Вакцина, що містить генетичні варіанти парвовірусу собак

Реферат: Винахід належить до вакцини проти парвовірусу собак і діагностичних засобів. Вакцини ефективні проти домінантних варіантів парвовірусу собак, що з часом з'являються. UA 102999 C2 (12) UA 102999 C2 UA 102999 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ Дана заявка включає як список послідовностей повний зміст супровідного текстового файлу "Sequence.txt", створеного 12 червня 2008 р. (об'єм якого становить 3780 байтів), включеного в даний опис шляхом посилання. ОПИС ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ Галузь техніки, до якої належить винахід Винахід у цілому стосується поліпшених складів вакцини проти парвовірусу собак (CPV) і діагностичних тестів. Зокрема, винахід стосується поліпшених композицій вакцини проти CPV і діагностичних тестів, що містять недавно виявлені домінантні варіанти CPV, які циркулюють у популяціях собак у цей час. Передумови винаходу Парвовірус собак (CPV) переважно є шлунково-кишковим патогеном, що вражає собак, особливо щенят. Парвовірусна інфекція характеризується гострою діареєю, лихоманкою й лейкопенією в собак і щенят старше 4-5 тижнів, і поразкою міокарда в щенят у віці менше 4-5 тижнів. Рівень смертності в невакцинованих тварин вкрай високий. Незважаючи на існування вакцин проти CPV, через те, що CPV є одноланцюжковим ДНК-вірусом і мутує з дуже високою швидкістю, він має незвичайну здатність до антигенної мінливості, і тим самим ухиляється від впливу імунного захисту, що забезпечують вакцини. Таким чином, необхідний постійний моніторинг антигенного типу й генотипу збудника. Уперше CPV був виділений в 1978 році й був названий "CPV-2" для відмінності його від парвовірусу - "хвилинного вірусу" собак (CMV або CPV-1). У цілому думають, що CPV-2 являє собою генетичний варіант вірусу панлейкопенії кішок (FPV) або вірусу ентерита норок (MEV) і він генетично й антигенно дуже близький до парвовірусів, що інфікують норок, лис, єнотів і інших хижаків. Капсид CPV містить одноланцюжковий ДНК-геном довжиною близько 5200 основ, що має тільки дві відкриті рамки зчитування, хоча вони кодують щонайменше чотири білки завдяки альтернативному сплайсингу мРНК. Капсид білка утворюють два вірусних білки (VP), VP1 і VP2, причому VP2 є основним імуногенним білком капсида вірусу. Генетичний варіант вихідного ізоляту CPV був ідентифікований в 1979-1980 роках і названий CPV, тип 2а. У середині 1980-х років був ідентифікований ще один варіант, тип 2b, і із цього часу, типи 2а й 2b, очевидно, повністю витиснули вихідний CPV-2. Існуючі на сьогоднішній день вакцини спрямовані тільки на варіанти 2а й 2b, хоча варіант 2b більше не зустрічається в Сполучених Штатах. Огляд відкриття й еволюції CPV запропонований у статті Parrish and Kawaoka, 2005. CPV-2b відрізняється від CPV-2a двома положеннями амінокислот: Asn-426 в 2a (кодується AAT) замінений на Asp в 2b (кодується GAT), а Ile-555 в 2a замінений на Val в 2b. Заміна Ile-555 на Val насправді є поверненням до послідовності вихідного 2 типу. Антигенні типи CPV-2a і 2b, очевидно, залишалися відносно стабільними протягом ряду років. Однак в 2000 р. був описаний варіант "2с", в якому в положенні 426 знаходиться Glu, кодований GAA (у положенні 555 знаходиться Val). Варіант 2с був виявлений в Італії (Buonavoglia et al., 2001), В'єтнамі (Nakamura et al., 2001) і інших країнах, включаючи Іспанію (Nakamura et al., 2004; Decaro et al., 2006), але до сьогоднішнього дня не було достовірних даних про існування варіанта 2с у США, а вакцини проти CPV не обновлялися з урахуванням таких варіантів. Це особливо важливо, оскільки на відміну від раніше описаних варіантів, які вражають в основному щенят, CPV2c здатний інфікувати дорослих собак. Крім того, в 2003 р. у базі даних GenBank була депонована послідовність варіанта 2b з варіаціями кодонів у положеннях 494 і 572 (gi: 54646340), а в 2005 році - опублікована Shackelton et al. (Proceedings National Academy Sciences 102:379-384), але на підставі цих послідовностей не було запропоновано ніяких змін у вакцинах проти CPV або в композиціях для діагностики CPV. За відсутності відновлення вакцин виникає ряд проблем. По-перше, навіть вакциновані собаки можуть бути сприйнятливі до інфікування варіантами CPV, які входять до складу вакцини. По-друге, якщо вакциновані собаки занедужують, їхні власники часто стверджують, що причиною хвороби були вірусні штами у вакцині. Це часто приводить до виплати компенсацій власникам, оскільки на практиці компанія не може надати доказу, що це не так. Проти CPV було запропоновано кілька препаратів вакцин: У патентах США 4193990 і 4193991, авторів Appel et al., описані гетеротипні й інактивовані ("вбиті") вакцини, відповідно, які забезпечують захист проти вихідного CPV. У патенті США 4303645, авторів Carmichael et al., описана вакцина, що містить ослаблений CPV, одержуваний у результаті пролонгованих серійних пасажів вірусу в неонкогенних клітинних лініях. Ця вакцина також захищає від інфекції вихідним ізолятом CPV. 1 UA 102999 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У патенті США 4971793, авторів Wood et al., і в патенті США 5882652, авторів Valdes et al., описані рекомбінантні субодиничні вакцини, що містять білок VP-2 з CPV, отриманий у рекомбінантних бакуловірусах. Білок VP-2 не належить до певного типу або підтипу. У патенті США 5885585, авторів Parrish et al., описана вакцина проти CPV, що містить ослаблену форму варіанта 2b. У результаті здатності CPV мутувати і утворювати нові антигенні варіанти, існує постійна необхідність спостереження за розвитком генетичної структури варіантів CPV і розробки вакцин і діагностичних тестів, спрямованих на сучасні варіанти CPV. КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується оновлених вакцин для профілактики CPV-інфекції й способів діагностики для виявлення нових виникаючих варіантів CPV. Вакцини й способи діагностики основані на відкритті раніше невідомих і раніше недооцінених варіантів CPV і враховують виникнення мутантних форм вірусу, для яких попередні склади вакцин і засоби діагностики є неактивними. Вакцини згідно з даним винаходом забезпечують захист проти виникаючих форм CPV, а діагностичні засоби забезпечують можливість виявляти форми, вірусу що знову утворюються, причому обидві ці якості раніше були недоступні. Зокрема, як "маркерний" варіант у вакцинах використовується один новий варіант, що зустрічається рідко. Використання маркерного варіанта забезпечує можливість досліджень у судовій практиці: викликані чи ні симптоми хвороби у тварини, вакцинованої маркерним варіантом, вакциною або іншим штамом CPV. Нові склади вакцин включають цілий ослаблений CPV з одноланцюжковою ДНК, що має одну або декілька з наступних характеристик: 2bΔ494Δ572 являє собою варіант CPV, що містить щонайменше наступні заміни: кодоном, що кодує амінокислоту в положенні 494 білка VP2, є TGC, а не TGT, а кодоном, що кодує амінокислоту в положенні 572 білка VP2, є GTC, а не GTA. Ці заміни не приводять до амінокислотних замін (обидва кодони TGC і TGT кодують цистеїн, а GTC і GTA кодують валін). Проте, цей варіант викликає хворобу у тварин, раніше щеплених стандартними, доступними на сьогоднішній день вакцинами, і його варто включити в нові склади вакцин. Хоча заміни в кодонах амінокислот 494 і 572 були описані раніше, їм не надавали значення. Крім того, такий американський ізолят може містити інші мутації. 2bΔ431 є новим відкритим варіантом, що зустрічається рідко, CPV2b (наприклад, варіантом 2bΔ494Δ572), в якому кодоном, що кодує амінокислоту в положенні 431 білка VP2, є CTG, а не CTA. Хоча ця заміна також не приводить до амінокислотної заміни, проте, цей варіант викликає хворобу у вакцинованих тварин, і його можна включити в нові склади вакцин. Важливо, що внаслідок нечастої зустрічності 2bΔ431 являє собою ідеальну вакцинну "маркерну" послідовність. Американський тип 2с (або 2с зі Сполучених Штатів) являє собою перший варіант 2с, виділений у Сполучених Штатах, і є переважним (81 %) варіантом 2с. Цей варіант також позначають як "основний варіант 2с". 2сΔ440 являє собою новий відкритий варіант CPV2c, у якому кодоном, що кодує амінокислоту в положенні 440 білка VP2, є GCA, а не ACA, що приводить до заміни треоніну (ACA) на аланін (GCA) у цьому положенні амінокислотної послідовності. Цей варіант викликає хворобу у вакцинованих тварин, і його варто включити в нові склади вакцин. У даний момент цей варіант являє собою мінорний (19 %) варіант і в даному описі позначається також як "мінорний варіант 2с". 2сΔ430Δ440, додатковий варіант 2сΔ440, який крім кодона GCA, що кодує 440 амінокислоту, також відрізняється від відомих послідовностей 2с наявністю лейцину в положенні 430, кодованого ТТА, а не звичайним кодоном TTG. Всі ці варіанти CPV були виявлені за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і виділені з культури клітин, отриманої від собак, інфікованих CPV, і/або їхніх щенят, які вже були щеплені стандартними комерційними вакцинами. Таким чином, ці нові виниклі варіанти здатні ухилятися від впливу імунної системи в собак, вакцинованих відповідно до стандартних протоколів, незалежно від того чи міняється варіація (2сΔ440 і 2сΔ430Δ440 частково) чи ні (2bΔ494Δ572 і 2bΔ431) в амінокислотній послідовності білка VP2 у зазначених положеннях. Крім того, доступні на сьогоднішній день у даній галузі діагностичні методики для використання не здатні виявляти нові варіанти CPV або мають слабку реакцію, що приводить до зниження чутливості. Даний винахід вирішує ці проблеми завдяки вакцинам і діагностичним засобам, які враховують нові варіанти. Крім того, винахід стосується способу розмноження парвовірусу собак, зокрема, описаних у даному документі варіантів, які не викликають цитопатичного ефекту (СРЕ) або викликають 2 UA 102999 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 невеликий СРЕ при культивуванні тільки в клітинах CRFK. Спосіб включає стадію культивування парвовірусу собак у суміші клітин нирки кішки Крендол-Різ (CRFK) і клітин Vero у придатному середовищі. Стадію культивування проводять при умовах, які забезпечують розмноження парвовірусу до титру, вище титру, одержуваного при культивуванні CPV тільки в клітинах CRFK. Крім того, винахід стосується парвовірусної вакцини, що містить один або кілька варіантів CPV. Ступінь нейтралізації одного або декількох варіантів CPV щонайменше в 4 рази нижче ступеня нейтралізації одного або декількох варіантів CPV, вибраних із групи, що складається з CPV-2, CPV-2a, CPV-2b і CPV-2c, які визначають із використанням сироватки тварини, щепленої вакциною, що містить один або кілька варіантів CPV-CPV-2, CPV-2a, CPV-2b і CPV-2c. У деяких варіантах здійснення винаходу ступінь нейтралізації визначають методом оцінки нейтралізуючої здатності сироватки й виражають у вигляді нейтралізуючого титру. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фіг. 1. Характерна послідовність 2bΔ494Δ572 (послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:1), в якій кодоном у положенні 494 є TGC, а кодоном у положенні 572 є GTC. Показано послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислоти 426-572 білка VP2. Фіг. 2. Характерна послідовність 2bΔ431 (послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:2), в якій кодоном у положенні 431 є CTG. Показано послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислоти 426-572 білка VP2. Фіг. 3. Показано послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислоти 426-572 (послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:3) білка VP2 основного американського ізоляту 2с. Фіг. 4. Характерна послідовність 2сΔ440 (мінорний американський ізолят 2с) (послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:4), в якій кодоном у положенні 440 є GCA замість АСА, що кодує аланін замість треоніну. Показано послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислоти 426-572 білка VP2. Фіг. 5. Характерна послідовність 2сΔ430Δ440 (послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:5). Фіг. 6. Імовірна вторинна структура, пов'язана з варіантом 2с. Фіг. 7. Імовірна вторинна структура, пов'язана з варіантом 2bΔ431. Фіг. 8. Імовірна вторинна структура, пов'язана з варіантом 2сΔ430Δ440. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ПЕРЕВАЖНИХ ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ Даний винахід стосується вакцин проти CPV і діагностичних засобів CPV, композиції яких включають нові відкриті варіанти, що відповідають еволюційному розвитку CPV. Кожний із цих варіантів був виділений у собаки, вакцинованого проти CPV, але який проте заразився CPV і занедужав. Таким чином, для припинення або скорочення поширення CPV, ці нові варіанти можна включити в протоколи вакцинації. Крім того, нижче докладно описано, що ідентифікація цих варіантів привела до виявлення гіперваріабельної області в геномі CPV. Відкриття цих варіантів, описаних у даному документі, привело до ідентифікації важливої гіперваріабельної (HPV) області в геномі CPV. Раніше важливими вважалися тільки нуклеотиди 1276-1277. Однак описані в даному документі епідеміологічні дані показали, що найважливіша HPV-область насправді знаходиться практично в середині генома CPV (нуклеотиди 1275-1326 у повному гені VP2). Ця область HPV охоплює щонайменше дві найважливіших гіперваріабельних кодони - кодони 426 і 440 у гені VP2. Переважно, гіперваріабельна область включає область, що починається за один нуклеотид до кодона 426-440, включно. Не спираючись на яку-небудь теорію, імовірно, що біологічна значимість цієї HPV-області пов'язана з термодинамічною стабільністю структур, утворених послідовністю, як докладно описано нижче. Нижче перераховані відповідні варіанти: 1) 2bΔ494Δ572 являє собою варіант CPV2b, в якому кодон у положенні 494 білка VP2 є TGC, а не TGT, а кодоном у положенні 572 білка VP2 є GTC, а не GTA. Жодна із цих замін не приводить до амінокислотних замін (Cys у положенні 494 і Val у положенні 572), і ці послідовності були описані раніше. Проте, раніше не було описано, що такі заміни дозволяють вірусу ухилятися від розпізнавання імунною системою хазяїв, вакцинованих доступними на сьогоднішній день вакцинами, описаними в даному документі. Цей варіант представлений на фіг. 1, де показана частина гена VP2 з 2b (тобто, 426=GAT), що кодує амінокислоти 426-572. Два мутантних кодони (494 і 572) виділені напівжирним шрифтом і підкреслені. 2) 2bΔ431 є варіантом, що зустрічається рідко, CPV2b, що містить заміну CTA на CTG у кодоні, що кодує амінокислоту в положенні 431. Вихідний ізолят 2bΔ431 також включає мутації 2bΔ494Δ572 і, отже, являє собою 2bΔ431Δ494Δ572. Однак винахід включає будь-яку послідовність CPV (2a, 2b або 2c), що включає CTG у кодоні, що кодує амінокислоту в 3 UA 102999 C2 5 10 15 положенні 431 білка VP2. Ця мутація не приводить до амінокислотної заміни (CTA і CTG обидва кодують Leu), але завдяки своїй рідкій зустрічальності 2bΔ431 являє собою ідеальну вакцинну "маркерну" послідовність для судових завдань. Цей аспект винаходу докладно описаний нижче. Цей варіант представлений на фіг. 2, де показана частина гена VP2 з 2b (тобто, 426=GAT), що кодує амінокислоти 426-572. Три мутантних кодони (431, 494 і 572) виділені напівжирним шрифтом і підкреслені. 3) Американський 2с являє собою перший варіант 2с, виділений у Сполучених Штатах. Знаменна поява цього варіанта раніше було недооціненою (див. фіг. 3). 4) 2сΔ440 є варіантом CPV2с, в якому кодоном у положенні 440 білка VP2 є GCA, а не ACA. Ця мутація приводить до амінокислотної заміни Thr на Ala у положенні 440. Крім того, цей мутант також був виділений з раніше вакцинованого собаки, що проте занедужав CPV. Тому, цю варіантну послідовність варто включити в нову вакцину проти CPV, а також у діагностичні препарати. Цей варіант представлений на фіг. 4, де показана частина гена VP2 з 2с (тобто, 426=GAА), що кодує амінокислоти 426-572. Мутантний кодон (440) виділений напівжирним шрифтом і підкреслений. Кодони 494 і 572 підкреслені для порівняння. 5) 2сΔ430Δ440, додатковий варіант 2сΔ440, що, крім GCA у кодоні в положенні 440, також відрізняється від відомих послідовностей 2с наявністю лейцину в положенні 430, кодованим ТТА, а не звичайним ТТ. Цей варіант представлений на фіг. 5. У таблиці 1 представлений загальний опис замін у послідовностях зазначених варіантів. 20 Таблиця 1 Кодони, пов'язані з найважливішими амінокислотами білка VP2 варіантах CPV, виявлених у США на сьогоднішній день Положення амінокислоти й асоційований кодон Варіант 426 430 431 440 494 572 2bΔ494Δ572 GAT TTG CTA ACA TGC* GTC* 2bΔ431Δ494Δ572 GAT TTG CTG* ACA TGC* GTC* Американський 2с GAA TTG CAT ACA TGT GTA "Основний американський 2с” 2сΔ440 "Мінорний GAA TTG CAT GCA* TGT GTA американський 2с” 2cΔ430Δ440 GAA TTA* CAT GCA* TGT GTA * вказує мутантний кодон 25 30 35 40 Хоча заміни в положенні 494 і 572 були описані раніше, перевага й характеристики цього варіанта раніше недооцінювалися. Всі описані в даному документі варіанти були виділені в собак (або їхнього потомства), які вже були вакциновані проти CPV, але які занедужали CPV або вмерли від нього. Хоча варіанти вперше були ідентифіковані в південно-центральному регіоні Сполучених Штатів, думають, що вони відповідають також за спорадичні випадки резистентної до вакцин парвовірусної інфекції в собак в інших частинах США. Варіант 2с, раніше детектований на всіх континентах, за винятком Австралії й Африки, на сьогоднішній момент зареєстрований в 14 штатах (в Алабамі, Аризоні, Арканзасі, Каліфорнії, Делавері, Флориді, Іллінойсі, Канзасі, Нью-Джерсі, Міссурі, Орегоні, Оклахомі, Південній Кароліні й Техасі). З огляду на історію швидкого поширення відомих раніше варіантів CPV, один або декілька із цих варіантів варто негайно включити у вакцини для використання в усьому світі, для припинення поширення цих найбільш актуальних варіантів вірусу. Крім того, варто змінити склад діагностичних тестів і способів для CPV з врахуванням цих виникаючих варіантів. Як описано в розділі "Приклади", початок хвороби й смерть вакцинованих собак, у яких були виділені варіанти CPV згідно з даним винаходом, були стрімкими, що вказувало на присутність сильних "вислизаючих" мутантів, яких не стримує імунна відповідь на типи CPV, включені в поточні вакцини. Це справедливо не тільки для 2сΔ440, що викликає зміни в первинній послідовності білка VP, але також і для 2сΔ431, 2bΔ494Δ572, які не містять амінокислотних замін у досліджуваних областях. Важливості змін у кодонах 2bΔ494Δ572 дотепер не надавали значення, і, наскільки відомо авторам винаходу, до сьогоднішнього моменту не надходило пропозицій про зміну композицій вакцин проти CPV і діагностичних засобів для включення або для обліку цих виникаючих варіантів, як описано в даному документі. Крім того, 2сΔ440 і 2bΔ431 являють собою нові мутанти, які раніше не були описані. 4 UA 102999 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ці варіації, очевидно, дають вірусу перевагу у виживанні. Не спираючись на яку-небудь теорію можливо, що мутантні послідовності забезпечують перевагу віріону або самій ДНК на який-небудь зі стадій життєвого циклу вірусу (наприклад, обумовлюють захист проти нуклеаз хазяїна; більш швидку або більш ефективну транскрипцію й/або трансляцію, що може, наприклад, приводити до різних схем згортання білків; більш швидке абобільш ефективне впакування у вірусні частинки, і т.д.). Наприклад, мутантні послідовності можуть забезпечувати перевагу щодо термодинаміки розгортання ланцюга при реплікації ДНК-полімеразої ДНК CPV. На фіг. 6-8 представлені вторинні (згорнуті) структури гіперваріабельної області CPV2c, CPV2bΔ431 і CPV2cΔ430Δ440, відповідно, додатково описані в прикладі 3. В одному з варіантів здійснення винаходу ефективний виникаючий варіант CPV, такий як CPV2cΔ430Δ440, можна використовувати як інфікуючий вірус для оцінки якості комерційних препаратів вакцин в експериментальних умовах. Більш ранні версії CPV2a і CPV2b не є високо патогенними для собак, а новий CPV2c ще не досліджений. Через відсутність високовірулентної моделі, що інфікує, дотепер у компаній, що виробляють вакцини, не було можливості якісної оцінки здатності препаратів вакцин забезпечувати захист у вакцинованих тварин. Таким чином, даний винахід також стосується способів проведення такої оцінки шляхом контактування вакцинованих тварин з високовірулентним варіантом CPV2cΔ430Δ440 і оцінки того, захищає чи ні вакцина від захворювання. Для кожного з варіантів, описаних у даному документі, винахід охоплює препарати вакцин і діагностичні засоби, які включають один або кілька варіантів і способів, в яких вони використовуються. Переважно, такі препарати й діагностичні засоби включають або 2cΔ440, або 2bΔ431, або обидва ці варіанти. Такі препарати й діагностичні засоби можуть додатково включати 2bΔ494Δ572 і/або американський 2с, і/або інші відомі послідовності CPV, такі як послідовності, які вже введені в поточні вакцини. Крім того, для введення в нову вакцину можуть підходити (або ні) інші недавно виділені віруси з новими послідовностями, зокрема, з новими амінокислотними послідовностями. У цілому, рішення про включення нового ізоляту даного вірусу ґрунтується на здатності існуючих вакцин викликати нейтралізуючу відповідь до даного ізоляту у вакцинованої тварини, і, частково, від переваги варіанта. Якщо новий варіант розповсюджений повсюдно, необхідно визначити його антигенну значимість. Одним зі способів є антигенна відстань. Загальну антигенну відстань конкретного ізоляту CPV можна визначити тестуванням ізоляту з використанням функціонального методу аналізу, такого як визначення нейтралізуючого титру сироватки, і/або реакція гемаглютинації, і/або тестування методом непрямої імунофлуоресценції. Якщо в одному або декількох аналізах ізолят слабко нейтралізується в порівнянні з вірусними варіантами, які вже присутні у вакцині (тобто, якщо ступінь нейтралізації нового гетерологічного ізоляту більше, ніж в 4 рази нижче ступеня нейтралізації варіантів, уже присутніх у вакцині), то тоді розробка нової вакцини, що включає новий ізолят, обґрунтована. Наприклад, при виділенні нового варіанта CPV можна розрахувати загальну антигенну відстань за допомогою визначення нейтралізуючого титру сироватки й представити результати у вигляді нейтралізуючого титру. Нейтралізуючим титром є величина, зворотна найбільшому розведенню сироватки з вакцинованої тварини, при якому відбувається повна нейтралізація, про що свідчить відсутність цитопатичного ефекту (СРЕ) або наявності вірусу. Якщо сироватка собак, вакцинованих існуючою вакциною проти CPV дає, наприклад, нейтралізуючий титр (НТ) 1:4000 з гомологічним вірусом і титр 1:200 з новим гетерологічним ізолятом CPV, то тоді новий ізолят варто включити в CPV-вакцину. Інакше кажучи, якщо існуюча на сьогоднішній день вакцина не захищає від варіанта, що часто зустрічається, повсюдно розповсюдженого варіанта, що не є присутнім у поточній вакцині, тоді варіант (з обережністю) можна включати в новий препарат вакцини. Якщо ізолят локалізований у невеликому географічному просторі, то тоді більше підходить спеціальна або аутогенна вакцина, а не комерційна вакцина, розроблена для широкого застосування. Результати також повинні бути підтверджені в експериментах по захисту від інфікування. В експериментах по захисту від інфікування тварин вакцинують, а потім вводять помірні дози (наприклад, 10000 TCID 50, тобто середню тканинну інфікуючу дозу) варіанта, використовуваного як інфікуючий вірус. Якщо вакцина забезпечує захист проти варіанта, що цікавить, тоді варіант не потрібно включати в композиції вакцин. Однак, якщо вакцинована тварина не захищена від варіанта, то варіант можна включати в препарати вакцин. Крім того, у процесі вакцинації, не всі штами або варіанти потрібно включати в одну ін'єкцію. Може бути переважно, наприклад, введення щеняті вакцини, що містить один варіанту віці 3 тижнів, у віці 7 тижнів - вакцину, що містить інший варіант, а у віці 10 тижнів - вакцину, що містить третій варіант. Цей спосіб відрізняється від загальноприйнятої практики, коли однакові варіанти вводять щенятам при всіх вакцинаціях. Існуюча методика має ваду, пов'язану з тим, що існуючий імунітет, отриманий у результаті 5 UA 102999 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 більш ранньої вакцинації може нейтралізувати CPV, що вводяться при більш пізніх вакцинаціях, знецінюючи користь повторних вакцинацій. Примітно, що добре відомо про те, що деякі вірусні патогени можуть інфікувати множину видів. У випадку CPV відомо, що віруси кішок і норок можуть також інфікувати собак. Хоча включення таких вірусів у вакцину проти CPV собак не рекомендується, ці віруси кішок і норок варто включати в експерименти по інфікуванню на вакцинованих тваринах. Зокрема, варіант 2bΔ431 підходить для одержання вакцин судової оцінки й виявлення. Як описано вище, в існуючих на сьогоднішній день вакцин знижується здатність захищати вакцинованих тварин від виникаючих CPV. Власники тварин, що занедужали після вакцинації, звичайно зв'язують це із самою вакциною. Оскільки за допомогою існуючих способів діагностики не можна адекватно відрізнити вакцинні штами й штами, що проявляються, то виробники вакцин практично позбавлені захисту проти таких обвинувачень і часто вирішують такі позови шляхом виплати компенсацій власникам тварин. Це приводить до більших витрат виробників вакцин. Крім того, близькість кодона 431 до кодона 426 і його розташування в гіперваріабельній області генома CPV також дозволяє проводити лише обмежене секвенування для підтвердження джерела CPV, що викликало хворобу в собаки. Цього можна уникнути, включаючи мутацію 2bΔ431 в один або кілька вакцинних штамів, використовуваних у складі вакцини. Поширеність 2bΔ431 дуже низька, наприклад, цей варіант становить приблизно 1,2 % варіантів, досліджених на сьогоднішній день. Таким чином, якщо при дослідженні на CPV тканин померлої тварини, вакцинованої варіантом 2bΔ431, виявляють будь-який штам, що відрізняється від 2bΔ431, то можна із упевненістю вважати, що вакцина не викликала захворювання, а скоріше, причиною були інші детектовані штами. Крім того, мутацію Δ431 легко виявити без надлишкового секвенування. Цей тип судових досліджень може значно скоротити витрати компаній-виробників вакцин. Винахід стосується препаратів вакцин, які містять виділені послідовності нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 і 5, і/або білки, поліпептиди або пептиди, кодовані цими послідовностями, і способів їхнього застосування. Крім того, винахід також охоплює вакцини з деякими варіаціями цих послідовностей. Хоча послідовності представляють одноланцюжкову (ол) ДНК, проте винахід включає відповідну двохланцюжкову (дл) ДНК, комплементарну ДНК і будь-яку форму РНК (наприклад, мРНК, гібриди РНК/ДНК і т.д.), які основані на цих послідовностях, отримані з них або комплементарні ним. Такі послідовності можуть бути або смисловими, або антисмисловими послідовностями. Крім того, даний винахід також стосується застосування у вакцинах послідовностей, які щонайменше на 50 %, переважно, приблизно на 60 %, більш переважно, приблизно на 70, 80 або 90 %, або навіть приблизно на 95, 96, 97, 98 або 99 % або вище, гомологичні послідовностям SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 і 5. Такі послідовності можуть відрізнятися, наприклад, вмістом альтернативних кодонів, які кодують ту саму амінокислоту в одному або декількох положеннях. Крім того, винахід також стосується частин цих послідовностей, які кодують антигенні області білка VP2 CPV, як послідовності, які мають на 70 %, або навіть вище, переважно, приблизно на 80, 90 або 95 %, або навіть вище (наприклад, 96, 97, 98 або 99 %) гомологичні такими, амінокислотним послідовностями. Такі послідовності можуть відрізнятися, наприклад, вмістом консервативних або неконсервативних амінокислотних замін або делецій (особливо, аміно- або карбокси-кінцевих делецій), або різними вставками й т.д., за умови, що отриманий білок/пептид є антигенним, як описано в даному документі. Переважно, довжина таких антигенних областей щонайменше становить приблизно 10 амінокислот і вони включають одне або декілька з положень 426, 431, 440, 494, 555 і 572 білка VP. Однак антигенна область може охоплювати весь ген VP2. Крім того, винахід також стосується послідовностей нуклеїнової кислоти, які гібридизуються в жорстких умовах (особливо у високо жорстких умовах) з послідовностями, розкритими в даному описі, (або із частинами цих послідовностей). Визначення "жорсткі" стосується умов гібридизації, які дозволяють гібридизацію послідовності нуклеїнової кислоти з конкретною послідовністю. У загальному випадку умови "високої жорсткості" стосуються умов гібридизації, які забезпечують гібридизацію послідовності нуклеїнової кислоти, з довжиною щонайменше 50 нуклеотидів, і, переважно, приблизно 200 або більше нуклеотидів, з конкретною послідовністю при приблизно 65 °C у розчині, що містить 1 М сіль, переважно, 6×SSC, або в будь-якому іншому розчині, що має порівнянну іонну силу, і відмивання при 65 °C у розчині, що містить приблизно 0,1 М сіль або менше, переважно, 0,2×SSC, або в будь-якому іншому розчині, що має порівнянну іонну силу. Ці умови дозволяють виявляти послідовності з 90 % ідентичністю або більше. У цілому, більш слабкі умови гібридизації стосуються умов гібридизації, які дозволяють гібридизацію послідовності нуклеїнової кислоти з довжиною щонайменше 50 нуклеотидів, і, переважно, приблизно 200 або більше нуклеотидів, з конкретною послідовністю 6 UA 102999 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 при приблизно 45 °C у розчині, що містить 1 М сіль, переважно, 6×SSC, або в будь-якому іншому розчині, що має порівнянну іонну силу, і відмивання при кімнатній температурі в розчині, що містить приблизно 1 М сіль або менше, переважно, 6×SSC, або в будь-якому іншому розчині, що має порівнянну іонну силу. Ці умови дозволяють детектувати послідовності з ідентичністю до 50 %. Фахівець у даній галузі зможе модифікувати ці умови гібридизації для ідентифікації послідовностей, ідентичність яких змінюється від 50 % до 90 %. Винахід також стосується різних типів рекомбінантних і/або експресійних векторів, які містять або експресують розкриті в даному описі послідовності нуклеїнової кислоти (або їх частини, що кодують антигенні пептиди й/або поліпептиди). Приклади таких векторів і експресійних систем включають, але ними не обмежуються: різні бактеріальні (наприклад, для експресії в Escherichia coli) або пробіотичні (наприклад, для експресії в Lactobacillus) експресійні вектори; аденовірусні вектори, бакуловіруси, системи експресії в Pichia і дріжджові системи експресії, і т.д. Такі рекомбінантні вектори й експресійні системи можна використовувати, наприклад, для одержання вакцин або, як альтернатива, для інших цілей, таких як лабораторні маніпуляції з послідовностями, або для дослідницьких або діагностичних цілей. Винахід стосується імуногенних і/або вакцинних композицій проти парвовірусу собак. Композиції включають одну або кілька послідовностей нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 і 5, або їх частини, які кодують антигенні пептиди або поліпептиди (антигенні області), наприклад, частини послідовності, що включають один або кілька кодонів у положеннях 426, 430, 431, 440, 494, 555 і 572. Переважно, включені щонайменше послідовності, що містять SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:4, або SEQ ID NO:5, або їх частини, що кодують антигенні області. Для фахівців у даній галузі буде зрозуміло, що вакцинні композиції можуть змінюватися залежно від передбачуваного застосування. Інакше кажучи, включені у вакцину конкретні компоненти (варіанти) можна змінювати відповідно до кожного з декількох параметрів для створення спеціально розроблювального препарату вакцини. Наприклад, вакцини можуть бути розроблені для включення тільки тих варіантів, які були виявлені в даному географічному місці розташування. Наприклад, варіант 2а більше не детектується в Сполучених Штатах, і, тому, виробники вакцин можуть не включати цей варіант у склади вакцин для застосування на території США. Вакцини для США можуть містити, наприклад, тільки варіанти CPV 2c і CPV 2b. На відміну від цього, у цей час на території Австралії єдиним варіантом CPV є 2а. Тому, композиція вакцини, розроблена для застосування в Австралії, може включати тільки варіант 2а. Вакцини, що рекомендуються для Європи, можуть включати, наприклад, варіанти 2c і 2b, у той час як композиція вакцини для Азії може включати 2а й 2b. Всі такі прив'язані до географічного місця розташування вакцини включені в об'єм даного винаходу, і можуть згодом змінюватися залежно від схеми поширення варіантів. Додатково для таких прив'язаних до географічного місця розташування вакцин необхідно враховувати те, що модифіковані живі вакцини містять високий рівень вакцинного вірусного антигену. Тому, якщо собаку, вакцинованого варіантом, перевозять у місце, де цей варіант не існує, переважне проходження твариною карантину протягом щонайменше одного місяця перед його контактом з новим оточенням. У противному випадку варіант може з'явитися в новому місці розташування. Наприклад, собаки, вакциновані варіантом 2с, повинні проходити карантин, до в'їзду, наприклад, в Австралію. Через місяць виділення вірусу повинне припинитися. Якщо навіть хоча вірус, що виділяється, є ослабленим, то його присутність може негативно впливати на контроль вірусної епідеміологічної ситуації, і може забезпечити рекомбінацію нативних вірусів з виділюваним вірусом, що приводить до внесення більш вірулентної мутації в локальну популяцію. Крім того, вакцинні композиції можуть бути прив'язані до використання в конкретного хазяїна. Наприклад, деякі породи собак можуть бути більш сприйнятливі до одних варіантів, чим до інших; або до одного або декількох варіантів можуть бути схильні тварини на певній стадії розвитку (наприклад, щенята щодо дорослих тварин); або коли інші тварини, крім собак, повинні бути вакциновані (наприклад, дикі тварини, тварини в зоопарках або в мисливських угіддях, і т.д.), то в таких випадках композиції вакцин можуть бути змінені з урахуванням сприйнятливості конкретної тварини-хазяїна, що буде вакцинована. Наприклад, при розробці інфікуючої моделі породи Чіхуа-Хуа й Лабрадор-ретривер, очевидно, є більш сприйнятливими до CPV. Тому, 4 приблизно 10 високо вірулентного варіанта CPV-2c повинно бути достатньо, щоб викликати діарею й блювання в контрольованому експерименті. Всі такі хазяїн-специфічні або хазяїнселективні вакцини знаходяться у рамках даного винаходу. В інших варіантах здійснення винаходу композиція вакцини може бути змінена відповідно до локального оточення вакцинованої тварини. Наприклад, у комерційних собачих розплідниках на більш ніж на 100 собак, де високий ризик заразних інфекцій, може бути переважною вакцинація 7 UA 102999 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з використанням щодо дорогих препаратів, що містять варіант 2bΔ431Δ494Δ572 у комбінації з основними й мінорним американськими варіантами CPV 2c. Однак у розплідниках меншого розміру (наприклад, в яких утримується менше 25 собак) або в будинках з одним або декількома собаками, де ризик зараження менше, може бути досить вакцинації менш дорогими вакцинами, що містять або 2bΔ431Δ494Δ572, або 2bΔ494Δ572 разом з тільки одним основним американським варіантом 2с. При виборі використовуваних композицій вакцин варто зважувати ризик зараження тварин хворобою щодо вартості й можливості моніторингу на молекулярному рівні, і оцінки присутності варіантів CPV у майбутньому. У ще одному аспекті винахід стосується стратегії вакцинації для виключення порушення материнськими антитілами індукції вакциною імунітету в щенят. Замість використання одного препарату вакцини в дорослих собак і в щенят, щенят можна вакцинувати серіями вакцин, що різняться антигенами. Інакше кажучи, первинна вакцина щенят може містити варіанти, які можуть відрізнятися від тих, які вводять їх матері, а наступні ревакцинації щенят будуть включати ще один варіант вакцини. Таким чином, поступово формується широкий спектр антитіл. Шлях вакцинації можна модифікувати, для того щоб перебороти деякі обмеження при вакцинації, як виділення вірусу після імунізації батьків. Наприклад, застосування пероральної вакцинації з використанням безголкової методики забезпечує імунітет, але може попереджати виділення вірусу з фекаліями. У даній галузі відомі кілька способів одержання вакцин, що підходять для вакцинації проти CPV. Див., наприклад, патенти Сполучених Штатів 4193990 і 4193991, авторів Appel et al., патент Сполучених Штатів 4303645, авторів Carmichael et al., патент Сполучених Штатів 4971793, авторів Wood et al., патент Сполучених Штатів 5882652, авторів Valdes et al., і патент Сполучених Штатів 5885585, авторів Parrish et al., у кожному з яких запропоновані варіації придатних стратегій одержання вакцин. Повний зміст кожного із цих патентів включений в даний опис шляхом посилання. У цілому, для одержання вакцини використовують вірусний вектор, що містить описані послідовності нуклеїнової кислоти (наприклад, олДНК, що зустрічається в природному вірусі, або олДНК або іншу еквівалентну форму, вміщену за допомогою методів генної інженерії в неприродний вірусний вектор (наприклад, длДНК, ол або длРНК, ДНК/РНКгібриди й т. д.)). Приклади включають CPV (або інші) віруси, які "вбиті", інактивовані або якимнебудь ще чином ослаблені, так що вони не викликають гострих симптомів хвороби у тварини, якій їх вводять, разом з відповідним фізіологічним носієм. Переважно, при введенні не виникає жодних симптомів захворювання. Однак для фахівців у даній галузі ясно, що багато ефективних композицій вакцин викликають деякий дискомфорт або відносно невелике нездужання при введенні або після нього. Однак користь від одержання захисту проти різко вираженого захворювання набагато переважують цю можливість. Як альтернативу можна використовувати гетеротипний вірус, що у природі не інфікує вакциновану тварину, або який звичайно не викликає захворювання. Ослабленим вірусом може бути CPV, що містить свою природну послідовність нуклеїнової кислоти (послідовності нуклеїнової кислоти), або вірус (CPV або інший вірус) може бути рекомбінантним, в якому послідовність нуклеїнової кислоти вбудована у вірус методами генної інженерії. У випадку рекомбінантних вакцин для одержання гетеротипних рекомбінантних вакцин послідовності нуклеїнової кислоти можуть бути вбудовані у віруси, відмінні від CPV. Приклади таких вірусів включають, але ними не обмежені, FPV, різні герпесвіруси, непатогенні віруси-"сиротки", шлунково-кишкові віруси, такі як ентеровіруси, і т.д. У переважному варіанті здійснення винаходу вірусом є живий, ослаблений (модифікований) CPV з високим титром, а нуклеїнової кислотою є олДНК. Переважно, такий препарат також містить послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують антигенні області інших варіантів CPV, наприклад, варіантів 2, 2a, 2b і/або 2c, або будь-яких інших варіантів CPV, які згодом можуть бути ідентифіковані й вважатимуться корисними. Однак в умовах широкого поширення композицій вакцин, що містить тільки варіанти 2а й 2b, також може бути корисно одержати композиції вакцин, що містять тільки один або декілька з розкритих у даному описі варіантів, для використання разом з вакцинами 2а-2b або як доповнення до їхньої дії. Крім того, такі вакцини можна вводити разом з вакцинами проти інших збудників, або в окремих композиціях, або спільно - в одній композиції. Конкретна форма вакцини може змінюватися. В одному з варіантів здійснення винаходу вакцина складається з ослаблених CPV, які містять послідовності нуклеїнової кислоти, розкриті в даному описі. Переважно, вакцина є мультивалентною і також включає ослаблені типи вірусів CPV 2, 2a, 2b і/або 2c. Як альтернатива за допомогою генної інженерії можна одержати єдиний вірус, що буде містити нуклеїнові кислоти, що кодують білки (наприклад білки VP2 або їхні антигенні частини) із двох або декількох варіантних типів; тобто за допомогою рекомбінантних 8 UA 102999 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 методів можна сконструювати рекомбінантние хімерні CPV, що мають геномні області із двох або більше областей VP2, за допомогою обміну областей ДНК із двох або декількох CPV, як відомо досвідченим фахівцям у даній галузі. Винахід також стосується інших форм вакцин. Наприклад, винахід також стосується вакцин з "порожніми" частинками віріонів (без нуклеїнової кислоти), а також вакцин, що містять антигенний віріон або інші білки CPV, які не впаковані в капсид. У цих випадках білки в препараті вакцини кодуються SEQ ID NO:2 і/або SEQ ID NO:4, або двома цими послідовностями, або, як альтернатива, більш короткі антигенні області кодуються частинами SEQ ID NO:2 і/або SEQ ID NO:4, і/або SEQ ID NO:5. Також можна включити білки, кодовані SEQ ID NO:1 і/або SEQ ID NO:3, і/або антигенними областями, кодованими частинами SEQ ID NO:1 і/або SEQ ID NO:3. Інші придатні компоненти вакцин, наприклад, фармакологічно прийнятні носії, добре відомі фахівцям у даній галузі, також як і одержання таких композицій для використання як вакцини. Звичайно, такі композиції одержують у вигляді або рідких розчинів, або суспензій, хоча також передбачені тверді форми, такі як таблетки, пігулки, порошки й т.п. Також можна одержати тверді форми, що придатні для розчинення або ресуспендування в рідині перед введенням. Також препарат можна одержати у вигляді емульсії. Активні інгредієнти можна змішати з наповнювачами, які є фармацевтично прийнятними й сумісними з активними інгредієнтами. Придатними наповнювачами є, наприклад, вода, сольовий розчин, декстроза, гліцерин, етиловий спирт і т.п., або їх комбінації. Додатково композиція може містити мінорні кількості допоміжних речовин, таких як зволожуючі агенти або емульгатори, рН-буферні агенти й т.п. Якщо бажано введення композиції в пероральній формі, то можна додати різні загусники, ароматизатори, розріджувачі, емульгатори, диспергуючі агенти або зв'язувальні речовини, і т.п. Для того щоб одержати композицію в придатній для введення формі, композиція згідно з даним винаходом може містити будь-які такі додаткові інгредієнти. Кінцева кількість у складах трансльованої нуклеїнової кислоти може варіювати. Однак, загалом, кількість буде становити приблизно 1-99 %. Композиції можуть додатково містити придатний ад'ювант приклади якого включають, але не обмежені, Seppic, Quil A, Alhydrogel і т.д. Імуногенні/вакцинні препарати згідно з даним винаходом можна вводити кожним з множини придатних способів (які всі добре відомі фахівцям у даній галузі), включаючи, але ними не обмежуючись: введення за допомогою ін'єкції, пероральне введення, інтраназальне введення, введення за допомогою прийому харчового продукту, що містить антиген, і т.д. Однак у переважному варіанті здійснення винаходу способом введення є ін'єкція. Крім того, композиції можна вводити самі по собі або в комбінації з іншими лікарськими препаратами або імуногенними композиціями, наприклад, як частина багатокомпонентної вакцини. Крім того, вакцину можна вводити однократно, або можна проводити кілька повторних вакцинацій з різними інтервалами для посилення імунної відповіді. На додаток, вакцину можна вводити для профілактики (тобто перед зараженням вірусом, або якщо є підозра, що зараження відбудеться) або постфактум (тобто після відомого або підозрюваного зараження, або в терапевтичних цілях, наприклад, після виникнення симптомів хвороби, асоційованих з вірусною інфекцією). Після введення препарату послідовності нуклеїнової кислоти за винаходом експресуються у тварині-хазяїні, якій увели вакцину, і у тварини-хазяїна виникає імунна відповідь на антигенні білки (або їх частини), кодовані нуклеїновою кислотою. Переважно, викликувана імунна відповідь являє собою захисну імунну відповідь. У деяких варіантах здійснення винаходу в ослабленого вірусу зберігається здатність до реплікації в хазяїні, хоча це не є жорстко необхідним. Винахід стосується способів профілактики симптомів інфекції CPV у тварин. Загалом, вакцини проти CPV вводять для забезпечення активного імунітету в щенят і/або дорослих собак. Спосіб включає введення ссавцеві імуногенної й/або вакцинної композиції, що містить нуклеїнову кислоту, що включає послідовність, представлену щонайменше однією з послідовності SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:4, або SEQ ID NO:5, або їх частин, які кодують антигенні області VP2, і, переважно, що містить послідовності, представлені однією або декількома з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 і SEQ ID NO:5, або їх частин, які кодують антигенні області VP2. У переважному варіанті здійснення винаходу препарат також включає нуклеїнові кислоти, що кодують клінічно значимі варіанти CPV, переважно, варіанти 2а й 2b, і, необов'язково, вихідний CPV2. Результатом введення композиції є виникнення імунної відповіді в реципієнта. Переважно, імунна відповідь захищає від наступних інфекцій CPV, і або усуває симптоми захворювання повністю, або послабляє симптоми хвороби в порівнянні із симптомами, спостережуваними під час відсутності вакцинації. 9 UA 102999 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У переважному варіанті здійснення винаходу тварини, вакцинацію яких проводять вакцинами за винаходом, є домашніми собаками, як дорослими собаками, так і щенятами. Однак передбачена вакцинація інших можливих хазяїв CPV. Інші хазяї включають інших представників сімейства псових, таких як дикі псові (наприклад, вовки, види диких собак і т.д.), представників сімейств котячих (включаючи домашніх кішок і кошенят, і великі види кішок, одомашнених або диких), норок, червону панду, лисиць, левів й тигрів і т.д. Хоча вакцини будуть, безсумнівно, використовуватися у свійських тварин, вакцинація за допомогою таких вакцин може бути ефективна для диких або частково одомашнених тварин, наприклад, для тварин у зоопарках або закритих просторах, парках, у дослідницьких центрах і т.д. Вакцинація препаратами вакцин, описаними в даному документі, може бути ефективна для будь-якої тварини, що може бути хазяїном CPV і варіантів CPV, поза залежністю від того, чи викликає вірус симптоми захворювання в тварини чи ні. Вакцинація тварин, у яких не проявляються симптоми зараження вірусом (тобто "носії, що мовчать",) може бути ефективна для запобігання поширення вірусу в більш сприйнятливих популяціях. Винахід також стосується антитіл, які специфічно або селективно зв'язують антигенні детермінанти або антигенні області білків наступних типів CPV: 2bΔ494Δ572, 2bΔ431, 2cΔ440 або американського варіанта 2c. Такі диференціальні антитіла можуть бути поліклональними або моноклональними, хоча звичайно більше переважні моноклональні антитіла. Моноклональні антитіла одержують шляхом ін'єкції варіантів (або у вигляді білків, або у вигляді нуклеїнових кислот, що кодують білки) мишам. Після 3 ревакцинацій, збирають селезінки й зливають із клітинами мієломи. Проводять скринінг продукуючих моноклональні антитіла клонів за допомогою ELISA, інгібування гемаглютинації й тестування методом непрямої імунофлуоресценції. Клони, що реагують із генотипами 2bΔ494Δ572, 2bΔ431, 2cΔ440 і/або американським 2с, зберігають для розробки діагностичних методів аналізу CPV. Поліклональні антитіла можна одержати ін'єкцією, наприклад, кроликам одного або декількох пептидів, що містять амінокислотні залишки, які є переважними антигенними мішенями варіантів 2bΔ494Δ572, 2bΔ431, 2cΔ440 і/або американського 2с. Винахід також стосується діагностичних наборів для виявлення описаних у даному документі варіантів CPV і, необов'язково, також інших варіантів CPV (наприклад, CPV2, 2a і 2b). Такі набори включають олігонуклеотидні праймери, специфічні для ампліфікації (наприклад, полімеразною ланцюговою реакцією) послідовностей нуклеїнової кислоти, розкритих у даному описі. Як альтернатива, такі набори можуть включати антитіла (наприклад, моноклональні або поліклональні), які селективно або специфічно зв'язуються з унікальними антигенними детермінантами, що представляються цими варіантами, і, необов'язково, також іншими варіантами CPV (наприклад, CPV2, 2a і 2b). У додатковому аспекті винахід стосується нового способу культивування CPV in vitro. Спосіб включає культивування вірусу в змішаній культурі (1) клітин, які, як відомо, сприйнятливі до інфекції CPV, і (2) клітин Vero у придатному середовищі. У переважному варіанті здійснення винаходу клітинами, сприйнятливими до інфекції CPV, є клітини CRFK. Однак також можна використовувати інші типи таких клітин, включаючи, але не обмежуючись: клітини А72 (фіброма собак); клітини, отримані із клітин CRFK, наприклад клітини нирки кішки, отримані в лабораторії Нордиск (NLFK); клітини язика кішки, такі як клітини Fe3Tg; клітини легенів кішки, такі як клітини AK-D; клітинні лінії мікроманометра кішок, такі як 3201; Т-клітинні лінії собак, такі як СТ45-S; лінії епітеліальних клітин тимуса собак, такі як Cf2Th, і т.д. Більш того, різноманітні лінії клітин кішок і собак, а також інструкції з їх культивування, можна одержати від Американської Колекції Типових Культур у Манасасі, Вірджинія. Розподіл цих клітин можна проводити разом із клітинами Vero у різних середовищах, відомих фахівцеві в даній галузі. Наприклад, клітини CT 45-S можна культивувати в середовищі RPMI 1640; клітини AK-D, Fe2lu і Cf2Ths можна культивувати в мінімальному необхідному середовищі Дульбеко (MEM) з 10 % фетальної бичачої сироватки (FBS); для клітин 3201, NLFK, CRFL, A72 і Fc3Tg використовують середовища McCoy's 5A і Leibowitz L15 з 5 % FCS. Звичайно, клітинні лінії інкубують спільно протягом 4-5 днів при 37 °C. ПРИКЛАДИ Введення Парвовірусна (CPV) інфекція собак є найбільш серйозним і розповсюдженим захворюванням у собак, і такою, що найбільше часто зустрічається причиною діареї в щенят. Хоча вакцини проти CPV доступні й широко застосовуються, недавно були зареєстровані кілька спалахів CPV у вакцинованих собак. Наприклад, власники розплідників у центральнопівденному районі США спостерігали високий рівень смертності в щенят внаслідок інфекції CPV незважаючи на вакцинацію. 10 UA 102999 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CPV являє собою одноланцюжковий ДНК-вірус, мутуючий з високою швидкістю і володіє здатністю міняти коло хазяїв і тропізм. Доступні на сьогоднішній день комерційні вакцини звичайно містять тільки варіанти CPV2, CPV2a і CPV2b. У ході проведеного авторами аналізу зразків від вакцинованих проти CPV собак з явними симптомами парвовірусної інфекції, заявники спостерігали функціональні зміни в детекції CPV існуючими діагностичними тестами на CPV і нездатність існуючих діагностичних наборів детектувати даний вірус, що вказувало на можливу еволюцію CPV за межі підтипів 2а й 2b. Подальші дослідження привели до ідентифікації двох варіантів CPV, а саме - 2bΔ494Δ572 і американського 2с. Ізоляти асоціювалися з посиленою вірулентністю й більш широким тканинним тропізмом у порівнянні зі спостережуваними до сьогоднішнього моменту в культивованих ізолятів CPV. Крім того, зважаючи на все нові ізоляти CPV викликають жовту слизувату діарею замість геморагічної діареї, яка викликається генотипами CPV-2 у минулому. Відповідно до інших даних у варіанта 2bΔ494Δ572 присутні дві заміни кодонів. Американський варіант 2с раніше детектувався в Італії, Іспанії й В'єтнамі, але в США до цього не виявлявся. Матеріали й методи У діагностичній лабораторії хвороб тварин штату Оклахома одержували зразки фекалій за допомогою поштової служби Federal Express на льоді (приблизно 4-5 °C). Як мінімум одержували 2-5 г фекалій або 2-5 мл рідкого діарейного випорожнення. Зразки фекалій звичайно тестували на CPV у той же день за допомогою комерційного набору (наборів) для твердофазного імуносорбентного аналізу (ELISA). Для проведення імунофлуоресцентних аналізів (FAT) або імуногістохімічних аналізів (IHC) заявники одержували петлі кишечнику (приблизно 2-3 шматочка) з різних ділянок кишечнику. Іноді заявники одержували шматочки язика для перевірки на CPV за допомогою FAT, IHC або полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Ці зразки одержували охолодженими на льоді за допомогою Federal Express. У багатьох випадках CPV була історія негативних результатів тестування на CPV за допомогою "польових" діагностичних наборів (Assure, Synbiotics, CA; або IDEXX, Bar Harbor, Maine). Гістопатологічні дослідження проводили на кишечнику щенят і дорослих собак з історією хвороби, сумісною з інфекцією CPV. Історія включала криваву або слизувату діарею й смерть. Свіжі й фіксовані у формаліні тканини кишечнику досліджувалися на наявність виразок, що відповідають CPV: розширення й некроз крипт, і втрата кишкових ворсинок. Для скринінга кишечнику на присутність CPV-антигену використовували імунофлуоресцентний аналіз (FAT). Кишкові зрізи товщиною 6-8 мікронів фіксували в ацетоні й висушували на повітрі. До зрізів додавали антитіла до CPV, кон'юговані з FITC, і інкубували 30 хв при 37 °C. Після промивання, зрізи контрастно забарвлювали трипановим синім. Зрізи досліджували за допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії: клітини, що мають позитивне фарбування на CPV, були яблучно-зеленого кольору, а клітини, що не дають фарбування на CPV, були червоного-цегляно-червоного кольору. Фіксовані у формаліні зрізи, прислані для гістопатологічного аналізу, досліджували за допомогою імуногістохімічного аналізу на присутність CPV-антигену. На зразках фекалій і зіскрібках зразків кишечнику, які давали позитивну реакцію на CPV або які приблизно були інфіковані CPV, проводили ПЛР із наступним секвенуванням, як описано в Desario et al., 2005. Частину гена вірусного білка ампліфікували за допомогою ПЛР. Ампліфікований продукт ПЛР детектували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі й елюювали з гелю для секвенування. Послідовності аналізували за допомогою програми BLAST, що порівнює результати з великою колекцією послідовностей, вміщених у базу даних GenBank. Всі послідовності були ідентифіковані, як гомологічні парвовірусу собак. ПРИКЛАД 1. Неефективність існуючих діагностичних тестів на CPV. Аналіз зразків фекалій проводили, як описано вище, і всі зразки були позитивними за стандартними критеріями: характерні виразки, обумовлені гістопатологічними дослідженнями, результати імунофлуоресцентного аналізу й результати імуногістохімічного аналізу. Проте, при тестуванні цих же зразків з використанням комерційних діагностичних тестів результати показали, що для польової діагностики CPV у цих зразках тести були недостовірні, тому що не були здатні детектувати 33-50 % позитивних випадків CPV. Більшість цих ізолятів CPV були отримані з розплідників, які в даний момент використовують комерційні вакцини проти CPV відповідно до маркування на вакцині, але в яких усе ще виникають спалахи CPV і смертність від CPV. Відсутність захисту досить імовірно обумовлена антигенною варіацією в ізолятах CPV, що недавно з'явилися. Ці епідеміологічні польові спостереження за багатьма випадками CPV (n~500) сигналізують про необхідність включити ці нові варіанти CPV у комерційні вакцини від CPV. 11 UA 102999 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПРИКЛАД 2. Визначення послідовності нуклеїнової кислоти (секвенування) ізолятів CPV: ідентифікація варіанта 2bΔ494Δ572 і американського ізоляту CPV2c. Неефективність вакцин і діагностичних наборів звичайно розглядається як епідеміологічна ознака вірусної еволюції. Тому, у досліджуваних зразках припускали наявність нових варіантів CPV. Для підтвердження проводили ПЛР-секвенування частини вірусного білка VP2 для вірусів, виділених зі зразків фекалій, і порівнювали результати з відомими послідовностями VP2 з використанням комп'ютерного програмного забезпечення й/або ручного вирівнювання. Результати підтвердили присутність у зразках двох нових виниклих типів CPV: 1) варіанта 2b, що був названий 2bΔ494Δ572; і 2) американського 2с, що раніше не детектувався на території Сполучених Штатів. Послідовності ДНК, що кодують частини білка VP2 цих двох варіантів представлені на фіг. 1 (2bΔ494Δ572, SEQ ID NO:1) і фіг. 3 (американський 2c, SEQ ID NO:3). Порівняння цих послідовностей з відомою референсною послідовністю CPV2 виявило, що в 2bΔ494Δ572 відбулися зміни в кодонах 494 і 572. Звичайним кодоном CPV2 у положенні 494 є TGT, а в 2bΔ494Δ572 494-м кодоном є TGC. Аналогічно, звичайним кодоном у положенні 572 в ізолятах CPV2 є GTA, а в 2bΔ494Δ572 цим кодоном є GTC. Ці зміни не приводять до замін в амінокислотній послідовності білка VP2. Однак, імовірно, що зміни надають перевагу варіанту 2bΔ494Δ572 на одній або декількох стадіях життєвого циклу вірусу, наприклад, в ефективності реплікації, транскрипції або трансляції. Чудово, що присутність у зразках американського варіанта 2с є першим випадком появи цього варіанта CPV у Сполучених Штатах і, імовірно, є провісником його появи як домінуючого варіанту. У приблизно 50 % випадках причиною неефективності вакцин була присутність CPV2bΔ494Δ572 і в 50 % випадків причину можна було віднести до CPV2c або CPV2cΔ430Δ440. Ці відкриття демонструють появу 2bΔ494Δ572 і американського 2с як домінуючих варіантів CPV і сигналізують про необхідність включення цих варіантів у препарати вакцин від CPV. Інші варіанти були ідентифіковані аналогічним чином. ПРИКЛАД 3. Визначення вторинної структури й зв'язаної енергії варіантів. Відомо, що вірулентність вірусних патогенів пов'язана із вторинними структурними елементами у вірусному геномі (Pellerin et al., 1994. Virology 203: 260-268). Оцінку схем зв'язування гіперваріабельних областей варіантів 2с, 2bΔ431 і 2cΔ430Δ440 проводили з використанням програми визначення вторинної структури ДНК "mfold" на веб-сайті, розташованому за адресою mfold.burnet.edu.au у всесвітній мережі Інтернет. Результати показані на фіг. 6-8, на яких представлені вторинна структура й рівень зв'язаної енергії для кожного варіанта. Можна побачити, що вторинна структура області зберігається, а рівень енергії для розгортання ланцюга може мінятися. ПРИКЛАД 4. Розробка й тестування нової мультивалентної вакцини проти CPV. Розроблена нова мультивалентна вакцина, що захищає від нових варіантів CPV, що з'являються. Вакцина включає один або кілька ослаблених вірусів CPV типів CPV2a, 2bΔ494Δ572, 2bΔ431, американський 2c, 2cΔ440 і, необов'язково, CPV2. Інакше кажучи, у цій новій вакцині, CPV2b заміщений 2bΔ494Δ572, варіантом, що недавно був ідентифікований, який з'являється як домінуючий генотип. Присутність CPV2, що, очевидно, більше не є погрозою, необов'язково. Тварини, вакциновані мультивалентною вакциною, захищені від симптомів парвовірусної інфекції, що розвиваються, варіантами, використовуваними для одержання вакцини. ПРИКЛАД 5. Новий метод розмноження CPV на змішаній популяції клітин. Звичайно CPV вирощують у клітинних культурах, що містять тільки один тип клітин, таких як лінія клітин нирки кішки Крендола (CRFK). Був розроблений поліпшений спосіб культивування CPV. Відповідно до нового способу CPV культивують у суміші рівній кількості клітин CRFK і Vero у мінімальному необхідному середовищі (МЕМ). Висівають обидві клітинні лінії, і зразки інокулюють через одну годину після посіву клітин. На цій стадії клітини прикріплені, але усе ще перебувають на ранніх стадіях розподілу. Новий спосіб культивування клітин дає детектовані цитопатичні ефекти більш швидко, ніж при спільному культивуванні CPV тільки із клітинами CRFK. Більше того, у змішаній клітинній популяції зберігався високий титр продукції CPV протягом 3 серійних пасажів. Хоча опис винаходу оснований на переважних варіантах здійснення, для фахівців у даній галузі буде зрозуміло, що на практиці винахід можна модифікувати, не змінюючи суть заявленого й не виходячи за рамки формули винаходу. Відповідно, даний винахід не слід обмежувати описаними вище варіантами здійснення, він повинний додатково включати всі його модифікації й еквіваленти, що входять у суть і об'єм наведеного в даному документі опису. Всі цитовані в даному описі патенти, патентні заявки Сполучених Штатів і інших посилань включені в даний опис шляхом посилання. 12 UA 102999 C2 СПИСОК ЦИТОВАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ 13 UA 102999 C2 14 UA 102999 C2 15 UA 102999 C2 16 UA 102999 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1. Імуногенна композиція для собак, що містить віріони парвовірусу з білком типу VP-2, причому вказані віріони парвовірусу містять нуклеїнову кислоту, яка містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO:2; послідовності, яка принаймні на 95 % гомологічна SEQ ID NO:2, в якій нуклеотиди 16-18 являють собою CTG і кодують Leu в положенні 431 вказаного білка VP-2; SEQ ID NO:4; i послідовності, яка принаймні на 95 % гомологічна SEQ ID NO:4, в якій нуклеотиди 43-45 являють собою GCA і кодують Ala в положенні 440 вказаного білка VP-2. 2. Імуногенна композиція для собак за п. 1, яка додатково містить віріони, що містять послідовність нуклеїнової кислоти, яка вибрана з групи, що складається з: SEQ ID NO:1; частини SEQ ID NO:1, що кодує антигенну ділянку вказаного білка VP-2; SEQ ID NO:3; і частини SEQ ID NO:3, що кодує антигенну ділянку вказаного білка VP-2; і послідовності, що кодує білок VP-2b. 3. Імуногенна композиція для собак за п. 1, в якій віріони парвовірусу атенуйовані. 4. Імуногенна композиція для собак за п. 2, в якій віріони парвовірусу атенуйовані. 5. Діагностичний набір для виявлення парвовірусу у домашніх собак і цуценят, диких псових, вовків, диких собак, домашніх кішок і кошенят, диких кішок, норок, червоних панд, лисиць, левів, тигрів, тварин зоопарків або захищених територій, тварин дослідних центрів, що містить молекули, специфічні для виявлення парвовірусу у домашніх собак і цуценят, диких псових, вовків, диких собак, домашніх кішок і кошенят, диких кішок, норок, червоних панд, лисиць, левів, тигрів, тварин зоопарків або захищених територій, тварин дослідних центрів, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка вибрана з групи, що складається з: послідовності нуклеїнової кислоти CTG кодону 431 SEQ ID NO:2, що кодує послідовність білка VP-2 парвовірусу, де кодон 431 кодує Leu; і послідовності нуклеїнової кислоти GCA кодону 440 SEQ ID NO:4, що кодує послідовність білка VP-2 парвовірусу, де кодон 440 кодує Ala. 6. Діагностичний набір за п. 5, в якому молекули є олігонуклеотидними праймерами. 7. Діагностичний набір за п. 5, що додатково містить молекули, специфічні для виявлення a) однієї або декількох послідовностей нуклеїнових кислот, вибраних з групи, що складається з SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:3; або b) амінокислотних послідовностей, що кодуються однією або декількома послідовностями нуклеїнових кислот, які вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:3. 8. Імуіногенна композиція для собак за п. 1, де вказана нуклеотидна послідовність являє собою SEQ ID NO:2. 9. Імуіногенна композиція для собак за п. 1, де вказана нуклеотидна послідовність являє собою SEQ ID NO:4. 10. Імуногенна композиція для собак за п. 1, де вказана послідовність нуклеїнової кислоти, яка щонайменше на 95 % гомологічна SEQ ID NO:2, є на 99 % гомологічною SEQ ID NO:2. 11. Імуногенна композиція для собак за п. 1, де вказана послідовність нуклеїнової кислоти, яка щонайменше на 95 % гомологічна SEQ ID NO:4, є на 99 % гомологічною SEQ ID NO:4. 12. Діагностичний набір за п. 5, в якому вказані молекули є нуклеїновими кислотами, здатними до гібридизації. 13. Діагностичний набір за п. 5, в якому послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність білка VP-2, являє собою SEQ ID NO:2. 17 UA 102999 C2 5 10 15 14. Діагностичний набір за п. 5, в якому послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність білка VP-2, являє собою SEQ ID NO:4. 15. Діагностичний набір для виявлення парвовірусу в домашніх собак і цуценят, диких псових, вовків, диких собак, домашніх кішок і кошенят, диких кішок, норок, червоних панд, лисиць, левів, тигрів, тварин зоопарків або захищених територій, тварин дослідних центрів, що містить антитіла, які специфічно звязуються з послідовністю білка VP-2, що кодується SEQ ID NO:4, яка містить Ala в положенні 440, для виявлення парвовірусу у домашніх собак і цуценят, диких псових, вовків, диких собак, домашніх кішок і кошенят, диких кішок, норок, червоних панд, лисиць, левів, тигрів, тварин зоопарків або захищених територій, тварин дослідних центрів. 16. Діагностичний набір за п. 15, в якому антитіла є моноклональними антитілами. 17. Вакцинна композиція проти парвовірусу, що містить один або декілька варіантів CPV, де ступінь нейтралізації вказаних одного або декількох варіантів CPV щонайменше в 4 рази нижче ступеня нейтралізації одного або декількох варіантів CPV, вибраних із групи, що складається з CPV-2, CPV-2a, CPV-2b і CPV-2с. 18. Імуногенна композиція, що містить один або декілька варіантів CPV, де ступінь нейтралізації вказаних одного або декількох варіантів CPV щонайменше в 4 рази нижче ступеня нейтралізації одного або декількох варіантів CPV, вибраних із групи, що складається з CPV-2, CPV-2a, CPV2b і CPV-2c. 18 UA 102999 C2 19 UA 102999 C2 20 UA 102999 C2 21 UA 102999 C2 Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 22