Способи лікування аутоімунних захворювань з використанням злитої молекули taci-ig

Реферат: Заявлений винахід забезпечує способи і композиції для лікування аутоімунних захворювань, у тому числі ревматоїдного артриту, які передбачають введення потребуючому такого лікування пацієнту злитої молекули TACI-Ig, де вказану композицію вводять у кількості від 0,01 до 10 мг/кг маси тіла пацієнта 7 разів протягом дванадцятитижневого інтервалу; або 3 рази протягом чотиритижневого інтервалу; або кожний другий тиждень протягом 2-30 тижнів; або один раз на тиждень. UA 98462 C2 (12) UA 98462 C2 UA 98462 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на родинні заявки Дана заявка претендує на пріоритет за попередньою заявкою США № 60/747270, поданої 15 травня 2006 року, зміст якої включений в даний опис як посилання. Галузь техніки, до якої належить винахід У різних варіантах здійснення даний винахід належить до способів і композицій для лікування аутоімунних захворювань або порушень імунної системи, що передбачає введення злитого білка TACI-Ig, який блокує функції факторів росту сімейства TNF. Рівень техніки Сімейство лігандів/рецепторів BlyS Було ідентифіковано три рецептори: ТАСІ (трансмембранний активатор або кальціймодулюючий ліганд-взаємодіючий агент циклофіліну), ВСМА (антиген дозрівання В-клітин) і BAFF-R (рецептор В-клітинного активуючого фактора, який належить сімейству TNF), які мають унікальну афінність зв'язування двох факторів росту: BlyS (стимулятора B-лімфоцитів) і APRIL (індукуючого проліферацію ліганду) (Marsters et al. Curr. Biol. 2000; 10(13): 785-788; Thompson et al. Science 2001; 293:2108-2111). ТАСІ і ВСМА зв'язують як BlyS, так і APRIL, у той час як BAFFR, очевидно, здатний зв'язувати тільки BlyS з високою афінністю (Marsters et al. Curr. Biol. 2000; 10(13): 785-788; Thompson et al. Science 2001; 293: 2108-2111). У результаті, BlyS здатний передавати сигнал через усі три рецептори, у той час як APRIL, очевидно, здатний передавати сигнал тільки через ТАСІ і ВСМА. Крім того, циркулюючі у кровотоці гетеротримерні комплекси BlyS і APRIL (угруповання з трьох білків, що містять одну або дві копії кожного з BlyS і APRIL), були ідентифіковані в пробах сироватки, узятих у пацієнтів із системними імунопатологічними ревматичними захворюваннями, і було показано, що вони індукують проліферацію B-клітин in vitro (Roschke et al. J. Immunol. 2002: 169: 4314-4321). Серед Ig-злитих білків для всіх трьох рецепторів, тільки TACI-Fc5 був здатний блокувати біологічну активність вказаних гетеротримерних комплексів (Roschke et al. J. Immunol. 2002; 169: 4314-4321). BlyS і APRIL є сильними стимуляторами дозрівання, проліферації і виживання B-клітин (Gross et al. Nature 2000; 404: 995-999, Gross et al. Immunity 2001; 15(2): 289-302, Groom et al. J. Clin. Invest. 2002; 109(1): 59-68). BlyS і APRIL можуть бути необхідні для персистенції аутоімунних захворювань, зокрема, захворювань, у яких беруть участь В-клітини. Трансгенні миші, отримані генною інженерією для експресії високих рівнів BlyS, виявляють порушення імунних клітин і виявляють симптоми, подібні до симптомів, що спостерігаються в пацієнтів із системним червоним вовчаком (SLE) (Cheson et al. Revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood 1996; 87: 49904997, Cheema et al. Arthritis Rheum 2001; 44(6): 1313-1319). Подібним чином збільшені рівні BlyS/APRIL були виміряні в пробах сироватки, узятих у пацієнтів із системним червоним вовчаком (SLE) і інших пацієнтів з різними аутоімунними захворюваннями, такими як ревматоїдний артрит (Roschke et al. J. Immunol. 2002; 169: 4314-4321; Mariette X., Ann. Rheum. Dis. 2003; 62(2): 168-171; Hahne et al. J. Exp. Med. 1998; 188(6): 1185-1190), який поширює асоціацію BlyS і/або APRIL і опосередкованих B-клітинами захворювань від моделей тварин до людей. Ревматоїдний артрит Ревматоїдний артрит (RA) є хронічним запальним захворюванням, що характеризується неспецифічним, звичайно симетричним запаленням периферичних суглобів, які потенційно приводять до прогресуючої деструкції суглобових і навколо суглобових структур. Приблизно 1 % населення є ураженим, причому жінки уражаються в два-три рази частіше, ніж чоловіки. Хоча точна етіологія вказаного захворювання є нез'ясованою, сильний доказ припускає, що RA є аутоімунним захворюванням. Декілька аутоантитіл асоційовані з RA, у тому числі ревматоїдний фактор (RF), який часто асоціюється з більш тяжким захворюванням, антинуклеарні фактори й антитіла проти нативного колагену типу II і цитрулінованих пептидів. Помітні імунологічні відхилення від норми, що можуть бути важливими в патогенезі RA, містять у собі імунні комплекси, виявлені в клітинах синовіальної рідини й у васкуліті. Вказаним комплексам сприяють антитіла (такі як RF), які продукуються плазматичними клітинами і хелперними Т-клітинами, що інфільтрують синовіальну тканину і які продукують прозапальні цитокіни. Макрофаги і їх цитокіни (наприклад, TNF, GMCS-F) також знаходяться в надлишку в патологічному синовіумі. Підвищені рівні молекул адгезії сприяють міграції запальних клітин і їхньому втримуванню в синовіальній тканині. Підвищені рівні клітин вистілки, які походять з макрофагів, а також рівні деяких лімфоцитів, теж є надлишковими. Роль Т-клітин у патогенезі RA добре встановлена, у той час як роль В-клітин є менш зрозумілою. Проте, B-клітини відіграють численні ролі в патогенезі RA, які включають у себе дію як антигенпрезентуючі клітини, секрецію прозапальних цитокінів, продукування аутоантитіл ревматоїдного фактора й активацію Т-клітин. Потенційна роль B-клітин додатково 1 UA 98462 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підтверджується позитивними результатами клінічних дослідів тестування ритуксимабу, моноклонального антитіла проти CD20, у пацієнтів з RA, найбільш ясно при наданні в комбінації з метотрексатом або циклофосфамідом. Вказані відкриття припускають, що B-клітини є придатною мішенню для терапевтичного втручання в RA. Встановлені способи лікування RA містять у собі модифікуючі захворювання антиревматичні лікарські засоби (DMARD), такі як гідроксихлорохін, сульфасалазин, метотрексат, лефлуномід, ритуксимаб, інфліксимаб, азатіоприн, D-пеніциламін, золото (орально або внутрішньом'язово), міноциклін і циклоспорин, кортикостероїди, такі як преднізон, і нестероїдні протизапальні лікарські засоби (NSAIDS). Вказані способи лікування є звичайно неспецифічними, часто асоційовані із серйозними побічними діями і не впливають істотно на прогресування деструкції суглобів. Таким чином, є давно відчутна потреба в даній галузі в розвитку нових способів для лікування RA. Суть винаходу У різних варіантах здійснення даний винахід належить до способів лікування аутоімунних захворювань. Ілюстративно, способи відповідно до винаходу містять у собі введення пацієнту композиції, яка містить константний домен імуноглобуліну людини і позаклітинний домен ТАСІ або його фрагмент, який зв'язує BlyS і/або APRIL. В іншому варіанті здійснення винахід містить у собі способи лікування аутоімунних захворювань, у тому числі RA, з використанням злитої молекули TACI-Ig, яка містить позаклітинний домен ТАСІ або будь-який його фрагмент, що зберігає здатність зв'язувати BlyS і/або APRIL. В іншому варіанті здійснення винахід містить у собі способи лікування RA, що передбачають введення потребуючого цього пацієнту ефективної кількості злитої молекули, що містить константний ланцюг імуноглобуліну людини і позаклітинний домен ТАСІ або фрагмент позаклітинного домену ТАСІ, що зв'язує BlyS і/або APRIL. В одному варіанті здійснення вказаний фрагмент позаклітинного домену ТАСІ містить один або два повторюваних мотиви цистеїну. В іншому варіанті здійснення вказаним фрагментом є фрагмент, що містить амінокислоти 30-110 позаклітинного домену ТАСІ. Ще в одному варіанті здійснення вказаним фрагментом є фрагмент, що містить амінокислоти 1-154 позаклітинного домену ТАСІ (SEQ ID NO: 1). В іншому варіанті здійснення винахід містить у собі способи лікування RA введенням пацієнту композиції, який містить злитий поліпептид, TACI-Fc5, що містить константний домен імуноглобуліну людини, Fc5, що має послідовність, представлену у вигляді SEQ ID NO: 2, і позаклітинний домен ТАСІ, що має послідовність, представлену у вигляді SEQ ID NO: 1. Ще в одному варіанті здійснення винахід містить у собі способи лікування RA шляхом введення пацієнту композиції, яка містить злитий поліпептид, що містить константний домен імуноглобуліну людини з послідовністю, представленою у вигляді SEQ ID NO: 2, і поліпептид, що зв'язує BlyS і/або APRIL і який щонайменше на приблизно 50 %, щонайменше на приблизно 60 %, і щонайменше на приблизно 65 %, щонайменше на приблизно 70 %, щонайменше на приблизно 75 %, щонайменше на приблизно 80 %, щонайменше на приблизно 85 %, щонайменше на приблизно 90 %, щонайменше на приблизно 95 % або щонайменше на приблизно 99 % ідентичний SEQ ID NO: 1. Інші аутоімунні захворювання можна лікувати способами відповідно до винаходу за допомогою введення пацієнту злитого поліпептиду, що містить константний ланцюг імуноглобуліну людини і позаклітинний домен ТАСІ або фрагмент позаклітинного домену ТАСІ, що зв'язує BlyS і/або APRIL. Такі аутоімунні захворювання містять у собі, але не обмежуються ними, системний червоний вовчак (SLE), хворобу Грейвса, діабет типу І і типу II, розсіяний склероз, синдром Шегрена, склеродермію, гломерулонефрит, відторгнення трансплантата, наприклад, алотрансплантату органа або тканини, або відторгнення ксенотрансплантату і хворобу трансплантат проти хазяїна. В одному варіанті здійснення способи відповідно до винаходу передбачають введення пацієнту з RA злитої молекули TACI-Ig у кількостях від приблизно 0,01 мг/кг маси тіла пацієнта до приблизно 10 мг/кг маси тіла пацієнта. Злиту молекулу TACI-Ig можна вводити багаторазово з заздалегідь передбаченими інтервалами. Наприклад, вказану молекулу можна вводити 7 або більше разів під час 12-тижневого інтервалу. За вказаним початковим лікуванням злитим поліпептидом TACI-Ig можна вводити вказаний поліпептид у режимі одного разу на два тижні (кожний другий тиждень) протягом щонайменше ще 2 додаткових тижнів, наприклад, вказаний поліпептид можна вводити по одному разу на тиждень протягом додаткових 2-30 тижнів. Альтернативно, вказаний поліпептид можна вводити на основі одного разу на тиждень або одного разу на день. 2 UA 98462 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно до способів даного винаходу злитий поліпептид TACI-Ig можна вводити пацієнту з RA підшкірно, орально або внутрішньовенно й у комбінації з іншими лікарськими засобами. Такі лікарські засоби містять у собі, але не обмежуються ними, DMARD, такі як гідроксихлорохін, сульфасалазин, метотрексат, лефлуномід, ритуксимаб, інфліксимаб, азатіоприн, D-пеніциламін, золото (орально або внутрішньом'язово), міноциклін і циклоспорин, кортикостероїди, такі як преднізон, NSAIDS, цитокіни, антицитокіни й інтерферони. Короткий опис фігур Фіг. 1. Дерево ескалації дози для лікування TACI-Fc5. Фіг. 2. Діаграма зон тіла пацієнта, що можуть бути використані для підшкірних ін'єкцій молекули TACI-Ig. Докладний опис винаходу У різних варіантах здійснення даний винахід належить до способів лікування аутоімунного захворювання в пацієнта шляхом інгібування взаємодії BlyS і/або APRIL з їхніми рецепторами. Вказаним пацієнтом може бути ссавець, наприклад, людина. В одному варіанті здійснення вказані способи використовують інгібітор, що містить: 1) поліпептид, який містить домен, що щонайменше частково ідентичний позаклітинному домену ТАСІ, або його фрагмент, який зв'язує BlyS і/або APRIL; і 2) константний ланцюг імуноглобуліну людини. В одному варіанті здійснення в способах відповідно до винаходу використовують злиту молекулу, що містить константний ланцюг імуноглобуліну людини і будь-який поліпептид, що має щонайменше приблизно 50 %, щонайменше приблизно 60 %, щонайменше приблизно 65 %, щонайменше приблизно 70 %, щонайменше приблизно 75 %, щонайменше приблизно 80 %, щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 %, по меншій мері приблизно 95 % або щонайменше приблизно 99 % ідентичність послідовності з позаклітинним доменом ТАСІ. У патентах США №№ 5969102, 6316222 і 6500428 і заявки на патент США 09/569245 і 09/627206 (описи яких включені в даний опис у повному обсязі як посилання) описані послідовності для позаклітинного домену ТАСІ, а також специфічні фрагменти позаклітинного домену ТАСІ, що взаємодіють з лігандами ТАСІ, у тому числі BlyS і APRIL. Один ілюстративний фрагмент позаклітинного домену ТАСІ містить один або два мотиви повторюваного цистеїну. Іншим ілюстративним фрагментом є фрагмент, що містить амінокислоти 30-110 позаклітинного домену ТАСІ або його фрагменти. Ще одним ілюстративним фрагментом є фрагмент, що містить амінокислоти 1-154 позаклітинного домену ТАСІ (SEQ ID NO: 1) або його фрагменти. Інші злиті молекули, застосовні для способів відповідно до винаходу, містять у собі: злитий поліпептид між константним ланцюгом імуноглобуліну людини і повним позаклітинним доменом ТАСІ або його ортологом або злитий поліпептид між константним ланцюгом імуноглобуліну людини і будь-яким фрагментом позаклітинного домену ТАСІ, що може зв'язувати ліганди BlyS і APRIL. Будь-яка зі злитих молекул, використовуваних у способах даного винаходу, може називатися злитою молекулою TACI-Ig. TACI-Fc5 є однією зі злитих молекул TACI-Ig, застосовних для способів відповідно до винаходу. TACI-Fc5 є рекомбінантним злитим поліпептидом, що містить позаклітинну лігандзв'язувальну частину рецептора ТАСІ від приблизно амінокислоти 1 до приблизно амінокислоти 154 (SEQ ID NO: 1) і модифіковану Fc-частину імуноглобуліну людини, Fc5 (SEQ ID NO: 2). Інші молекули TACI-Ig, застосовні для способів відповідно до винаходу, містять у собі злиту молекулу, що містить поліпептид з SEQ ID NO: 2 і поліпептид, що може зв'язувати BlyS і який може бути щонайменше приблизно на 50 %, щонайменше приблизно на 60 %, щонайменше приблизно на 65 %, щонайменше приблизно на 70 %, щонайменше приблизно на 75 %, щонайменше приблизно на 80 %, щонайменше приблизно на 85 %, щонайменше приблизно на 90 %, щонайменше приблизно на 95 % або щонайменше приблизно на 99 % ідентичним SEQ ID NO: 1. Варіанти здійснення даного винаходу містять у собі способи застосування злитої молекули TACI-Ig для лікування RA. Інші аутоімунні захворювання, які можна лікувати способами відповідно до винаходу, містять у собі системний червоний вовчак (SLE), хворобу Грейвса, діабет типу І і типу II, розсіяний склероз, синдром Шегрена, склеродермію, гломерулонефрит, відторгнення трансплантата, наприклад, алотрансплантату органу або тканини, і відторгнення ксенотрансплантату, хворобу трансплантат проти хазяїна або будь-яке інше аутоімунне захворювання, яке можна лікувати зменшенням кількості циркулюючих зрілих B-клітин і секретуючих імуноглобулін клітин і розчинних імуноглобулінів, асоційованих з такими захворюваннями. Варіанти здійснення містять у собі також способи лікування введенням пацієнту злитої молекули, що містить константний домен імуноглобуліну людини і поліпептид, що містить будьякий фрагмент позаклітинного домену ТАСІ, що може зв'язувати BlyS і/або APRIL. 3 UA 98462 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Злиту молекулу TACI-Ig можна вводити пацієнту відповідно до будь-якого придатного способу введення, у тому числі, але не тільки, орально, внутрішньовенно або підшкірно. Готові форми TACI-Ig, застосовні для способів відповідно до винаходу, можна готувати і зберігати у вигляді замороженого, стерильного, ізотонічного розчину. Такі готові форми можуть містити в собі інші активні інгредієнти і ексципієнти, такі як, наприклад, хлорид натрію, фосфатний буфер і гідроксид натрію або о-фосфорну кислоту (pH 6,0). Готові форми TACI-Ig можна вводити пацієнту в комбінації з іншими лікарськими засобами. Такі лікарські засоби містять у собі, але не обмежуються ними, DMARD, такі як гідроксихлорохін, сульфасалазин, метотрексат, лефлуномід, ритуксимаб, інфликсимаб, азатіоприн, D-пеніциламін, золото (орально або внутрішньом'язово), міноциклін і циклоспорин, кортикостероїди, такі як преднізон, NSAIDS і лікарські засоби для зменшення болю. Способи відповідно до винаходу можуть бути використані в комбінації з іншими способами лікування аутоімунних захворювань. Такі інші способи лікування містять у собі, але не обмежуються ними, хірургію, акупунктуру (голковколювання), фізичну терапію і генну терапію. Готові форми TACI-Ig можуть уводитися до, одночасно або послідовно з іншими способами лікування. Було показано, що TACI-Fc5 інгібує активацію BlyS проліферації B-клітин in vitro. Лікування мишей TACI-Fc5 приводить до часткового блокування розвитку В-клітин, що робить мінімальну дію на попередники B-клітин у кістковому мозку і лінії диференціювання інших клітин, у тому числі Т-клітин периферичної крові, моноцитів і нейтрофілів. Трансгенні миші, отримані генною інженерією, експресують розчинну форму рецептора ТАСІ у крові, продукують менше В-клітин і виявляють зменшені рівні циркулюючого антитіла. ТАСІ-Рс5-трансгенні миші мали нормальні кількості клітин у тимусі, кістковому мозку і мезентеріальному лімфатичному вузлі. Не було значних розходжень у Т-клітинних популяціях у тимусі, лімфатичному вузлі і селезінці (Gross et al. Immunity 2001; 15(2): 289-302). Крім того, TACI-Ig може інгібувати антигенспецифічне продукування антитіл в імунній реакції в мишей, незалежно від того, чи вводять його під час первинної реакції або вторинної реакції на антиген. У вказаних дослідженнях не спостерігали Т-клітинної реакції на антигенну стимуляцію ex vivo. У моделі системного червоного вовчака тварини лікування злитими білками TACI-Ig було ефективним в обмеженні появи і прогресування вказаного захворювання (Gross et al. Nature 2000; 404: 995-999). Подібним чином, у рамках мишачої моделі індукованого колагеном артриту TACI-Ig був здатний інгібувати розвиток колагенспецифічних антитіл і зменшувати як частоту виникнення запалення, так і коефіцієнт появи захворювання (Gross et al. Immunity 2001; 15(2): 289-302). Композицію, що містить злиту молекулу TACI-Ig, можна вводити пацієнту один раз або багаторазово протягом деякого періоду. Наприклад, пацієнт може одержувати одну підшкірну ін'єкцію молекул TACI-Ig, після якої його або її стан може бути підданий моніторингу. Пацієнтам, у яких спостерігається поліпшення або щонайменше стабілізація їхнього стану, злиту молекулу TACI-Ig можна вводити багаторазово протягом додаткового періоду. Додатковий період може складати від приблизно 2 тижнів до приблизно 30 тижнів. Наприклад, пацієнту можна вводити три дози злитої молекули TACI-Ig під час чотиритижневого інтервалу. Альтернативно, пацієнту можна водити додатково сім доз злитої молекули TACI-Ig під час дванадцятитижневого інтервалу. Введення молекул TACI-Ig пацієнту може виконуватися один раз на день, один раз на два дні, один раз на тиждень, один раз надва тижні, один раз на місяць, один раз на два місяці і т. д. Злиту молекулу TACI-Ig вводять пацієнту в кількості, ефективній для лікування стану пацієнта. В одному варіанті здійснення термін "лікування" відносно конкретного захворювання або порушення містить у собі, але не обмежується ними, інгібування вказаного захворювання або порушення, наприклад, зупинку розвитку вказаного захворювання або порушення; послаблення вказаного захворювання або порушення, наприклад, індукцію регресу вказаного захворювання або порушення; або послаблення стану, який викликається або походить з вказаного порушення або захворювання, наприклад, послаблення, попередження або лікування симптомів вказаного захворювання або порушення. В іншому варіанті здійснення вказана кількість може складати від 0,01 мг на 1 кг маси тіла пацієнта до 10 мг на 1 кг маси тіла пацієнта. Оптимальна доза для лікування злитою молекулою TACI-Ig може бути отримана з використанням діаграми фіг. 1, описаної більш докладно в прикладі 5. Злита молекула TACI-Ig може доставлятися будь-яким придатним способом. В одному варіанті здійснення вказану молекулу доставляють перитонеальною ін'єкцією. В іншому варіанті здійснення вказана перитонеальна ін'єкція виконується через підшкірну ін'єкцію. В іншому варіанті здійснення перитонеальну ін'єкцію вводять у передню черевну стінку. При необхідності більше однієї ін'єкції для введення дози вказані ін'єкції можуть уводитися на відстані декількох 4 UA 98462 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сантиметрів і відносно близько по часу, наприклад, так близько, як це здається прийнятним. Для багаторазового введення лікарського засобу місце введення на передній черевній стінці може змінюватися по черзі або чергуватися. Зразкові зони для підшкірної ін'єкції в передню черевну стінку зображені на фіг. 2 і містять у собі праву верхню зовнішню зону, праву нижню зовнішню зону, ліву верхню зовнішню зону, середню нижню зону, а також праве і ліве стегна і плечі (фіг. 2). Альтернативно, злита молекула TACI-Ig даного винаходу може доставлятися через внутрішньовенні ін'єкції або орально у формі таблеток, капсул, рідких композицій або гелів і т. д. Приклад 1 Тестування фармакології, токсикології і фармакокінетики TACI-Fc5 в експериментальній моделі тварини TACI-Fc5 оцінювали в моделі резистентності (опірності) хазяїна для прямої оцінки функціонального потенціалу імунної системи. Мишей стимулювали вірусом грипу під час лікування TACI-Fc5. Дексаметазон, використовуваний як позитивний контроль, приводив до посиленої і пролонгованої вірусної інфекції. Введення однократної дози TACI-Fc5 підшкірним (SC) способом зменшувало здатність тварин виводити вказану вірусну інфекцію. Основні дослідження безпеки фармакології показали, що TACI-Fc5 не індукував великих змін нервової, дихальної і серцево-судинної систем у мишах або мавпах до SC-дози 80 мг/кг. Тільки в мишей спостерігали злегка збільшену гіперпильність і локомоторну активність, що припускають малу і транзиторну (минущу) стимулюючу дію, при 80 мг/кг, причому рівень дії, що не спостерігається, (NOEL) дорівнював 20 мг/кг. При введенні мишам у вигляді однократної дози внутрішньовенним (IV) або підшкірним (SC) способом TACI-Fc5 не індукував смертність або видимі загальні або локальні патологічні дії у тварин до найвищої технічно можливої дози: 1200 мг/кг. Введення мавпам TACI-Fc5 у вигляді однократної дози SC-способом при рівні дози 240 мг/кг не привів до смертності або до яких-небудь великих токсичних дій. На підставі результатів, отриманих після 2 або 4 тижнів введення TACI-Fc5 підшкірним способом мишам при дозах 5, 20 і 80 мг/кг/кожний другий день, можна було зробити висновок, що вказана сполука гарно переносилася у вказаному вигляді при дозах до 80 мг/кг. При всіх дозах були виявлені пов'язані з лікуванням модифікації, які обмежуються імунною системою. Вказані зміни містять у собі зменшення в загальних кількостях B-клітин і кількостях зрілих Bклітин і рівнях сироваткових IgG і IgM. Імуногістохімічні тести, виконувані в селезінці і лімфатичних вузлах, підтверджували виснаження, обмежене B-клітинами, причому кількість Тклітин є незміненою. Усі вказані зміни, пов'язані з часом і дозою в деяких випадках, розглядали як зайво збільшені фармакологічні дії, очікувані в чутливих видах після введення дуже високих доз TACI-Fc5. У загальному і цілому, вказані дії спостерігали після 2 і 4 тижнів лікування без великих ознак прогресування в часі. Очевидно, вони були майже цілком оборотними після 4 тижнів після припинення лікування, за винятком зменшених кількостей В-клітин. Для з'ясування оборотності модуляції B-клітин додаткове дослідження на мишах проводили при дозах 5 і 20 мг/кг протягом 4 тижнів кожний другий день, з більш тривалими періодами відновлення. Нормалізація загальних і зрілих циркулюючих B-клітин досягалася після двох місяців після припинення лікування при 5 мг/кг, і після 4 місяців при 20 мг/кг. Крім того, вказана ін'єкція індукувава слабке збільшення, у порівнянні з контролями-носіями, запальних змін у місцях ін'єкцій при всіх дозах. Підшкірне введення TACI-Fc5 у мавп не індукувало основних ознак токсичності при будь-якій з випробуваних доз: 5, 20 або 80 мг/кг/кожний третій день при введенні протягом 4 послідовних тижнів. Локальну переносимість вважали задовільною до найвищої випробуваної дози і при найвищій випробуваній дозі. Індукувались залежні від дози й оборотні легкі або помірні зміни запального походження (в основному інфільтрати периваскулярних моноклональних і еозинофільних клітин), але автори вважали, що вказані зміни пов'язані з локальною присутністю екзогенних білків. Тільки при високій дозі декілька тварин виявляли слабке або помірне підгостре запалення, асоційоване з утворенням кіст в одному з них. Спостерігали зменшення кількості циркулюючих B-клітин при визначеннях субпопуляцій лімфоцитів, а також гістологічне виснаження маргінальної фолікулярної зони селезінки (відомої як зона, залежна від В-клітин) і зменшення загальних рівнів IgG і IgM у сироватці. Вони розглядалися як результат фармакологічних властивостей TACI-Fc5, як показано фармакологічними експериментами in vitro і in vivo. Їхній степінь був надлишково збільшений, як і очікувалося, у дослідженнях токсикології, у яких тваринам цілеспрямовано уводили високі дози тест-сполуки. Хоча низькі сироваткові рівні IgG і IgM і виснаження лімфоцитів селезінки виявляли явну тенденцію в напрямку нормалізації в межах одного місяця, що допускається, 5 UA 98462 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 після припинення лікування, загальні і зрілі циркулюючі B-клітини не виявляли подібної поведінки, що вказувало на необхідність більш тривалого часу для нормалізації. Наприкінці періоду лікування (тиждень 4) самці і самки групи з високою дозою (80 мг/кг) виявляли слабке, але статистично значиме зменшення середніх величин загального білка в порівнянні з контролями. Слабку тенденцію в напрямку зменшення спостерігали також при тій же самій дозі при тижні 2 і наприкінці періоду відновлення. Модифікації білка сироватки в самках з високою дозою наприкінці періоду введення доз містять у собі зменшення глобуліну і збільшення відсотка альбуміну і фракції альфа-1глобуліну. Фракція альфа-1-глобуліну була також більш високою, ніж контролі в самках групи 3 (20 мг/кг). Імуногенність TACI-Fc5 була низькою як у мишей (тільки декілька самок виявляли рівні циркулюючих зв'язувальних антитіл під час і після періоду лікування), так і у мавп (низькі рівні виявляли після періоду відновлення в невеликому числі тварин); у жодному з видів не виявляли нейтралізуючих антитіл. TACI-Fc5 випробували з використанням стандартного набору тестів in vivo для детектування токсикології репродукції і фертильності (тест фертильності на самцях і самках мишей, оброблених SC-способом при дозах 5, 20 і 80 мг/кг/кожен 2-ий день до і під час спаровування і до періоду імплантації) і ембріофетального розвитку (ембріофетального розвитку в самках мишей і кроликів, оброблених SC-способом при дозах 5, 20 і 80 мг/кг/кожен 2-ий день під час періоду органогенезу). Тест фертильності в мишах показав залежне від дози збільшення пре- і постімлантаційних втрат після піддавання дії 20 і 80 мг/кг/кожен 2-ий день ТАСІ-Fc5 у порівнянні з контрольною групою. Оцінка даних, отриманих у мишей ембріофетального розвитку, показав, що не спостерігалися токсичні для ембріона дії при будь-якій дозі і не індукувались зв'язані зі сполукою пороки розвитку плоду. У кроликів дослідження ембріофетального розвитку показало, що лікування викликало залежне від дози більш низьке збільшення маси і більш низьке споживання корму у вагітних тварин, оброблених 20 або 80 мг/кг/кожен 2-ий день. Вищеописані материнські зміни були асоційовані зі збільшеною швидкістю резорбцій і більш низькою масою тіла плоду при вказаних двох більш високих дозах. Отримані результати припускають можливу дію TACI-Fc5 на імплантацію мишачої бластоцисти в матку. Дії TACI-Fc5, що спостерігаються, на збільшення материнської маси і споживання корму були, очевидно, відповідальними за дії, що спостерігаються, на життєздатність калу в кроликів, які піддаються дії 20 або 80 мг/кг/кожен 2-ий день під час органогенезу, і за те, що не було прямої токсичності TACI-Fc5 відносно плоду. Не було пороків розвитку, пов'язаних з лікуванням ТАСІ-Fc5, у вказаних двох видах тварин. Крім того, гістологічне дослідження чоловічих і жіночих гонад і допоміжних статевих органів проводили в 2-тижневих і 1-місячних дослідженнях токсичності, при SC-способі в мишей і мавп, у яких TACI-Fc5 уводили кожен 2-ий або кожен 3-ій день, відповідно, без одержання пов'язаних з лікуванням дій. Дослідження локальної переносимості в кроликів показало, що композиція TACI-Fc5 добре переносилася локально при ін'єкції підшкірним способом кроликам, при дозі 70 мг/мл. Фармакокінетичне дослідження з однократною дозою в самців мишей при введенні IV і SC проводили в мишей або внутрішньовенним способом при дозі 1 мг/кг, або підшкірним способом при дозах 1, 5 і 15 мг/кг. Час до максимальної абсорбції (tмакс) був визначений між 4 годинами і 16 годинами, причому було розраховано, що величина t1/2 дорівнювала 40-50 годин. Спостерігали подібний до інфузії профіль під час перших 30 хвилин після IV-болюсного введення, після чого TACI-Fc5 елімінувався з тіла з напівперіодом елімінації 44 години. Після підшкірного введення відношення між AUC (площі під кривою), отриманою при 3 дозах 1, 5 і 15 мг/кг, було 1:5:8 у порівнянні з відношенням доз 1:5:15, що припускає втрату дозової пропорційності при високій дозі. Біодоступність TACI-Fc5 у мишей при підшкірному способі введення дорівнювала 76 і 89 % при дозах 1 і 5 мг/кг, але була більш низкою, ніж очікувалося, при 15 мг/кг (0,42; як розраховано проти внутрішньовенної дози 1 мг/кг). Оскільки видимий напівперіод елімінації не змінювався, більш низька біодоступність, що спостерігається при вказаній високій дозі, могла б пояснюватися збільшенням як кліренсу, так і об'єму розподілу або більш ймовірно зменшеною абсорбцією внаслідок утворення відкладення в місці ін'єкції. 6 UA 98462 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фармацевтичне дослідження з однократною дозою в самців мавп при введенні IV і SC проводили в самців собакоподібних мавп, ін'єктованих або внутрішньовенним способом при дозі 1 мг/кг, або підшкірним способом при дозах 1, 5 і 15 мг/кг. Шість самців мавп розподіляли на 2 групи з 3 тварин кожна, і вони одержували 2 введення, розділених 2-тижневим періодом вимивання. Обробками періоду 1 були 1 мг/кг IV (група 1) і 1 мг/кг SC (група 2) і обробками періоду 2 були 5 мг/кг SC (група 1) і 15 мг/кг (група 2). Час до максимальної абсорбції (tмакс) був визначений між 6 годинами і 8 годинами, причому було розраховано, що величина tm дорівнювала приблизно 120-190 годин. Спостерігали подібний до інфузії профіль у 2 з 3 мавп під час перших 15 хвилин після IVболюсного введення, після чого TACI-Fc5 елімінувався з тіла з напівперіодом елімінації 179±29 годин. Об'єм розподілу в стаціонарному стані, Vss, дорівнював 382±82 мл/кг, тобто об'єму, близькому до внутрішньоклітинного об'єму рідини. Після підшкірного введення пропорційність AUC щодо дози була хорошою, тобто 216, 1182 і 2732 ч мкг/мл для доз SC 1, 5 і 15 мг/кг. Біодоступність TACI-Fc5 при підшкірному способі (розрахована щодо дози IV 1 мг/кг) дорівнювала 0,92, 1,02 і 0,77 при низькій, проміжній і високій дозах. Таким чином, TACI-Fc5 майже повністю абсорбувався підшкірним способом. Низькі рівні TACI-Fc5 виявляли в пробах перед введенням доз протягом періоду 2 (між дозами 1 мг/кг за допомогою IV- або SC-способів, період 1, і дозами 5 або 15 мг/кг, відповідно, у періоді 2) для всіх шести мавп, тому що під час 2-тижневого періоду вимивання минали тільки 2 періоди напіввиведення, що є недостатнім для повної елімінації введеної сполуки (яка вимагає 5 періодів напіввиведення). Однак, вдалося оцінити, що внесок AUC ранньої дози представляв тільки приблизно 2 % загальної AUC у періоді 2. Рівні IgG у сироватці показали зменшення 10,2 % після IV-введення доз. Доза 15 мг/кг SC показала злегка більш високу дію, хоча не спостерігали розходжень між дозами 1 і 5 мг/кг (зменшення 8,6 %, 8,4 % і 12,3 % після доз 1, 5 і 15 мг/кг, відповідно). Рівні IgM у сироватці показали зменшення 18,0 % після IV-введення доз. Не спостерігали розходжень між 3 дозами SC (зменшення 23,5 %, 23,0 % і 24,2 % після доз 1, 5 і 15 мг/кг, відповідно). Приклад 2 Визначення переносимої дози TACI-Fc5 у здорових волонтерів В даний час завершується перше дослідження фази І TACI-Fc5. Це подвійне сліпе, контрольоване плацебо, яке проводиться з ескалацією доз дослідження для визначення безпеки, фармакокінетики і фармакодинаміки однократних доз ТАСІ-Fc5, що вводяться підшкірно здоровим волонтерам чоловічої статі. Нижче представлений опис плану дослідження разом з підсумовуванням доступних даних. TACI-Fc5 вводили здоровим волонтерам у подвійному сліпому, контрольованому плацебо, яке проводиться з ескалацією доз дослідженні для визначення безпеки, фармакокінетики і фармакодинаміки однократних доз ТАСІ-Fc5, що вводяться підшкірно здоровим волонтерам чоловічої статі. У дослідження були включені чотири групи суб'єктів. У кожній групі введення доз один суб'єкт був рандомізований для одержання ін'єкції плацебо, причому всі інші одержували TACIFc5. Після виписки з місця дослідження при 24 годинах після введення дози суб'єкти приходили на прийом як амбулаторні хворі протягом семи тижнів запланованих обстежень. Системну і локальну переносимість TACI-Fc5 піддавали моніторингу відносно показників фізичного обстеження, болю в місці ін'єкції, реакцій локальної переносимості в місці ін'єкції (ін'єкцій) (почервоніння, набрякання, гематом і свербежу), показників життєво важливих функцій, ЕКГ (електрокардіограм) з 12 відведеннями, лабораторних оцінок безпеки і реєстрації шкідливих побічних дій. Фармакокінетичні і фармакодинамічні маркери піддавали моніторингу протягом семитижневого періоду після введення доз. Фармакодинамічну дію ТАСІ-Fc5 піддавали моніторингу з використанням ряду маркерів, що включають у себе: субпопуляції лімфоцитів за допомогою FACS-аналізу (плазматичні клітини (CD138+), незрілі B-клітини (CD19+, IgD-), зрілі Bклітини (CD19+, IgD+), T-хелперні клітини (CD5+, CD4+), цитотоксичні Т-клітини (CD5+, CD8+), загальні Т-клітини (CD5+), вільний BlyS, комплекс BlyS/TACI-Fc5, IgG, IgM, aHTH-TACI-Fc5антитіла. Ескалація (збільшення) доз визначалася алгоритмом у протоколі дослідження на основі огляду даних через три тижні після введення доз. Використовували чотири групи введення доз: група 1 одержувала 2,1 мг; група 2 одержувала 70 мг; група 3 одержувала 210 мг, і група 4 одержувала 630 мг. Результати: здоровим волонтерам чоловічої статі вводили однократні підшкірні дози TACIFc5 при дозах від 0,03 мг/кг до 9 мг/кг. Дані безпеки і переносимості використовували разом з 7 UA 98462 C2 аналізом FACS субпопуляцій лімфоцитів при тижні 3 для орієнтації ескалації доз між когортами. Досліджували чотири когорти, як показано в таблиці 1. Таблиця 1 Розподіл волонтерів Номер когорти 1 2 3 4 Кількість волонтерів 6 6 6 d 5 с Рівень дози b 0,03 мг/кг 1 мг/кг 3 мг/кг 9 мг/кг Уведена доза 2,1 мг 70 мг 210 мг 630 мг а а При кожному рівні дози передбачалася номінальна маса 70 кг, причому суб'єкти одержували стандартизовану дозу. b Внаслідок помилки розведення доза, введена когорті 1, була в 10 разів більш низькою, ніж це було заплановано (0,3 мг/кг). Вказана помилка була виявлена після розгляду фармакокінетичних даних з когорти 1, але після введення доз когорти 2. с У тому числі 1 суб'єкт, що одержує плацебо. d Один волонтер припинив прийом доз перед ін'єкцією. 5 Демографічні фонові характеристики підсумовані для вказаної популяції по когортах і представлені в цілому, і показані в таблиці 2. Таблиця 2 Демографічні характеристики Характеристика Статистика Вік (роки) n Середнє (SD) Діапазон Індекс маси n 2 тіла (кг/м ) Середнє (SD) Діапазон Зріст (м) n Середнє (SD) Діапазон Маса (кг) n Середнє (SD) Діапазон Стать n (%) n Чоловіча Діапазон Раса n (%) n Біла Інша Когорта 1 6 30,2 (7,0) 23-43 6 24,7(1,7) 22,2-26,6 6 1,82(0,04) 1,77-1,88 6 81,7(7,3) 71-91 6 6 (100 %) 0 (0 %) 6 6 (100 %) 0 (0 %) Когорта 2 6 33,0 (7,7) 23-43 6 26,0 (2,0) 23,1-28,9 6 1,80(0,08) 1,71-1,91 6 84,2(12,1) 69-101 6 6 (100 %) 0 (0 %) 6 6 (100 %) 0 (0 %) Когорта 3 6 25,3 (6,8) 19-34 6 24,0 (3,5) 18,7-28 6 1,77 (0,07) 1,67-1,85 6 74,7 (7,6) 67-84 6 6 (100 %) 0 (0 %) 6 6 (100 %) 0 (0 %) Когорта 4 Всього 5 23 35,0 (5,4) 30,7 (7,4) 30-44 19-44 5 23 25,3 (2,8) 24,8 (2,4) 22,3-27,5 18,7-28,9 5 23 1,73 (0,06) 1,78 (0,07) 1,68-1,78 1,67-1,91 5 23 76,2 (9,2) 79,0 (9,4) 63-89 63-101 5 23 5 (100 %) 23 (100 %) 0 (0 %) 0 (0 %) 5 23 5 (100 %) 23 (100 %) 0 (0 %) 0 (0 %) 2 10 У цілому вік (середнє±SD) складав 30,7±7,4 роки, а індекс маси тіла складав 24,8 кг/м . Усі волонтери були білими індивідами чоловічої статі. TACI-Fc5 добре переносився у всіх групах. Не було видимих дій після визначення показників фізичного обстеження, показників життєво важливих функцій або ЕКГ із 12 відведеннями. 8 UA 98462 C2 Таблиця 3 Перелік викликаних лікуванням шкідливих побічних дій, повідомлених до даного часу Система тіла TACIFc5 2,1 мг N 1 Переважний термін Очні порушення Шлунково-кишкові порушення Набряк повік Біль живота верхньої части Діарея Укривання виразками порожнини рота Нудота Блювання Загальні порушення і Подібне до грипу стани місця введення захворювання Інфекції і інвазії Назофарингіт Перианальний абсцес Ушкодження, Контузія інтоксикація і Ушкодження суглобів процедурні ускладнення Порушення м'язево- Артралгія скелетної і сполучної Біль в спині тканин Порушення нервової Головний біль системи Дихальні торакальні і Кашель медіастинальні Закладеність носа порушення Фаринголарингеальний біль Шкірні і підшкірні Загальний сип тканинні порушення 5 10 15 20 Лікування TACI- TACI- TACIПлаFc5 70 Fc5 210 Fc5 630 Всього цебо мг мг мг N N Ν Ν Ν % 1 2,1 1 1 1 2,1 1 2 4,3 1 1 1 3 2 6,4 4,3 2 3 6,4 6 1 1 10,6 2,1 2,1 1 2,1 1 2,1 1 1 2,1 2 1 8 17,0 1 1 1 3 2 6,4 4,3 2 1 7 14,9 1 1 8,5 1 4 4 1 1 1 1 1 1 1 2,1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 2 1 Тимчасове почервоніння і набрякання спостерігали в місці введення в деяких суб'єктів, причому почервоніння спостерігали у всіх суб'єктів у когортах 3 і 4. Хоча частота зустрічальності реакцій місця ін'єкції, очевидно, збільшується в групах більш високих доз, автори вважають, що це пов'язане зі збільшеним обсягом (або числом) ін'єкцій. Сорок вісім (48) виникаючих внаслідок лікування побічних реакцій повідомлялися через сім тижнів після введення доз. Більшість з них (44 реакції, 91,7 %) були слабкими, а інші були помірними (4 реакції, 8,3 %). Не було тяжких побічних реакцій і не було серйозних побічних реакцій під час вказаного періоду. Не було видимого взаємозв'язку між дозами введеного TACIFc5 і частотою зустрічальності, інтенсивністю або визначеним взаємозв'язком шкідливих побічних реакцій. Повідомлені дотепер побічні реакції підсумовані в таблиці 3. Вважається, що TACI-Fc5 показав гарну переносимість при дозах до 630 мг без викликання значних проблем, пов'язаних з безпекою. Отримані дані підтверджують передбачувані дози запропонованих досліджень суб'єктів. Виконували несистемний аналіз концентрацій ТАСІ у сироватці. Вказаний попередній аналіз виконували з використанням номінальних часових точок взяття проб. Суб'єкти 2, 6 і 13 мали вимірні концентрації перед введенням дози, і, отже, фонові концентрації віднімали з усіх вимірювань після введення дози перед аналізом. Фармакокінетичні параметри після однократних підшкірних доз 2,1, 70, 210 і 630 мг підсумовані в таблиці 4. Концентрації лікарських засобів були близькими до межі кількісного визначення вказаного аналізу після дози 2,1 мг TACI-Fc5, обмежуючи цінність даних при вказаному рівні дози. При дозах 70 мг і вище, Тмакс (час до максимальної абсорбції) був в діапазоні 16-36 годин і загальна медіана t1/2 9 UA 98462 C2 (розрахована з термінальної частини вказаної кривої) дорівнювала 303 годин. Крім того, AUC (екстрапольована до нескінченності) і Смакс збільшувалися більше, ніж пропорційно дозі. Таблиця 4 Фармакокінетичні (ФК) параметри Параметр Смакс (мкг/мл) Тмакс (год) t1/2 ((год) AUC (годмкг/мл) %АUС(екстрап.) CL/F (л/год) Смакc (мкг/мл) Тмакс (год) t1/2 ((год) AUC (годмкг/мл) % AUC (екстрап.) CL/F (л/год) Смакс (мкг/мл) Тмакс (год) t1/2 (год) AUC (годмкг/мл) % AUC (екстрап.) CL/F (л/год) Смакc (МКГ/МЛ) Тмакс (год) t1/2 (год) AUC (годмкг/мл) % AUC (екстрап.) CL/F (л/год) 5 10 15 20 25 Обробка 2,1 мг 2,1 мг 2,1 мг 2,1 мг 2,1 мг 2,1 мг 70 мг 70 мг 70 мг 70 мг 70 мг 70 мг 210 мг 210 мг 210 мг 210 мг 210 мг 210 мг 630 мг 630 мг 630 мг 630 мг 630 мг 630 мг n 5 5 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 0,015 204 8,55 36 1,70 0,617 255 79,7 10 0,90 3 429 260 6 0,86 13,9 313 992 2 0,66 0,011 180 9,65 24 1,90 0,236 23 15,7 1 0,17 0,902 160 72 3 0,26 2,79 16 194 0 0,15 Мінімум Медіана Максимум 0,005 0,013 0,032 8 72 336 45 203 365 0,524 6,62 20,4 13 32 69 0,10 1,34 4,01 0,426 0,496 0,985 16 16 36 219 264 276 65,4 72,5 101 9 11 11 0,69 0,97 1,07 1,84 2,90 4,16 12 16 36 169 433 568 167 267 344 1 6 9 0,61 0,79 1,25 11,4 13,7 16,7 16 16 16 291 316 329 719 1040 1170 1 2 2 0,54 0,61 0,88 CV 74 88 113 65 112 38 9 20 12 18 30 37 28 54 31 20 5 20 18 23 Фармакодинамічні аналізи показали зменшення фонових рівнів IgM через 7 тижнів після однократних доз 70, 210 або 630 мг. Хоча не вдалося встановити ясного взаємозв'язку дозавідповідь із пробами малого розміру, ступінь зменшення IgM був найвищим в групі з найвищою дозою. Суб'єкти в групі з дозою 70 мг, виявляють, очевидно, повернення рівнів IgM до фону через сім тижнів після введення дози. Рівні в групах з більш високими дозами залишалися подавленими в вказаній часовій точці. Не було видимих дій на рівні IgG або на субпопуляції лімфоцитів, які вимірювали за допомогою FACS. Було пропорційне збільшення рівнів комплексів BlyS/TACI-Fc5 під час вказаного періоду взяття проб, що досягає плато при приблизно 600 годинах після введення дози. Висновок: дані для людини, отримані на здорових волонтерах чоловічої статі, показали, що TACI-Fc5 є безпечним і добре переноситься суб'єктами при дозах до 630 мг. Характер, частота зустрічальності і тяжкість побічних реакцій були порівнянні між групами обробки TACI-Fc5 і плацебо. Не було клінічно значних змін у показниках фізичного обстеження, показниках життєво важливих функцій, ЕКГ із 12 відведеннями або лабораторних параметрах безпеки. Локальна переносимість у місці введення була доброю. Отримані дані підтримують запропоновані дози в суб'єктах із ВСМ. Після однократних доз у здорових суб'єктів чоловічої статі, TACI-Fc5 досягав Тмакс між 16 і 20 годинами, AUC збільшувалася пропорційним дозі чином, хоча збільшення С макс були більшими, ніж пропорційні дозі показники. Медіанний напівперіод існування TACI-Fc5 дорівнював приблизно 300 годин. Фармакодинамічну дію відзначали на рівнях IgM при дозах 70, 210 і 630 мг. Не було видимої дії лікування на IgG або субпопуляціях лімфоцитів після однократної дози TACI-Fc5. Немає відомих або очікуваних ризиків особливої тяжкості або серйозності, що не були уже враховані в запропонованих протоколах дослідження. Приклад 3 Лікування пацієнтів з RA композиціями TACI-Fc5 10 UA 98462 C2 5 10 15 Пацієнтів з RA клінічно оцінювали перед введенням TACI-Fc5. Оцінки фону визначали як оцінки, виконувані безпосередньо перед першим введенням TACI-Fc5. Перший день введення TACI-Fc5 позначали як "день 1". Наступні процедури виконували перед введенням пацієнту першої дози лікарської терапії TACI-Fc5: ЕКГ; вимірювання показника життєво важливих функцій (VS); фізичне обстеження; оцінка активності захворювання (див. приклад 6); вимірювання зросту і маси (тільки при першій дозі і при візиті під час наступного спостереження); рутинні лабораторні тести (див. таблицю 5); розрахунок відношення гідроксипіридинолін/лізилпіридинолін (HP/LP); фармакокінетичне (ФК) і фармакодинамічне (ФД) вимірювання концентрації вільного TACI-Fc5 і загальної концентрації TACI-Fc5 у сироватці, сироваткових рівнів вільних APRIL і BlyS, комплексу BlyS/TACI-Fc5, вимірювання кількості клітин проточною цитометрією і вимірювання анти-ТАСІ-антитіл (тільки при першій дозі); і вимірювання біомаркерів у крові, що включають у себе субпопуляції лімфоцитів (крові, розподіленої в три пробірки і фенотипованої аналізом FACS відповідно до таблиці 6), IgA, IgM, IgG (у тому числі субтипування), аутоантитіла проти цитрулінованих пептидів, ревматоїдні фактори (IgA-RF, IgMRF, IgG-RF), С-реактивний білок (CRP), TNF-, IFN-, IL-6, IL-1, IL-12 і IL-8. В одній субпопуляції пацієнтів виконують артроскопічно спрямовувану синовіальну біопсію або взяття синовіальної рідини пункцією з використанням голки і виконують оцінки ФК, ФД і оцінки біомаркерів у вказаній синовіальній рідині. У когортах з повторюваними введеннями доз багато які або всі вказані вимірювання виконують безпосередньо перед наступними введеннями TACI-Fc5. 20 Таблиця 5 Рутинні лабораторні параметри Хімія крові -глутамілтрансфераза Аланінтрансаміназа Альбумін Лужна фосфатаза Аспартаттрансаміназа Білірубін - прямий (тільки якщо загальний білірубін поза нормальним діапазоном) Білірубін - загальний Кальцій Креатинін Глюкоза (натщесерце) Неорганічний фосфор Калій Білок - загальний Електрофорез білків Комплемент 3 Натрій 1 Тригліцериди Холестерин Сечовина Сечова кислота Гематологія Гематокрит Гемоглобін Середній гемоглобін клітини МСНС Середній об'єм клітини Кількість тромбоцитів Кількість еритроцитів 2 Кількість лейкоцитів ESR (швидкість осадження еритроцитів) Аналіз сечі pH Лейкоцити Нітрит Глюкоза Кетони 3 Білок 3 Кров Коагуляція Активований частковий тромбопластиновий час Протромбіновий час 1: Пацієнти повинні голодувати протягом приблизно 10 годин перед визначенням тригліцеридів. 2: Кількість лейкоцитів повинна містити в собі визначення лейкоцитарної формули. 3: Якщо присутні білок, еритроцити або лейкоцити (RBC або WBC), повинно виконуватися мікроскопічне дослідження проби. 11 UA 98462 C2 Таблиця 6 Субпопуляції лімфоцитів Пробірка Пробірка 1 Пробірка 2 Пробірка 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 CD45 CD19 CD19 CD3 msIgG CD38 Антигенні маркери CD4 msIgG CD27 CD8 msIgG (контроль) IgD Пробірка 1 % і Ab CD45+/CD3+ (загальні Т-клітини) % і Ab CD45+/CD3+/CD4+/CD8- (Т-хелперні клітини) % і Ab CD45+/CD4-/CD8+ (Т-цитотоксичні/супресорні клітини) Пробірка 3: зворотно розраховані Ab з використанням загальної кількості B-клітин (CD19+) % і Ab CD 19+ (пан-в-клітини) % і Ab CD19+/IgD-/CD27- (незріла B-клітина) "ненавчені" В-клітини % і Ab CD19+/IgD+/CD27- (зріла B-клітина) "ненавчені" В-клітини % і Ab CD19+/CD27+/CD38- (B-клітина пам'яті) % і Ab CD19+/CD27+/CD38+ (секретуючі Ig клітини) Через приблизно шість годин після введення дози, за винятком когорти 6, виконували наступні оцінки: ЕКГ; VS; і взяття проб для ФК і ФД (тільки для когорт з однократною дозою). Лікування з використанням TACI-Fc5 йде за планом когорт із послідовною ескалацією дози, обкресленої на фіг. 1. Перша когорта одержує однократну дозу 70 мг TACI-Fc5 на день 1. Наступні когорти одержують дози на основі алгоритму ескалації дози, до максимальної дози 2940 мг. Друга когорта одержує три дози 70 мг TACI-Fc5 під час одномісячного періоду. Третя когорта одержує однократну дозу 210 мг TACI-Fc5. Четверта когорта одержує три дози 210 мг TACI-Fc5 під час одномісячного періоду. П'ята когорта одержує однократну дозу 630 мг TACIFc5. Шоста когорта одержує сім доз 420 мг TACI-Fc5 під час тримісячного періоду. Оцінки після введення доз, у тому числі збір проб для оцінки ФК, ФД і біомаркерів і безпеки й активності захворювання виконують із усіх когорт при заздалегідь визначених інтервалах до 14 тижнів після введення доз (у когортах з однократною дозою), до 18 тижнів після введення доз (у когортах 2 і 4 з повторюваними дозами) і до 26 тижнів після введення доз (у когорті 6 з повторюваними дозами). Таблиця 7 описує схему оцінки після введення доз, що починається з дня 2, когорт 1, 3 і 5 (когорт з однократними дозами). Таблиця 8 описує схему оцінки після введення доз, що починається з першого дня після кінцевої дози (день 30) когорт 2 і 4. Таблиця 9 описує схему оцінки після введення доз, що починається на день введення другої дози (день 15) когорти 6. Реакції місця ін'єкції, побічні реакції і супутні лікарські засоби і процедури вимірюють протягом вказаного дослідження для всіх когорт. Дані побічних дій одержують при запланованих або незапланованих візитах після фізичного обстеження, на основі інформації, спонтанно забезпечуваної пацієнтом і за допомогою опитування пацієнта. Побічна реакція визначається як будь-яке несприятливе медичне явище у формі ознак, симптомів, ненормальних лабораторних показників або захворювань, що виникають або погіршуються щодо фону (тобто початкового візиту), незалежно від причинного взаємозв'язку і навіть, якщо не вводився досліджуваний продукт. Тяжкість побічної реакції може оцінюватися з використанням наступних визначень: (1) легка - пацієнт знає про побічну реакцію або побічний симптом, але вказана побічна реакція або побічний симптом легко переноситься; (2) помірна (середня) - пацієнт зазнає достатній дискомфорт для того, щоб перешкоджати його або її звичайному рівню активності або зменшувати його або її звичайний рівень активності; (3) тяжка - значне погіршення функціонування, коли вказаний пацієнт нездатний виконувати звичайні активності; і (4) дуже тяжка - життя пацієнта знаходиться в небезпеці внаслідок вказаної побічної реакції. Зв'язок вказаної побічної реакції з уведенням TACI-Fc5 може оцінюватися з використанням наступних визначень: (1) ймовірна - причинний зв'язок є клінічно/біологічно високо ймовірною, і є ймовірна часова послідовність між появою побічної реакції і введенням TACI-Fc5; (2) можлива - причинний зв'язок є клінічно/біологічно ймовірним, і є ймовірна часова послідовність між появою побічної реакції і введенням TACI-Fc5; (3) малоймовірна - причинний зв'язок є неймовірним і інша документована причина вказаної побічної реакції є більш ймовірною; і (4) що не має відношення - причинний зв'язок може бути виразно виключений, і інша документована причина вказаної побічної реакції є найбільш ймовірною. Медичні стани, які присутні при фоні, що не погіршуються по тяжкості або частоті зустрічальності під час введення 12 UA 98462 C2 TACI-Fc5, не вважаються побічними реакціями. Загострення RA розглядається як частина оцінки вказаного захворювання і не вважається побічною реакцією, якщо воно не є або можливо ймовірно пов'язаним із уведенням TACI-Fc5. Таблиця 7 Схема оцінки після введення дози когорт 1, 3 і 5 D2 ЕКГ VS (показник життєво важливої функції) Фізичне обстеження А Фізичне обстеження B ADA C VIS Рутинні лабораторні параметри ESR HP/LP сечі Антитіло проти TACI-Fc5 ФК/ФД Біомаркери Кількість B-клітин (FACS) Пункція голкою Синовіальна біопсія D3-5 X X D29 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X D15 X X X D8 D43 D57 X X X X X X X X X D71 D85-92 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X А: викликане скаргою фізичне обстеження В: ADA = оцінка активності захворювання, виміряна по CRP в сироватці, ESR і відношенню HP/LP в сечі С: VIS = стан вакцинної імунізації. 5 Таблиця 8 Схема оцінки після введення дози когорт 2 і 4 D30 D33 D36 D43 D57 D71 D85 D99 D113119 X ЕКГ X X VS (показник життєво X X X X X важливої функції) Фізичне обстеження X Фізичне обстеження X X X X B ADA X X C VIS X Рутинні лабораторні X X X X X параметри ESR X X X HP/LP сечі X X X Антитіло проти TACI-Fc5 X ФК/ФД X X X X X X X X X Біомаркери X X X X X X X X X Кількість B-клітин X X X X X X (FACS) Синовіальна біопсія X А: викликане скаргою фізичне обстеження В: ADA= оцінка активності захворювання, виміряна по CRP в сироватці, ESR і відношенню HP/LP в сечі С: VIS = стан вакцинної імунізації. 13 UA 98462 C2 Таблиця 9 Схема оцінки після введення дози когорти 6 D15 ЕКГ VS (показник життєво важливої функції) Фізичне обстеження А Фізичне обстеження B ADA C VIS Рутинні лабораторні параметри ESR HP/LP сечі Антитіло проти TACIFc5 ФК/ФД Біомаркери Кількість B-клітин (FACS) Синовіальна біопсія Пункція голкою D29 D43 D57 D71 D85 D86 X D99 D127 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X D165173 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X А: викликане скаргою фізичне обстеження В: ADA = оцінка активності захворювання, виміряна по CRP в сироватці, ESR і відношенню HP/LP в сечі С: VIS = стан вакцинної імунізації 5 10 Доза, схема введення і спосіб введення TACI-Fc5 представлені в таблиці 10. Коротко, у дослідження включені сімдесят два пацієнти з RA чоловічої і жіночої статі у віці між 18 і 70 роками. Вказані пацієнти мають установлений діагноз активного, помірного - тяжкого RA протягом щонайменше 6 місяців, вони не мали успіху при лікуванні не більше, ніж п'ятьма DMARD, і не використовували DMARD, інший, ніж метотрексат, протягом 4 або більше тижнів перед днем 1. Крім того, вказані пацієнти є RF-позитивними і не є вагітними під час дослідження і до 3 місяців після останнього введення TACI-FC5. Вказаних пацієнтів розділяють на 6 когорт. Три з вказаних когорт мають 8 пацієнтів, дві з вказаних когорт мають 12 пацієнтів, і одна когорта має 24 пацієнти. 14 UA 98462 C2 Таблиця 10 Доза і введення TACI-Fc5 Когорта Когорта 1 (однократна доза 70 мг, 8 пацієнтів) Когорта 2 (повторювана доза 3 × 70 мг в 1 місяці, 12 пацієнтів) Когорта 3 (однократна доза 210 мг, 8 пацієнтів) Когорта 4 (повторювана доза 3 × 210 мг в 1 місяці, 12 пацієнтів) Когорта 5 (однократна доза 630 мг, 8 пацієнтів) Когорта 6 (повторювана доза 7 × 420 мг в 3 місяцях, 24 пацієнти) 5 10 15 20 25 30 35 Схема введення доз Спосіб введення 70 мг TACI-Fc5 або відповідного 1 підшкірна ін'єкція 0,5 плацебо на день 1 мл вранці 70 мг або відповідного плацебо в дні 1,15 і 20 1 підшкірна ін'єкція 0,5 мл вранці 210 мг TACI-Fc5 або 1 підшкірна ін'єкція 1,5 відповідного плацебо на день 1 мл вранці 210 мг або відповідного плацебо 1 підшкірна ін'єкція 1,5 в дні 1, 15 і 20 мл вранці 630 мг TACI-Fc5 або 3 підшкірні ін'єкції 1,5 відповідного плацебо на день 1 мл вранці 420 мг або відповідного плацебо 2 підшкірні ін'єкції 1,5 в дні 1, 15,29,43,57,71 і 85 мл вранці Приклад 4 Процедура ін'єкції TACI-Fc5 Якщо вибирають підшкірний спосіб введення для доставки TACI-Fc5, то вказану молекулу ін'єктують підшкірно в черевну стінку, і місця чергують відповідно до діаграми нижче (фіг. 2). Дотримується обережність, щоб не відбулася ін'єкція в кровоносну судину. Украй важливо чергувати місця введення для збереження здорової шкіри. Повторювані ін'єкції в те саме місце можуть викликати рубцювання і затвердіння жирової тканини. Наступні зони повинні використовуватися для ін'єкції і чергуватися в такий спосіб (фіг. 2): перша ін'єкція в ліву верхню зовнішню зону (фіг. 2, положення 1); друга ін'єкція в праву нижню зовнішню зону (фіг. 2, положення 2); третя ін'єкція в ліву нижню зовнішню зону (фіг. 2, положення 4) і п'ята ін'єкція в середню нижню зону (фіг. 2, положення 5). Вищезгадана схема чергування повторюється для додаткових ін'єкцій. Для пацієнтів, які потребують більше однієї ін'єкції на дозу, ін'єкція починається в положенні дванадцяти годин для зони місця, позначеного для вказаної ін'єкції (як на фіг. 2, місця 1-5), і вони чергуються послідовно за годинниковою стрілкою, положення 2 годин, 4 годин, 6 годин, 8 годин і/або 10 годин у міру необхідності для необхідної кількості ін'єкцій на дозу. Ін'єкції повинні знаходитися на відстані щонайменше 2,5 см (1 дюйми) одна від одної і ін'єктуватися якнайближче в часі. Не допускається ін'єкція більше 1,5 мл в одне місце ін'єкції. Якщо пацієнт зазнає труднощів з ін'єкціями в живіт, іншими зонами, що можуть бути ін'єктовані, є передні частини стегон і плечі. Звичайні симптоми реакцій місць ін'єкції містять у собі свербіж, хворобливість, місцеве підвищення температури і/або почервоніння в місці ін'єкції. Приклад 5 Протокол ескалації дози для введення молекули TACI-Fc5 Даний протокол ескалації дози для оцінки TACI-Fc5 у RA дозволяє вводити дози шістьом пацієнтам у першій когорті. Перша когорта одержує однократну дозу 70 мг із наступними 4 тижнями спостереження. Safety Review Board (SRB) розглядає дані по безпеці, зібрані протягом чотирьох тижнів після введення дози, і в рекомендації SRB, вказана доза збільшується до 210 мг, що вводяться протягом 1 місяця (друга когорта) або у вигляді однократної дози (третя когорта). Дев'ятьом пацієнтам уводять дозу в другій когорті і шести пацієнтам уводять дозу в третій когорті. Потім SRB розглядає дані по безпеці, зібрані з третьої когорти через сім тижнів після введення дози, і в рекомендації SRJB, вказана доза збільшується до 630 мг, що вводяться протягом 1 місяця (четверта когорта) або у вигляді однократної дози (п'ята когорта). Дев'ятьом пацієнтам уводять дозу в четвертій когорті і шести пацієнтам уводять дозу в п'ятій когорті. Потім SRB розглядає дані по безпеці, зібрані з п'ятої когорти через шість тижнів після введення дози, і в рекомендації SRB, когорта шість одержує 2940 мг протягом 3-місячного періоду. Вісімнадцятьом пацієнтам уводять дозу в шостій когорті. 15 UA 98462 C2 510 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Вибрані дози основані раціонально на повторюваних дослідженнях SC-токсикології в собакоподібних мавп і мишей, що показали, що TACI-Fc5 добре переносився при 5, 20 і 80 мг/кг. Крім дій на імунні клітини, які є очікуваними результатами фармакодинамічної активності TACIFc5, єдиними показниками були значне зменшення загального білка плазми і легка підшкірна реакція з найвищою дозою SC 80 мг/кг у мавп і тимчасова (минуща) гіперактивність у тесті Ірвіна в мишей при дозі 80 мг/кг. Таким чином, 20 мг/кг є найвищою дозою, не асоційованою з побічними реакціями в обох видах. Крім того, дози 2, 1, 70, 210 і 630 мг вводили у вигляді однократних підшкірних доз здоровим волонтерам. Не було проблем відносно безпеки або переносимості, індукованих при вказаних дозах. На підставі преклінічних даних і попередніх результатів у здорових волонтерів доза 70 мг була вибрана як придатна початкова доза для пацієнтів з RA. Дози і схеми введення доз, передбачені в пацієнтів з RA у даному дослідженні, знаходяться в діапазоні від 1 мг/кг до 9 мг/кг два рази на місяць (при нормалізації для суб'єкта з масою тіла 70 кг), що добре узгоджується з діапазоном доз, дослідженим у мавп. Повторюване введення в мавп показало залежність доза-реакція. Приклад 6 Оцінка прогресування захворювання Прогресування захворювання вимірюють по оцінці активності захворювання, глобальній оцінці лікарем активності захворювання, глобальній оцінці пацієнтом активності захворювання, ранкової малорухливості й оцінці пацієнтом болю, активності захворювання і фізичної функції. Оцінка активності захворювання (DAS) є комбінованим індексом, який був розвинений для вимірювання активності захворювання в пацієнтів з RA. Він був екстенсивно валідизований для його застосування в клінічних дослідженнях у комбінації з критеріями реакції EULAR (Європейської ліги ревматологів). Вихідний DAS містив у собі суглобовий індекс Рітчі, число опухлих суглобів 44, оцінку швидкості осадження еритроцитів (ESR) і загального здоров'я на VAS. Після валідизації числа 28 для неранжованих чисел суглобів відносно хворобливості і набрякання, був розроблений DAS28, що включає в себе числа суглобів 28. Результати DAS і DAS28 не є безпосередньо взаємозамінними. З використанням DAS були розроблені декілька порогів для високої активності захворювання, низької активності захворювання або навіть ремісії. Крім того, були розроблені критерії реакції на основі DAS, так що, коли DAS пацієнта вимірюють у двох часових точках, може бути оцінена клінічна реакція. Змінними показниками захворювання, необхідними для розрахунку DAS28, є: число опухлих суглобів (28 суглобів); число хворобливих суглобів (28 суглобів); ESR (мм після 1 години); загальне здоров'я пацієнтів (GH) або глобальна активність захворювання (візуальна шкала аналогів (VAS) 100 мм) - у даному дослідженні, названому глобальною оцінкою активності захворювання пацієнтом. Оцінки двадцяти восьми хворобливих і опухлих суглобів містять у собі наступні суглоби: плечі, лікті, кисті, зап'ястно-фалангові суглоби, проксимальні міжфалангові суглоби і коліна. Для розрахунку DAS використовують наступну формулу: GАS28=0,56*sgrt(хворобливі28)+0,28*sgrt(опухлі28)+0,70+In(ЕSR)+0,014*GН Вказаний DAS забезпечує число на шкалі від 0 до 10, що вказує існуючу активність ревматоїдного артриту. DAS28 вище 5,1 означає високу активність захворювання, a DAS28 нижче 3,2 означає низьку активність захворювання. Ремісія досягається, коли DAS28 нижче 2,6. За допомогою порівняння DAS28 з одного пацієнта в двох різних часових точках можна визначити поліпшення або реакцію. Оцінка болю пацієнтом і глобальна оцінка активності захворювання пацієнтом виконуються з використанням горизонтальної візуальної шкали аналогів (VAS). Глобальна оцінка лікарем активності захворювання вимірює наявну активність захворювання пацієнта з використанням 5-бальної східчастої шкали (шкали Лікерта), де 0 = безсимптомне, 1 = слабке, 2 = помірне, 3 = тяжке і 4 = дуже тяжке. Оцінка пацієнтом фізичної функції вимірюється на основі реакції пацієнта на опитувач для оцінки стану здоров'я і якості життя (HAQ), що задає питання пацієнту відносно здатності пацієнта протягом попереднього тижня виконувати повсякденні задачі, такі як вдягання і догляд за собою, прийом їжі, ходьба (гуляння), і відносно того, потрібно пацієнту або допомога (допоміжні засоби) або оснащення для виконання якої-небудь з вищезгаданих задач. Присутність ранкової малорухливості оцінюється за допомогою бесіди з пацієнтом, і, якщо вона є, реєструється її тривалість. 16 UA 98462 C2 17 UA 98462 C2 18 UA 98462 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1. Спосіб лікування ревматоїдного артриту в пацієнта, який передбачає введення пацієнту композиції, що містить злиту молекулу, яка містить: (і) позаклітинний домен TACI або його фрагмент, який зв'язує BlyS; і (ii) константний домен імуноглобуліну людини, де вказану композицію вводять у кількості від 0,01 до 10 мг/кг маси тіла пацієнта, і де вказану композицію вводять у вказаній кількості: (і) 7 разів протягом дванадцятитижневого інтервалу; або (іi) 3 рази протягом чотиритижневого інтервалу; або (іii) кожний другий тиждень протягом 2-30 тижнів; або (іv) один раз на тиждень. 2. Спосіб за п. 1, де вказаний позаклітинний домен TACI або його фрагмент має амінокислотну послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну амінокислотам 30-110 амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 1. 3. Спосіб за п. 1, де вказаний позаклітинний домен TACI або його фрагмент має амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 % ідентичну амінокислотам 30-110 амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 1. 4. Спосіб за п. 1, де вказаний позаклітинний домен TACI або його фрагмент має амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 % ідентичну амінокислотам 30-110 амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 1. 5. Спосіб за п. 1, де вказаний позаклітинний домен TACI або його фрагмент має амінокислотну послідовність, щонайменше на 99 % ідентичну амінокислотам 30-110 амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 1. 6. Спосіб за п. 1, де вказаний позаклітинний домен TACI або його фрагмент включає амінокислоти 30-110 амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 1. 7. Спосіб за п. 1, де вказаний позаклітинний домен TACI або його фрагмент складається з амінокислот 30-110 амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 1. 8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, де вказаний константний домен імуноглобуліну включає модифіковану Fc-частину IgG людини, і вказана злита молекула переважно являє собою злиту молекулу TACI-Fc5. 9. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, де вказану композицію вводять у вказаній кількості 7 разів протягом дванадцятитижневого інтервалу. 10. Спосіб за п. 9, де вказану композицію вводять у вказаній кількості 7 разів протягом дванадцятитижневого інтервалу, з подальшими додатковими введеннями вказаної композиції у вказаній кількості. 11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, де вказану композицію вводять у вказаній кількості 3 рази протягом чотиритижневого інтервалу. 12. Спосіб за п. 11, де вказану композицію вводять у вказаній кількості 3 рази протягом чотиритижневого інтервалу, з подальшими додатковими введеннями вказаної композиції у вказаній кількості. 13. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, де вказану композицію вводять у вказаній кількості кожний другий тиждень протягом 2-30 тижнів. 14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, де вказану композицію вводять у вказаній кількості один раз на тиждень. 15. Спосіб за будь-яким з пп. 1-14, що додатково передбачає одночасне введення пацієнту другого лікарського засобу. 16. Спосіб за п. 15, де вказаний другий лікарський засіб вибраний із групи, яка складається з гідроксихлорохіну, сульфасалазину, метотрексату, лефлуноміду, ритуксимабу, інфліксимабу, азатіоприну, D-пеніциламіну, золота (перорально або внутрішньом'язово), міноцикліну, 19 UA 98462 C2 5 циклоспорину, кортикостероїду, нестероїдного протизапального лікарського засобу (NSAIDS), цитокіну, антицитокіну й інтерферону. 17. Спосіб за будь-яким з пп. 1-16, де вказану композицію вводять підшкірно, орально або внутрішньовенно. 18. Спосіб за будь-яким з пп. 1-17, де пацієнтом є людина. 20 UA 98462 C2 Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 21