) JNCI 83: 640-643; Sipponen (1992) Drugs 52: 799-804, 1996] і MALT лімфоми шлунка [Rodriguez et al. (1993) Acta Gastro-Enterol. BeIg. 56 (suppl):47; Edir et al. (1994) J. Clin. Pathol. 47: 436-439]. Протягом більш ніж десяти років проти Hp людини використовувалася множинна антибактеріальна терапія. Ця терапія може бути дорогою, обтяжливою для введення, і часто виліковує хворобу не повністю. Таку терапію нереально використовувати для лікування домашньої худоби. Більше того, необдумане використання антибактеріальних агентів полегшує появу резистентних по відношенню до антибіотиків штамів Hp, і резистентність Hp по відношенню до метронідазолу та кларитроміцину вже збільшилася [Michetti (1997) Gut 41: 728-730]. Крім того, небажано використовувати антибіотики для лікування тварин, що йдуть у їжу. Спроби лікувати інфекцію Hp у людини з використанням імунотерапії, а не хіміотерапії, були невдалими. Зокрема, спроби індукувати імунітет, що імітує «природну» імунну відповідь у конвалесцентно інфікованих людей, були невдалими, оскільки інфекція Hp у людини може зберігатися, незважаючи на сильну імунну відповідь на Hp [Lee (1996) Gastroenterol. 110: 2003-2006]. У мишей імунний захист був одержаний з використанням оброблених ультразвуком або рекомбінантних білків, таких як ureA та ureB, vacA та GroEL, що вводилися орально з холерним токсином (CT) і термолабільним токсином (LT) як адъювантами. Програми розробки вакцин спочатку були спрямовані на використання як імуногенів-мішеней очищених та/або рекомбінантних бактеріальних білків. В основному в результаті були одержані суперечливі дані або лише частковий захист. Вакцинація гризунів через слизову, посилена CT та LT, стала обнадійливим напрямком в цих дослідженнях, всупереч тому факту, що ці види є високорезистентними по відношенню до токсичних ефектів CT/LT, і одержані на гризунах дані не можуть бути прямо перенесені налюдей і свиней. Зокрема, у поросят, імунізованих, а потім заражених Hp, найбільш сильним індикатором ефективності, що передує імунізації, є присутність та рівень Hp-специфічного імуноглобуліну G (IgG) у сироватці крові та слині [Eaton and Krakowka (1992) Gastroenterol. 103: 1580-1586]. Парентеральна вакцинація стимулює сильну відповідь у вигляді IgG, оральна вакцинація не забезпечує такої відповіді. Парентеральна імунізація повністю захи щала 50% поросят, імунізованих підшкірно, і 60% поросят, імунізованих внутрішньочеревинно [Eaton et al., (1998) J. Infect. Dis. 178: 1399-1405]. На відміну від цього, оральна вакцинація, зроблена: 1) живими бактеріями, обробленими антимікробними агентами до введення тваринам, 2) цілими інтактними вбитими бактеріями, 3) цілими бактеріями, обробленими ультразвуком, 4) цілими бактеріями, обробленими ультразвуком, з LT зі слизової оболонки як адъювантом - не забезпечила жодного випадку захисту (0 з 27 поросят або 0%). Бактеріальні КУО були знижені в порівнянні з контролями, але рівень зниження не досягав статистично значущого. Таким чином, на свинячій моделі колонізації Hp при наявності гострого гастриту парентеральний метод вакцинації є, очевидно, найкращим у порівнянні з оральним методом, як при абсолютному (інфіковані по відношенню до неінфікованих після зараження), так і відносному (бактеріальні КУО у вакцинованих проти невакцинованого контролю) способі визначення антимікробної ефективності. Даний винахід оснований на відкритті нового патогену Helicobacter, виділеного зі свині з гастритом/виразковою хворобою. Цей мікроорганізм був названий винахідниками Helicobacter cerdo (Hc). Винахідники показали, що цей мікроорганізм викликає у молодих поросят хворобу шлунка, схожу на Hp-асоційований активний гастрит у людей. 5 84284 Частини вакцини, включаючи антигени та суміші антигенів, виділених з H. cerdo, забезпечують захист проти наступної інфекції видами Helicobacter, такими як H. pylori та H. cerdo, Даний винахід забезпечує безпечний, ефективний та економічний спосіб лікування та/або профілактики інфекції Hc у свиней. Відповідно, в одному втіленні, об'єкт винаходу спрямований на композицію, яка включає фармацевтично прийнятний розчинник і, принаймні, один імуноген Helicobacter cerdo. B ряді втілень, принаймні, один імуноген H. cerdo забезпечується лізатом H. cerdo, таким як лізат, одержаний в результаті протеолітичного переварювання бактерій H. cerdo. B додаткових втіленнях, композиція включає також ад'ювант. В іншому втіленні, винахід спрямований на способи лікування або профілактики інфекції Helicobacter у хребетних суб'єктів, включаючи введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості композиції, як описано вище. У ряді втілень, хребетним суб'єктом є свиня. У додаткових втіленнях, інфекція Helicobacter є інфекцією Helicobacter cerdo. Крім того, у додаткових втіленнях, композиція вводиться парентерально. У ще одному втіленні, винахід спрямований на спосіб лікування або профілактики інфекції Helicobacter cerdo у свині, включаючи парентеральне введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості композиції, як описано вище. В іншому втіленні, винахід спрямований на спосіб виробництва композиції, включаючи: (а) забезпечення, принаймні, одного імуногену Helicobacter cerdo; і (б) комбінацію імуногену H. cerdo з фармацевтично прийнятним розчинником. У ряді втілень, принаймні, один імуноген H. cerdo забезпечується лізатом H. cerdo, таким, як лізат H. cerdo, одержаний за рахунок протеолітичного переварювання бактерій H. cerdo. B додаткових втіленнях забезпечується також ад'ювант. В ще одному втіленні винахід спрямований на спосіб виявлення інфекції Helicobacter у суб'єктів, включаючи: (а) забезпечення біологічного зразка із суб'єкта; і (б) реакцію біологічного зразка, принаймні, з одним імуногеном H cerdo в умовах, які дозволяють антитілам проти Helicobacter, коли вони присутні в біологічному зразку, зв'язуватися з імуногеном(ами), виявляючи в такий спосіб присутність або відсутність інфекції Helicobacter у суб'єкта. У ряді втілень спосіб додатково включає: (в) видалення незв'язаних антитіл; (г) забезпечення однієї або більше структур, здатних до асоціації зі зв'язаними антитілами; і (д) детектування присутності або відсутності однієї або більше структур, що , таким чином, забезпечує детектування присутності або відсутності інфекції H. cerdo. У ряді втілень міткою, що забезпечує детектування, є флуорофор або фермент. У додаткових втіленнях, принаймні, один імуноген забезпечується лізатом H. cerdo. B інших втіленнях, біологічним зразком є зразок сироватки крові свині. 6 У додаткових втіленнях, винахід спрямований на спосіб виявлення інфекції Helicobacter cerdo у свині, який включає: (а) забезпечення біологічного зразка суб'єкта; і (б) реакцію біологічного зразка, принаймні, з одним імуногеном H. cerdo в умовах, які дозволяють антитілам проти H. cerdo, коли вони присутні в біологічному зразку, зв'язуватися з імуногеном(ами), (в) видалення незв'язаних антитіл, (г) забезпечення однієї або більше структур, здатних до асоціації зі зв'язаними антитілами; і (д) детектування присутності або відсутності однієї або більше структур, виявляючи, таким чином, присутність або відсутність інфекції H. cerdo. В ще додаткових втіленнях винахід спрямований на антитіла, специфічні по відношенню до імуногену Helicobacter cerdo. B ряді втілень антитіла є поліклональними. В інших втіленнях, антитіла є моноклональними. В іншому втіленні винахід спрямований на лізат Helicobacter cerdo, який включає, принаймні, один імуноген H. cerdo. B ряді втілень лізат H. cerdo виробляється шляхом обробки бактерій H. cerdo протеолітичними ферментами. Ці та інші втілення об'єкта винаходу будуть легко здійснюватися фахівцями в даній області в аспекті того, що тут розкрито. Фіг.1 показує результати розділення білків інтактного та підданого протеолізу препаратів H. pylori та H. cerdo з використанням електрофорезу на поліакриламідному гелі з домішкою додецилсульфату натрію (SDS-PAGE). Знак «>» на Фіг. показує білкові смуги, представлені в препаратах H. pylori і відсутні в препаратах H. cerdo. Знак «]» вказує на продукти протеолізу, що мають низьку молекулярну масу. Фіг.2А та 2Б демонструють результати розділення білків інтактних (2A) і оброблених протеазами бактерій H. cerdo методом електрофорезу SDS-PAGE (2Б). Видно, що в препараті, підданому протеолізу, збільшена кількість білків з низькою молекулярною масою. Фіг.3А та 3Б показують результати вестернблот аналізу білків інтактного (3А) і обробленого протеазами бактерій H. cerdo (3Б), розділених методом електрофорезу в нативному нередукуючому гелі. Фіг.4А та 4Б показують результати вестернблот аналізу, проведеного з використанням антитіл проти H. cerdo, інтактних бактерій H cerdo (4A) і продуктів, одержаних в результаті протеолізу H. cerdo (4Б). У підданих протеолізу препаратах видно збільшену кількість низькомолекулярного матеріалу (показану знаком ]). Видно також більш високу інтенсивність фарбування (*), а також додаткові імунореактивні смуги (» на Фіг.ілюструє білкові смуги, представлені в препараті Hp і відсутні в препараті Hc. Знак «]» показує низькомолекулярні продукти, одержані в результаті протеолізу. Було також проведене електрофоретичне розділення (SDS-PAGE) інтактних і підданих протеолізу білків H. cerdo. Як видно на Фіг.2А (інтактні) і 2Б (піддані протеолізу), серед продуктів протеолізу присутня збільшена кількість матеріалу з низькою молекулярною масою (показаний знаком «