Нуклеїнова кислота, яка при експресії в рослині або в рослинній клітині призводить до збільшення вмісту трегалози, спосіб одержання рослини з підвищеною здатністю до продукування трегалози, рекомбінантна геномн

1. Нуклеиновая кислота, которая при ее экспрессии в растении или в растительной клетке приводит к увеличению содержания трегалозы в указанном растении или в растительной клетке, причем указанная нуклеиновая кислота включает последовательно: область инициации транскрипции, которая является функциональной в указанном растении-хозяине, ДНК-последовательность, кодирующую трегалозофосфатсинтазу Е. Coli и необязательно последовательность терминации транскрипции, которая является функциональной в указанном растении-хозяине. 2. Нуклеиновая кислота по п. 1, отличающаяся тем, что указанная ДНК-последовательность кодирует трегалозофосфатсинтазу, представленную аминокислотной последовательностью, обозначенной SEQ ID № 3. 3. Нуклеиновая кислота по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная ДНК-последовательность кодирует трегалозофосфатсинтазу и содержит открытую рамку считывания гена otsA Е. Coli в том виде, в каком она присутствует в pMOG799, депонированной в Центральном коллекторе культур Central Bureauvoor Schimmelcultures под входящим № 43093. 4. Нуклеиновая кислота по одному из пп. 1-3, отличающаяся тем, что указанный сайт инициации транскрипции содержит промоторную область 35S РНК, кодирующей ДНК вируса мозаики цветной C2 (54) НУКЛЕЇНОВА КИСЛОТА, ЯКА ПРИ ЕКСПРЕСІЇ В РОСЛИНІ АБО В РОСЛИННІЙ КЛІТИНІ ПРИЗВОДИТЬ ДО ЗБІЛЬШЕННЯ ВМІСТУ ТРЕГАЛОЗИ, СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ РОСЛИНИ З ПІДВИЩЕНОЮ ЗДАТНІСТЮ ДО ПРОДУКУВАННЯ ТРЕГАЛОЗИ, РЕКОМБІНАНТНА ГЕНОМНА ДНК РОСЛИНИ, ШТАМ E. COLI, СПОСІБ ЗБЕРЕЖЕННЯ РОСЛИНИ, СПОСІБ ОД ЕРЖАННЯ ТРЕГАЛОЗИ 39958 Настоящее изобретение относится к модификации углеводного метаболизма растений с применением техники рекомбинантной ДНК, к самой рекомбинантной ДНК с целью ее использования для такой модификации, а также к растениям и частям растений, обладающим измененной генетической конституцией. Упомянутые растения могут быть использованы для экстрагирования из них определенных соединений углеводной природы или, альтернативно, они могут быть подвержены обработке для получения пищевых продуктов, кормов или их ингредиентов, которые будут характеризоваться улучшенными свойствами в связи с присутствием в процессе их приготовления упомянуты х углеводных соединений. Трегалоза представляет собой общее название, данное D-глюкозил-D-глюкозидам, которые включают дисахариды, построенные на основе двух молекул глюкозы, соединенных a-, a,b- и b,bсвязями. Трегалоза, и в особенности a-трегалоза 1-(О-a-D-глюкопиранозил)-1'-О-a-D-глюкопираноза), представляет собой широко распространенный натуральный дисахарид. Химический синтез трегалозы весьма сложен (требуется введение защищающих гр уппировок) и неэффективен. В настоящее время в качестве естественного источника трегалозы используют грибы и дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые обладают способностью аккумулировать свыше 10% своего сухого веса в виде трегалозы. Однако получение трегалозы затруднено высокой активностью трегалозы, которая приводит к быстрому метаболизму трегалозы. Элбейн (Elbein A.D., adv. Carbohydrate Chem. and Biochem., 1974, 3, 227256) приводит в своем обзоре данные по встречаемости и метаболизму в живых организмах дисахарида трегалозы, в частности, a,a-трегалозы. В растительном мире наличие трегалозы было показано у некоторых видов низших растений, а также у множества видов высших растений, принадлежащих к семенным растениям; bchinops persicus; Carex brunescens; Fagus silvaticus. Однако эти результаты не были ни разу подтверждены другими авторами (Kendall et al., Phytochemistry, 1990, 29, № 8, 2525-2528). Так, например, в указанной выше публикации Кендалл с соавт., говоря о встречаемости трегалозы в семенных растениях, отмечает, что наличие ее было точно подтверждено только в случае семян тмина обыкновенного (Carum carvi). Сообщение о наличии трегалозы в подсолнечнике (Cegla et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 1977, 54, 150 et seg.) было оспорено Кандлером с сотр. (Kandler et al., in: Fhe Biochemistry of Plants, vol. 3: Carbohydrates: Structure and Functions; Preiss, J. ed. p. 228, Academic Press), согласуясь с данными Кендалла и сотр. (Kendall et al., 1990, выше). Сообщение о нахождении трегалозы в буке (Fagus silvaticus) и капусте также не было подтверждено другими авторами (Kendall et al., 1990, приведенная выше публикация, а также содержащиеся в ней ссылки). Несмотря на очевидную редкую встречаемость трегалозы в высших растениях, имеются сообщения о наличии деградирующей активности в отношении трегалозы в значительном числе исследованных семейств растений. Стабильная вы сокая трегалозная активность была обнаружена в трех линиях п шеницы, сосне бангковой и Slaginella lepidophilla. Стабильная низкая трегалазная активность была найдена в люцерне, черной мексиканской сахарной кукурузе и канадской сосне. Лабильная, умеренная активность была обнаружена в двух различных суспензияхканолы (canola), однако, по-видимому, она не имеет отношения к специфической трегалазной активности. Ячмень, костер, соя культурная и черная ель, как было показано, вовсе не содержит трегалозной активности (Kendall, 1990, выше). Считается, что в организмах, способных к образованию трегалозы, биосинтез ее проводится через образование 6-фосфата, тогда как формой для ее хранения является свободный сахар. В этой связи есть основания полагать, что организмы, способные продуцировать и/или хранить трегалозу, содержат фосфатазу, способную к расщеплению трегалозо-6-фосфата (Еl bein, 1974, выше). Однако относительно наличия специфических трегалозо-фосфат-фосфатаз в высши х растениях известно также очень немного. В заявке на Международный патент WO 93/17093 A1, опубл. 2 сентября 1993 г., описывается образование трегалозы в дрожжах, трансгенных относительно дрожжевых генов, кодирующих трегалозо-фосфат-синтазу. Было высказано предположение, что трегалоза может также образовываться в высших растениях с использованием таких дрожжевых генов, однако, упомянутая заявка не содержит настоящего раскрытия вопроса продукции трегалозы в растениях. При этом было отмечено, что WO 93/17093 А1 была опубликована раньше даты подачи заявки, однако после наступления приоритетной даты заявки. Настоящее изобретение относится к способу получения трегалозы в растении-хозяине, связанному с наличием в упомянутом растении-хозяине гена, экспрессируемого в растении, который включает в своей последовательности: (а) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (б) последовательность ДНК, кодирующую активность трегалозо-фосфат-синтазы, и факультативно (в) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине. Другой вариант изобретения относится к продуцированию в высших растениях трегалозы в связи с наличием в упомянутом растении-хозяине экспрессируемого в растении гена, который включает в своей последовательности: (г) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (д) последовательность ДНК, кодирующую активность трегалозо-фосфат-синтазы, и факультативно (е) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине, а также ген, экспрессируемый в растении, который включает в своей последовательности: а) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; 2 39958 (б) последовательность ДНК, кодирующую последовательность РНК, которая, по крайней мере, частично, комплементарна последовательности РНК, кодирующей фермент сахарозо-фосфатсинтазу (СФС), встречающийся в естественных условиях в упомянутом растении-хозяине, и факультативно (в) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине. Еще один вариант изобретения относится к продуцированию трегалозы в растении-хозяине в связи с наличием в упомянутом растении-хозяине экспрессируемого в растении гена, который включает в своей последовательности: (г) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (д) последовательность ДНК, кодирующую активность трегалозо-фосфат-синтазы, и факультативно (е) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине, а также ген, экспрессируемый в растении, который включает в своей последовательности: (а) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (б) последовательность ДНК, кодирующую последовательность РНК, которая, по крайней мере, частично, комплементарна последовательности РНК, кодирующей фермент АДФ-глюкозопирофосфорилазу, встречающийся в естественных условиях в упомянутом растении-хозяине, и факультативно (в) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине. Еще один вариант изобретения включает продуцирование трегалозы в растении-хозяине в связи с наличием в упомянутом растении-хозяине экспрессируемого в растении гена, который включает в своей последовательности: (а) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (б) последовательность ДНК, кодирующую активность трегалозо-фосфат-синтазы, и факультативно (в) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине, а также ген, экспрессируемый в растении, который включает в своей последовательности: (г) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (д) последовательность ДНК, кодирующая последовательность РНК, которая, по крайней мере частично, комплементарна последовательности РНК, кодирующей фермент сахарозо-фосфатсинтазу, встречающийся в естественных условиях в упомянутом растении-хозяине, и факультативно (е) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине, а также ген, экспрессируемый в растении, который включает в своей последовательности: (ж) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (з) последовательность ДНК, кодирующую последовательность РНК, которая, по крайней мере частично, комплементарна к последовательности РНК, кодирующей фермент АДФ-глюкозопирофосфорилазу, встречающийся в естественных условиях в упомянутом растении-хозяине, и факультативно (и) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине. Изобретение относится также к экспрессируемым в растениях генам, которые используются в процессе получения трегалозы, равно как и к различным сочетаниям экспрессируемых в растениях генов, а также к клонируемым плазмидам, к применяемым для трансформации векторам, микроорганизмам, индивидуальным растительным клеткам, несущим, в соотве тствии с настоящим изобретением, экспрессируемые в растениях гены. Изобретение относится, кроме того, к рекомбинантной геномной ДНК из растений, которая содержит экспрессируемый в растении ген трегалозо-фосфат-синтазы, который не является для него естественным. Изобретение также включает в свои рамки рекомбинантную геномную ДНК из растений, которая содержит экспрессируемый в растении ген трегалозо-фосфат-синтазы, который не является для него естественным, а также экспрессируемый в растении ген, способный привести к ингибированию биосинтеза активной СФС, и/или экспрессируемый в растениях ген, способный привести к ингибированию биосинтеза активной АГФ-азы. Изобретение относится, кроме того, к способу получения растения, подходящего для применения с целью продуцирования трегалозы, который включает следующие стадии: (1) введения в реципиентную растительную клетку экспрессируемого в растении гена, который включает в своей последовательности: (а) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (б) последовательность ДНК, кодирующую активность трегалозо-фосфат-синтазы, и факультативно (в) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине, а также ген, экспрессируемый в растении, который включает в своей последовательности: (г) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (д) последовательность ДНК, кодирующую селективный ген-маркер, функционирующий в упомянутом растении-хозяине, и факультативно (е) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине, и (2) выращивания растения из трансформированной клетки в условия х, позволяющих проводить отбор в присутствии отобранного маркерного гена. Изобретение относится также к растениям, которые в результате генетической модификации продуцируют трегалозу (имеют повышенный уровень ее). 3 39958 Кроме того, изобретение охватывает растения, имеющие геномную рекомбинантную ДНК, которая содержит, в соответствии с настоящим изобретением, экспрессируемый в растениях ген. Настоящее изобретение относится также к растениям, имеющим в геноме рекомбинантную ДНК, содержащую экспрессируемый в растениях ген, и которые продуцируют трегалозу. Изобретение относится также к растениям, имеющим геномную рекомбинантную ДНК, содержащую экспрессируемый в растениях ген, и которые обладают повышенной засухоустойчивостью. Кроме того, настоящее изобретение относится к тем частям растений, которые укладываются в рамки настоящего изобретения, таким, как клетки или протопласты, или их культуры, цветы, фр укты, листья, пыльца, корни (включая культуры, имеющие корни с корневыми волосками), семена, стебли, клубни (включая так называемые микроклубеньки) и другие. Изобретение включает также в свои рамки способ консервирования растений или частей растений в присутствии трегалозы, который включает следующие стадии: (1) выращивания, в соответствии с настоящим изобретением, растения, которое продуцирует трегалозу; (2) сбора растений или частей растений, которые содержат трегалозу, и (3) воздушной сушки растений или частей растений или альтернативно (4) лиофильной сушки растений или частей растений. Кроме того, изобретение относится к растениям или частям растений, которые могут быть сохранены с помощью метода, раскрытого в настоящем изобретении. Кроме того, изобретение включает способ продуцирования трегалозы, который включает стадии: (1) выращивания растения, которое благодаря присутствию геномной рекомбинантной ДНК, способно к продуцированию трегалозы (повышенных уровней ее), (2) сбора упомянутых выше растений или частей растений, (3) выделения трегалозы из упомянутых выше растений или упомянутых частей растений. Изобретение также относится к способу продуцирования трегалозы, который включает стадии: (1) выращивания культуры растительных клеток, которые благодаря присутствию в клетках геномной рекомбинантной ДНК, способна к продуцированию трегалозы (повышенных уровней ее), (2) выделения трегалозы из упомянутой культуры растительных клеток. Изобретение, кроме того, относится к выделенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей активность трегалозо-фосфатсинтазы. Предпочтение среди таких выделенных последовательностей нуклеиновых кислот отдается последовательности, выделенной из E. Coli, а наиболее предпочтительной является последовательность, отраженная в SEQID NO:2. Др угой предпочтительный вариант включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, отраженную в SEQID NO:3. Описанные ниже рисунки иллюстрируют приведенное изобретение. Фиг. 1. Схематическое изображение участков пути биосинтеза сахарозы и крахмала в накапливающи х тканях растений. На Рисунке показано, что углевод, полученный в листе в результате фотосинтеза, транспортируется затем в виде сахарозы через флоэмную ткань. При вхождении в сайт накапливания он расщепляется с помощью инвертазы, локализованной в ограничивающей мембране, с получением моносахаров - глюкозы и фруктозы. В результате прохождения различных стадий энзиматических реакций указанные моносахара превращаются в крахмал и/или сахарозу, как условно изображено на рисунке. При этом, повидимому, метаболиты глюкозы -Г-6-Ф и УДФГ используются как субстраты для ТФС фермента, возникающего в результате введения в растение с помощью генноинженерных методов экспрессируемого в растении гена otsA. На рисунке представлено, насколько повышается количество доступных в качестве субстратов Г-6-Ф и УДФГ при снижении уровня ферментов СФС и АГФ-азы. Их ингибирование выражено при гибридизации. Фиг 2. Полученная Кохара с сотр. (Kohara et al., 1987) схематическая карта ЕМВL 4 клона 77F11, содержащего ots ВА оперон из Е. Соlі. Вставка размером 18,8 kb закрашена. Указаны сайты рестрикции для рестрикционных эндонуклеаз EcoRV и Hind111, которые используются для клонирования гена оtsA, равно как и расстояния до них в kb относительно левого сайта вставки. Отмечены также гены otsA и В, а стрелки указывают направление транскрипции (см. фиг. 8, расширенная карта). Фиг. 3. Последовательность клонируемой кДНК для СФС из картофеля. Подчеркнуты: последовательности кДНК для СФС из кукурузы, использованные в качестве олигонуклеотидов в полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификации. Фиг. 4. С хематическое изображение бинарного вектора рМOG664. Фиг. 5. Рестрикционная карта участков рТі В6, показывающая два фрагмента, клонированных в рМОG579. Фиг. 6. Схематическое изображение рМОG579, используемого для конструирования в Agrobacterium, штамм MOG101, хелперной плазмиды без Т-региона. Фиг. 7. Схематическое изображение вектора экспрессии pMOG180. Фиг. 8. Полученная Кохара с сотр. (Kohara et al., 1987) расширенная карта EMBL 4 клона 7F11, содержащего otsBA оперон из E.coli. Указано также местоположение открытой рамки для считывания (ОРС) ТФС (*:Нind111 сайты не присутствуют на карте Кохара, ниже). Фиг. 9. С хематическое изображение бинарного вектора pMOG799. Фиг. 10. С хематическое изображение бинарного вектора рМОG801. Фиг. 11. С хематическое изображение бинарного вектора рМОG802. Предпочтительный вариант настоящего изобретения включает растение картофеля, способ 4 39958 ное продуцировать в своих клубнях трегалозу в связи с наличием в упомянутом растении картофеля экспрессируемого в растении гена, который включает в своей последовательности: (а) регион инициации транскрипции, привнесенный от 35S РНК ВТМ, фланкированный в верхнем направлении двойным энхансером, (б) последовательность ДНК, кодирующую треглозо-фосфат-синтазу в гене otsA, локализованном на otsBA опероне Е. Соli, (в) последовательность терминации транскрипции, полученную на основе нопалинсинтазного (nos) гена из Agrobacterium. Клубни трансгенных растений, содержащих экспрессируемый в растениях ТФС ген, продуцируют трегалозу, то гда как контрольные растения, не имеющие такого гена, ее не образуют. Очевидно, что трегалозо-фосфат, образуемый трансгенными клубнями, превращается затем в трегалозу. Очевидно также, что нет необходимости во введении извне трегалозофосфа т фосфа тазной активности, поскольку она, по всей видимости, имеется в растениях картофеля. На фиг. 1 также проиллюстрирован подход, примененный для улучшения доступности субстрата для ТФС. При этом два гена, оказывающие влияние на доступность глюкозо-6-ф (Г-6-Ф) и УДФГ, подвергли клонированию вместе с антисмысловым СФС геном и антисмысловой АФГазой под контролем 35S промотора ВТМ с целью экспрессии в растении-хозяине. При введении его в растение-хозяин, содержащее, в соответствии с настоящим изобретением, экспрессируемый в растении ТФС ген, повышается доступность субстрата для ТФС, а отсюда также увеличивается уровень синтеза трегалозы. Для любого специалиста со средним уровнем знаний в данной области очевидно, что др угие антисмысловые гены также могут находить применение для блокирования синтеза сахарозы или крахмала, с целью улучшения доступности субстрата. Несмотря на то, что изобретение содержит подробное описание применительно к растениям картофеля, которые содержат экспрессируемый в растении ген трегалозо-фосфат-синтазы из Е. Соli под контролем 35S промотора ВТМ, выполняющего функцию региона инициации транскрипции, каждому специалисту со средним уровнем знания в данной области ясно, что и другие семенные растения-хозяева так же подходят для целей продуцирования трегалозы. Среди семенных растений предпочтительными являются Angiospermae, а именно: Dicotyledoneae, включающие, в том числе, в качестве репрезентативного семейства Solanaceae, а также Monocotyledoncae, включающие, в том числе, Graminae в качестве репрезентативного семейства. К подходящим растениямхозяевам относятся, в контексте настоящего изобретения, растения (а также части и клетки упомянуты х растений) и их потомство, генетически модифицированные с применением техники рекомбинантной ДНК с целью индукции или повышения до нужного уровня продукции трегалозы в том или ином растении или органе растения; эти растения могут быть использованы либо непосредственно (в случае тех видов растений, которые продуцируют ее в съедобных частях), либо после очистки трегалозы из упомянутого растения-хозяина (которая может быть выделена как из съедобных, так и несъедобных растений-хозяев). Зерновые со съедобными частями включают, в соответствии с настоящим изобретением, те растения, которые имеют в качестве съедобных частей цветы, такие, как подсолнечник (Brassica oleraceae), артишок (Cynara Scolymus), фрукты, такие, как яблоки (Malus, в т.ч. domestica), бананы (Musa, в т.ч. acuminata) ягоды (такие, как смородина, Ribes в т.ч. rubrum), вишни (такие, как черешня, Prunus, в т.ч. a vium), огурцы (Cucumis, в т.ч. sativus), виноград (Vitis, в т.ч. vinifera), лимоны (Citrus limon), дыня (Cucumis melo), орехи (такие, как грецкий орех, Juglans, в т.ч. regia; арахис, Arachis hypogeac), апельсины (Citrus, в т.ч. maxima), персики (Prunus, в т.ч. persica), груши (Pyra, в т.ч. communis), перец (Solanum, в т.ч. capsicum), сливы (Prunus, в т.ч. domestica), земляника (Fragaria, в т.ч. moschata), томаты (Lycopersicon, в т.ч. esculentus), листья, такие, как люцерна (Medicago sativa), капуста (такие, как Brassica oleraceae), цикорный салат (Cichoreum в т.ч. endivia), лук-порей (Allium porrum), латук (Lactuca sativa), шпинат (Spinacia oleraceae), табак (Nicotiana tabacum), корни, такие, как маранта (Maranta arundinacea), свекла (Beta vulgaris), морковь (Daucus carota), маниок (Manihot esculenta), репа (Brassica rapa), редис (Raphanus sativus), ямс (Dioscorea esculenta), батат (Ipomoea batatas), и семена, такие, как бобы (Phascolus vulgaris), горох (Pisum sativum), соя культурная (Glycin max), пшеница (Jriticum aestivum), ячмень (Hordeum vulgare), кукуруза (Zea mays), рис (Oryza sativa), клубни, такие как кольраби (Brassica oleracece), картофель (Solanum tuberosum) и др. Съедобные части растений могут быть сохранены высушиванием в присутствии повышенных количеств трегалозы, образованной в них в связи с наличием экспрессируемого в растении, гена трегалозо-фосфатсинтазы. Это может быть использовано для продуцирования повышенных уровней трегалозы, посредством подведения ДНК, кодирующей активность ТФС, под контроль промотора, специфичного для органа или ткани растения; при этом выбор метода такого введения может быть легко сделан любым специалистом, обладающим средним уровнем знаний в данной области. При этом может быть использован любой ген трегалозо-фосфат, синтазы, функционирующий под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии ДНК, специфической или конститутивной, в растительных клетках, главное, что должно приниматься во внимание, это способность продуцировать активный фермент трегалозо-фосфат-синтазу. Н уклеотидная последовательность нуклеиновой кислоты представлена на SEQID NO:2, при этом любая открытая рамка считывания, в соответствии с настоящим изобретением, может быть изменена, что не сопровождается обязательными изменениями в аминокислотной последовательности кодируемого белка. Этот факт объясняется вырожденностью генетического кода. Так, открытая рамка считывания, кодирующая активность трегалозо-фосфат-синтазы, может 5 39958 быть адаптирована к выбору используемого в растении-хозяине кодона. Для идентификации активности трегалозофосфа т-синтаз в других организмах и далее для выделения этих ферментов может быть также использована нуклеиновая кислота, последовательность которой представлена на SEQID NO:2, при этом для упомянутого выделения используется техника гибридизации ДНК из таких источников с ДНК- или РНК фрагментом, выделенным из гена E. Coli. Предпочтительно провести скрининг таких последовательностей ДНК в ходе гибридизации при строгом соблюдении определенных условий (таких, как температура и ионная сила гибридизационной смеси). Природа гибридизации (т.е. состав смеси: ДНК: ДНК, или ДНК: РНК, или РНК: РНК), а также длина наименьшего вводимого в гибридизационную смесь фрагмента определяют, есть ли необходимость в поддержании в ходе нее строгого режима. При этом каждый специалист со средним уровнем знаний в данной области может без труда установить необходимый для каждого конкретного случая режим гибридизации. В качестве источника для выделения активной трегалозо-фосфат-синтазы могут использоваться микроорганизмы (бактерии, дрожжи, грибы), растения, животные и др. Выделенные из других источников последовательности ДНК, которые кодируют трегалозо-фосфат-синтазную активность могут быть использованы аналогичным образом с применением метода продуцирования трегалозы в соответствии с настоящим изобретением. Изобретение также включает в свои рамки те последовательности нуклеиновых кислот, которые были получены в результате модификации последовательности нуклеиновой кислоты, отображенной на SEQID NO:2 за счет мутации одного или более кодонов, что приводит к изменению аминокислотной последовательности в кодируемом белке, если только такая мутация, затрагивающая аминокислотную последовательность, не устраняет полностью активность трегалозо-фосфатсинтазы. В принципе, по методу настоящего изобретения может быть использовано любое растениехозяин в сочетании с любым экспрессируемом в растении геном трегалозо-фосфат-синтазы. При доступности в др угих источниках трегалозных генов эти источники также могут использоваться для получения описываемой комбинации их с экспрессируемым в растении трогалозо-фосфатсинтазным геном. Приведенные в примерах настоящего изобретения результаты ингибирования эндогенного гена сахарозо-фосфат-синтазы и гена АДФ-глюкозопирофосфорилазы показывают, что ингибирование эндогенных генов с целью повышения доступности субстрата может быть проведено с использованием большого числа способов, выбор которых не представляется существенным для настоящего изобретения. Предпочтительным способом для достижения ингибирования гена является так называемый "антисмысловой подход". В этом случае на основе последовательности ДНК получают РНК, которая хотя бы частично комплементарна той РНК, которая кодирует ту энзиматическую активность, которую предстоит блокировать (т.е., в наши х примерах, АГФ-азу или СФС). При этом предпочтительно использовать гомологичные антисмысловые гены, поскольку они более эффективны, чем гетерологичные гены. Выделение антисмыслового СФС гена из картофеля с использованием последовательности СФС-гена из кукурузы в качестве пробы дает представление о применимости этой стратегии. При этом не следует полагать, что для практического применения способа настоящего изобретения необходимы гомологичные антисмысловые фрагменты. Альтернативным способом блокирования синтеза нежелательных энзиматических активностей является введение в геном растения-хозяина дополнительно копии гена, уже имеющегося в растениихозяине. Нередко отмечалось, что такая дополнительная копия гена заглушает эндогенный ген: это явление известно в литературе как сосупрессивный эффект, или как ко-супрессия. В принципе, и двудольные, и однодольные растения, поддающиеся трансформации, могут быть модифицированы за счет введения, в соответствии с настоящим изобретением, в реципиентную клетку экспрессируемого в растении гена и выращивания нового растения, которое несет в себе и экспрессирует данный ген. В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительными являются те растения, которые способны осуществлять превращение трегалозо-фосфата в трегалозу и которые либо вовсе не содержат, либо содержат на очень низком уровне деградирующую активность в отношении трегалозы. Тем не менее, растения, которые не обладают способностью превращать трегалозо-фосфат в трегалозу, также входят в рамки настоящего изобретения. Эти растения могут быть далее модифицированы за счет введения дополнительных генов, которые кодируют фосфатазы, и которые, в свою очередь, осуществляют превращение трегалозо-фосфата в трегалозу. В принципе, настоящее изобретение относится также к растениям, содержащим трегалазы, поскольку такие растения могут представлять удобную возможность для продуцирования трегалозы посредством ингибирования активности таких ферментов, например, за счет ингибирования экспрессии генов, кодирующи х трегалазы, с использованием "антисмыслового подхода". Способ введения в реципиентную растительную клетку экспрессируемого в растении гена трегалозо-фосфат-синтазы не важен для настоящего изобретения, существенно только, чтобы при этом произошло стабильное включение гена в геном упомянутого растения. Кроме использования штаммов рода Agrobacterium, применима также другая техника для целей введения ДНК в растительные клетки, в частности, трансформация протопластов с помощью кальций/полиэтиленгликолевого метода, электропорация и микроинъекция, а также бомбардировка частицами (покрытыми оболочкой) (Potrycus, Bio/Technol., 1990, 8, 535-542). В дополнение к методам так называемой непосредственной трансформации ДНК, широко применяются системы трансформации на основе векторов, таких, например, как вирусные векторы [в частности, вектор из вируса табачной мозаики (ВТМ, CaMV)] и бактериальные векторы (в частно 6 39958 сти, из бактерий рода Agrobacterium) (Potrycus, Bio/Technol., 1990, 8, 535-542). После проведения селекции и/или скрининга на основе тех клеток или частей растений, которые были трансформированы, может быть регенерировано целое растение, с использованием для этого известных в технике методов (Horsch et al., Science, 1985, 225, 1229-11231). Было показано, что однодольные растения могут быть трансформированы, и при этом из трансформированных клеток можно получить фертильные трансгенные растения. Развитие систем культур репродуцирующи хся тканей для таких растений в совокупности с имеющимися мощными методами введения генетического материала в растительные клетки позволили упростить процесс трансформации. В настоящее время среди методов трансформации однодольных растений предпочтение отдается бомбардировке микрочастицами эксплантата или суспензии клеток, а также непосредственному введению ДНК или электропорации (Shimamoto et al., Nature, 1989, 338, 274276). Так, трансгенные растения кукурузы были получены при введении bar-гена Streptomyces hydroscopicus, который кодирует фосфинотрицинацетилтрансферазу (фермент, инактивирующий гербицид фосфинотрицин) в эмбриогенные клетки культуральной суспензии клеток кукурузы в случае бомбардировки их микрочастицами (Gordon – Kamm, Plant Cell, 1990, 2, 603-618). В литературе уже имеются сообщения о введении генетического материала в алейроновые протопласты других однодольных растений, таких, как пшеница и ячмень (Lee, Plant Моl. Biol., 1989, 13, 21-30). Растения пшеницы были регенерированы из эмбриогенной культуральной суспензии за счет отбора только постаревших тканей компактного и узелкового каллюса с целью получения эмбриогенных суспензионных культур (Vasil, Bio/Technol., 1990, 8, 429-434). При сочетании их с соответствующими системами трансформации для этих культур возможно применение настоящего изобретения к однодольным растениям. Кроме того, эти методы применимы также для целей трансформации и регенерации двудольных. Однодольные растения, включающие коммерчески важные культуры, такие, как зерновые, пригодны для использования с целью введения в них ДНК с помощью штаммов Agrobacterium (Европейский патент 159418 В1; Yould J., Michael D., Hasegama O., Ulian BC., Peterson Y., Smifh RH, Plant Physiol., 1991, 95, 426-434). Относительно выбора растения-хозяина следует отметить, предпочтительность тех видов растений, которые содержат невысокую деградирующую активность в отношении трегалозы, либо вовсе не содержат ее. Однако растения, проявляющие трегалозную активность, не исключаются из числа тех растений-хозяев, которые пригодны для продуцирования трегалозы, но в этом случае, если указанная активность мешает накоплению трегалозы, необходимо добиться ингибирования трегалазы. Такое ингибирование может быть получено с применением известного в технике "антисмыслового подхода", который проиллюстрирован в настоящем описании с различными целями. Следует отметить, что изобретение не ограничивается использованием только 35S промотора ВТМ в качестве региона инициации транскрипции. Могут также применяться подходящие для целей контроля экспрессируемых в растении генов последовательности ДНК, которые включают, в том числе, гены-маркеры, такие, как регионы инициации транскрипции, энхансеры, нетранскрибируемые лидеры и др., которые могут быть получены из любого экспрессируемого в растении гена, таких, как, например, эндогенные гены растений, гены, экспрессируемые в растительных клетках в естественных условиях, в частности, те, которые локализованы на Т-ДНК Agrobacterium дикого типа, гены вирусов растений, а также эукариотические гены, которые включают регион инициации транскрипции, совпадающий с консенсусной последовательностью инициации транскрипции в эукариотических клетках. Изобретение относится также к гибридным промоторам, сочетающим в себе функциональные участки различных промоторов или их синтезированные эквиваленты. Кроме конститутивных промоторов, с целью контроля экспрессии экспрессируемых в растении генов, в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться индуцибельные промоторы либо промоторы, регулируемые каким-либо иным, т.е. зависимым от времени или специфичным для данных клеток, образом для поддержания соответствующего характера экспрессии, существенным является лишь способность их экспрессироваться в тех частях растений, которые содержат субстрат для ТФС. Для целей селекции или скрининга трансформированных клеток предпочтительно включать в систему для трансформации ген-маркер, связанный, в соответствии с настоящим изобретением, с экспрессируемым в растении геном, который переносится в растительную клетку. Выбор подходящего гена-маркера для проведения трансформации растительной клетки представляется делом техники, которое по силам любому специалисту со средним уровнем знаний в данной области; так, например, в качестве примеров таких традиционно используемых в экспериментах по трансформации генов-маркеров можно привести гены неомицинфосфотрансферазы, которые придают клеткам устойчивость к канамицину (ЕР-В 131 623), ген глютатион-S-трансферазы из печени крыс, который сообщает устойчивость к гербицидам, полученным на основе глютатиона (ЕР-А 256223), ген глютаминсинтетазы, который, определяя суперэкспрессию этого фермента, придает устойчивость к ингибиторам глютаминсинтетазы, таким, как фосфинотрицин (WO 87/05327), ген ацетилтрансферазы из Streptomyces viridochromodenes, который придает устойчивость к селективному агенту фосфинотритрицину (ЕР-А 275957), ген, кодирующий 5-энолшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), придающий толерантность к Nфосфонометилглицину, bar-ген, придающий устойчивость к Bialaphcs (WO 91/02071) и др. При этом выбор того или иного гена не существенен, если достигается его функционирование (причем селективное) в сочетании с выбранными растительными клетками. 7 39958 Ген-маркер и интересующий ген не должен быть обязательно связаны, поскольку показано, что при трансформации растений совместная трансформация несвязанных генов также может проходить успешно (патент США 4 399216). Предпочтительным материалом для трансформации, особенно в случае двудольных культур, являются листовые пластинки, которые могут быть легко трансформированы, а, кроме того, характеризуются высокой регенерирующей способностью (Horsch et al., Science, 1985, 227, 12291231). В том случае, когда продуцирование трегалозы достигается с применением экспрессируемого в растении трегалозо-фосфат-синтазного гена как единственного гена модификации углеводов, настоящее изобретение иллюстрируется примерами, включающими другие экспрессируемые в растении антисмысловые гены, способные воздействовать в плане повышения доступности субстрата для трегалозо-фосфат-синтазы. В качестве специфических примеров таких генов могут быть названы экспрессируемые в растении антисмысловые гены для СФС из кукурузы и картофеля, а также для АГФ-азы из картофеля. Даун-регуляция ферментов модификации углеводов с использованием антисмыслового подхода не ограничивается приведенными специфическими примерами. Так, например, экспрессируемые в растении антисмысловые гены, частично комплементарные к нужному гену, могут использоваться для ингибирования экспрессии гена-мишени, при этом экспрессируемый в растении антисмысловый ген продуцирует транскрипт, который является в достаточной степени комплементарным к транскрипту гена-мишени и достаточно длинным для целей ингибирования экспрессии упомянутого генамишени. Для настоящего изобретения не существенно, каким образом наличие двух или более генов в одном растении оказывает рассматриваемое воздействие. Это воздействие может быть достигнуто, в том числе, с применением одного из нижеследующих методов: (а) трансформации растительной линии полигенной конструкцией, содержащей для введения более одного гена; (б) совместной трансформации одновременно различными конструкциями одной и той же клеточной линии; (в) последовательных стадий трансформации одного и того же растения вводимыми генами; (г) скрещивания двух растений, каждое из которых содержит по отличающемуся друг от друга гену для целей введения в то же растение. Область применения настоящего изобретения охватывает как сельское хозяйство, так и садоводство, в частности, в связи с улучшением свойств растений, модифицированных по способу настоящего изобретения, равно как и ту область промышленности, где трегалоза применяется или может применяться. Трегалозо-фосфат и трегалоза могут применяться сами по себе в очищенном виде или в виде добавок, а также в виде продукта, запасенного для хранения в тех или иных частях растений. Части растений, несущие трегалозофосфа т или трегалозу (повышенные уровни этих продуктов) могут использоваться либо сами по себе, либо консервироваться, причем уже без добавления трегалозы. Трегалоза также может быть очищена из растений или частей растений, продуцирующи х ее, и затем применяться в процессах промышленной обработки. В пищевой промышленности трегалоза может использоваться путем добавления трегалозы к продуктам перед высушиванием. Высушивание продуктов представляет собой важный способ консервирования, применяемый в промышленности. При этом трегалоза, по всей видимости, наиболее полезна для консервирования пищевых продуктов с применением традиционной воздушной сушки, позволяя быстрое восстанавление продукта высокого качества при добавлении воды (Roser et al., July 1991, Trends in Food Science and Technology, pp. 166-169). Получаемый при этом положительный эффект включает сохранение естественных ароматических веществ/запаха, вк уса свежего продукта и питательной ценности (наличие белков и витаминов). Было показано, что трегалоза обладает способностью стабилизировать белки и мембраны, образуя при этом химически инертную, стабильную стеклоподобную массу. Низкое содержание воды в таких глубоко высушенных продуктах препятствуе т протеканию химических реакций, которые могли бы вызвать их порчу. Полевые сельскохозяйственные культуры, такие, как зерновые, маниок, картофель, сахарная свекла и сахарный тростник уже давно используются в качестве естественного источника для промышленного производства углеводов (крахмалов и сахарозы). Достижение цели продуцирования трегалозы такими видами растений, в которых с помощью генноинженерных методов был создан механизм биосинтеза трегалозы, дает основание для использования таких созданных генноинженерными методами культур растений с целью получения трегалозы. Все приведенные в настоящем описании ссылки указывают на тот уровень техники в данной области, к которому относится и настоящее изобретение. Все публикации, независимо от того, патенты это или любого другого рода материалы, которые уже цитировались или будут цитироваться в настоящем описании позже, включены в качестве ссылок. Приведенные ниже примеры даны лишь с целью облегчения понимания настоящего изобретения и никоим образом не нацелены на ограничение его области. Манипуляция с ДНК Все процедуры, проводившиеся с ДНК (выделение ДНК из E. Coli, рестрикция, лигирование, трансформация и т.д.), выполняются в соответствии со стандартно применяемыми для этого протоколами (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 1989, 2nd еd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York). Штаммы Во всех примерах для клонирования использовали E. Coli К-12, штамм DH5a. В экспериментах по трансформации растений использовали Agrobacterium tumefaciens штамм MOG101, который представляет собой неонкогенный хелперный 8 39958 штамм октопинового типа, полученный на основе L BA1010 (Koekman et al., Plasmid, 1982, 7, 119) посредством замещения Т-ДНК маркером устойчивости к спектиномицину. Конструирование штамма Agrobacterium MOG101 Для переноса генных конструкций в растения картофеля и табака была использована система на основе бинарного вектора (Hoekema A., Hirsch P.R., Hooykaas P.J.J., and Schilperoort R.A., Nature, 1983, 303, 179). Хелперную плазмиду, придающую Agrobacterium tumefaciens вирулентность, получают из октопиновой Тi-плазмиды рТiВ6, МОG101 представляет собой штамм Agrobacterium tumefaciens, который несет неонкогенную Tiплазмиду (Koekman et al., 1982, приведенная выше ссылка), из которой был полностью удален Трегион и замещен бактериальным маркером устойчивости к спектиномицину, полученным из транспозона Тn 1831 (Hooykaas et al., Plasmid 1980, 4, 64-75). Ti -плазмида pТiВ6 содержит два смежных Трегиона - TL (Т-левый) и TR (Т-правый). Для получения производной плазмиды, не содержащей TLи TR-регионов был сконструирован промежуточный вектор pMOG-579. Плазмида pMOG579 представляет собой производную от плазмиды pBR322, которая содержит 2 фрагмента Тіплазмиды, гомологичных к фрагментам, локализованным слева и справа от Т-регионов в рTi B6 (затененные участки на фиг. 5 и 6). Эти два фрагмента на плазмиде pMOG579 разделяются BamHIHind111 фрагментом из транспозона Tn 1831 размером в 2,5 kb (Hooykaas et al., Plasmid, 1980, 4, 64-75), несущим маркер устойчивости к спектиномицину (фиг. 6). Плазмиду вводят в Agrobacterium tumefaciens, штамм LBA1010 [С58-С9 (рТi В6) = обработанный штамм С58, в который введена рТi В6 (Koekman et al., 1982, приведенная выше ссылка)] из E. Coli при проведении трех родительских скрещиваний с использованием в качестве хелпера НВ101 8pRK2013. Трансконъюгаты отбирают на основе устойчивости к рифампицину (20 мг/л) и спектиномицину (250 мг/л). Двойная рекомбинация между pMOG579 и рТі В6 приводит к потере устойчивости к карбенициллину (pBR322 маркер) и делеции целого Т-региона. Из 5000 репликтрансконъюгатов, обладающих устойчивостью к спектиномицину, при помещении на карбенициллин (100 мг/л) лишь две проявили к нему чувствительность. Саузерн-анализ (данные не приведены) показал, что в результате двойной гибридизации происходит делеция всего Т-региона. Полученный при этом штамм обозначается как МОG101. Этот штамм и конструкции, создаваемые на его основе аналогичны таковым относительно штамма GV2260 (Deblaere et al., Nucl. Asid Res., 1985, 13, 4777-4788). Альтернативным хелперным штаммом для MOG101 может быть LBA4404; этот штамм также может применяться для введения бинарной плазмиды, такой, в частности, как pMOG799, и последующей трансформации растения. Доступны также и другие подходящие хелперные штаммы. Конструирование вектора экспрессии pMOG180 Вектор экспрессии рМОG180 является производным от рМОG18 (ЕР 0479359 A1, пример 26), в котором ген, кодирующий GUS удален, а между РНК4 лидером ВМЛ (А1МV) и 3' nos терминатором могут быть вставлены другие гены в виде BamH1 фрагмента. С этой целью синтезируют EcoRl/NсоІ фрагмент MOG18, содержащий последовательности 35S промотора и РНК4 лидера ВМЛ (Al MV) с применением технологии ПЦР (полимеразной цепной реакции) со следующими праймерами: 5'ГТТТЦТАЦАГГАЦГГАГГАТЦЦТГГААГТАТТТГААА ГА 3' и 5' ЦАГЦТАТГ АЦЦАТГАТТАЦГ 3', что приводит к мутации Ncol сайта в BamH1 сайт. После этого рМОG18 вектор разрезают с помощью EcoR1 и BamH1, после чего может быть проведено лигирование по этим сайтам рестрикции свежесинтезированного EcoR1/BamH1 фрагмента. Для недопущения индукции в результате ПЦР случайных мутаций в промоторных последовательностях EcoR1l/EcoRV фрагмент в синтезированном после проведения ПЦР EcoR1/BamH1 фрагменте замещают последовательностями дикого типа из рМОG18. Проводят секвенирование короткого фрагмента EcoRV/BamH1 с целью проверки на наличие мутаций. Полученный вектор экспрессии представляет собой плазмиду рМОG180 (фиг. 7). Тройное скрещивание Бинарные векторы активируют при тройных скрещиваниях штамма E. Coli HB101, несущего плазмиду pRK2013 (Ditta Y., Stanfield S., Corbin D., and Helinski D.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, 7347) в Agrobacterium tumefaciens, штамм MOG101, и используют в этом виде для трансформации. Трансформация табака (Nicotiana tabacum SRI) Трансформацию табака проводят при совместном культивировании ткани растения со штаммом Agrobacterium tumefaciens MOG101 (Hoekema et al., Nature, 1983, 303, 179-180), содержащим интересующий бинарный вектор, как выше было описано. При этом для совместного культивирования с целью трансформации табака (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SRI) используют листовые пластинки табака по способу, описанному Хоршем с соавт. (Horsch et al., Science, 1985, 227, 1229-1231). Из побегов восстанавливают трансгенные растения при выращивании на селективной среде, содержащей либо канамицин, либо гигромицин, в зависимости от того, какой устойчивостью обладает присутствующий в бинарной плазмиде ген, затем окореняют растение и переносят на почву. Трансформация картофеля Трансформацию картофеля (Salanum tuberosum cv. Desiree) проводят штаммом Agrobacterium МОG101, содержащим интересующий бинарный вектор (Hoekema, A., Huisman M.J., Molendijk L., Van den Elgen P.J.M., and Cornelissen B.J.C., Bio/Technology, 1989, 7, 273). В качестве основной культуральной среды используют MS30R30, которая состоит из МS-среды (Murashige T., and Skoog F., Ph ysiol. Plan., 1962, 14, 473), дополненной сахарозой в количестве 30 г/л, R3 витаминами (Ooms Y., Burrell M.M., Karp A., Bevan M., and Hille 9 39958 J., Theor. Appl. Yenet., 1987, 73, 744), 5 мкМ зеатин рибозида (3Р) и 0,3 мкМ индолуксусной кислоты (ИУК). При необходимости для затвердевания среды вносят 0,7 г/л агара (Daichin). Клубни Solanum tuberosum cv. Desiree очищают и подвергают поверхностной стерилизации в течение 20 минут в 0,6% растворе гипохлорита, содержащем 0,1% Твин-20. Картофель тщательно промывают в больших объемах стерильной воды в течение периода времени не менее двух часов. После этого нарезают диски толщиной примерно 2 мм из цилиндрических кусочков картофельной ткани, приготовленной с помощью пробкового бура. Диски инкубируют в течение 20 минут в суспензии, состоящей из МS30R3 среды без 3Р и ИУК, которая содержит в 1 мл 106-107 бактериальных клеток Agrobacterium MOG101, содержащи х бинарный вектор. Затем диски последовательно промакивают досуха о стерильную фильтровальную бумагу и переносят на твердую среду МS30R3, содержащую 3Р и ИУК. По прошествии 2 дней диски переносят на свежую среду, которая содержит 100 мг/л цефотаксима и 50 мг/л ванкомицина. Через неделю диски снова переносят на такую же среду, но с содержанием 100 мг/л канамицина для целей селекции трансгенных побегов. Через 4-8 недель срезают побеги, появившиеся из дисков и помещают их в среду для корнеобразования (среда MS30R3 без 3P и ИУК, но содержащая 100 мг/л цефотаксима и 100 мг/л канамицина). Побеги размножают аксенично меристемными срезами и переносят на почву после развития корней. Там, где это удобно, вместо 100 мг/л канамицина используют ги громицин в количестве 10 мг/л. Трансформацию картофеля сорта Кардал (см. Kardal) проводят в принципе так же, как и сорта Дезире (сv. Desiree), за исключением некоторых модификаций, а именно: фитогормоны в среде представлены в основной культуральной среде следующим образом: зеатин рибозид 3,5 мг/л; ИУК (индолуксусная кислота) 0,03 мг/л; используемая для трансформации суспензия Agrobacterium содержит от 105 до 106 бактерий на миллилитр; концентрация канамицина в среде для корнеобразования составляет 50 мг/л. Метод определения трегалозы Трегалозу определяют по методу Хоттигера с соавт. (Ноttiger еt al., J. Bact., 1987, 169, 5518). Ткань картофельных клубней замораживают в жидком азоте, растирают в порошок с помощью ступки и пестика и проводят последовательную экстракцию 500 мМ трихлоруксусной кислотой, примерно 3 объемами, в течение 60 минут при комнатной температуре. Полученный после центрифугирования твердый материал снова подвергают экстракции таким же способом. Полученные после двух экстракций объединенные супернатанты исследуют на наличие антрон-положительного материала (Spiro R.Y., Meth. Bugymol., 1966, 8, 3). Качественное определение трегалозы проводят методом ТСХ. Экстракты деионизируют (Мерк, ионнообменник V) и вносят на пластинки с силикагелем 60 (Мерк). После проведения хроматографии пластинки обрабатывают смесью н-бутанол пиридин-вода (15:3:2, объем/объем). Для визуализации пятен их опрыскивают 5 мг/мл валинина в концентрированной Н2SO4 и нагревают при температуре 130°С. В качестве стандарта используют коммерчески доступную трегалозу (Сигма). Альтернативно, трегалозу можно определить количественно методом анионообменной хроматографии с использованием импульсного амперометрического детектора. Для приготовления экстрактов добавляют 1 мл кипящей воды к 1 г замороженного материала, после чего полученную массу нагревают в течение 15 минут при температуре 100°С. Образцы (25 мкл) анализируют на жидкостном хроматографе Дионекс ДХ-100 (Dionex DX-100), снабженном колонкой карбопак РА-1 Дионекс 35391 размером 4 х 250 мм (Dionex 35391 Carbopac PA-1) и предварительной колонкой карбопак РА-1 Дионекс 43096 размером 4х50 мм (Dionex 43096 carbopac РА-1). Элюцию проводят 100 мМ NaOH со скоростью 1 мл/мин. Сахара обнаруживают с помощью импульсного амперометрического детектора (Дионекс, РАD-2). В качестве стандарта используют коммерчески доступную трегалозу (Сигма). Определение активности фермента Во всех определениях в качестве контроля используют нетрансгенный материал клубней или нетрансгенный материал табака. Содержание белка во всех образцах определяют по методу Брэдфорда (Brodbord, anal. Biochem., 1976, 72, 248). Для тестирования экстрактов клубней гомогенизируют замороженные ломтики картофельных клубней приблизительно по 100 мг весом в 100 мкл 20 мМ HEPES , рН 7,4 и центрифугируют (Эппендорф, 5 минут при максимальной скорости). Супернатант используют для тестирования активности. СФС активность СФС активность определяют по существу так, как это описано в литературе (Amir J. and Preiss., Plant Physiol., 1982, 69, 1027-1030). В зависимости от состава реакционной смеси, при его изменении, могут определяться две различные активные формы СФС; Vmax и Vsel. Для определения Vmax реакционная смесь в общем объеме, равном 50 мкл, содержит 3,2 мМ УДФ-глюкозы, 81 мкМ [14C]-УДФглюкозы, 3,2 мМ фр уктозо-6-фосфата, 16 мМ глюкозо-6-фосфата, 100 мМ HEPES, рН 7,4, 20 мМ MgCl2 и 5 мМ ЭДТА. При определении Vsel реакционная смесь содержит половинную концентрацию фр уктозо-6-фосфата и глюкозо-6-фосфата, кроме того, в нее вносится 5 мМ неорганического фосфата. В качестве контроля проводят определение СФС активности в Vmax реакционной среде без добавления фруктозо-6-фосфата и глюкозо-6фосфа та. Реакция проходит при комнатной температуре в течение 30 минут, затем ее останавливают нагреванием смеси до температуры 95°С в течение 5 минут. Продукты реакции обрабатывают щелочной фосфатазой, а полученную [14C]сахарозу отделяют от субстратов с помощью ионообменной хроматографии. Количество радиоактивно меченой сахарозы, образованной в ходе реакции, измеряют на сцинтилляционном счетчике. 10 39958 ТФС активность ТФС активность измеряют с применением способа, аналогичного таковому, описанному для СФС. После ионообменной хроматографии образцы содержат как дефосфорилированную сахарозу, так и трегалозу. Для определения того, какая часть в образованных продуктах представлена трегалозой, образцы разделяют методом ТСХ, как это уже было описано. Экстракты деионизируют (Мерк, ионообменник V) и наносят на пластинки с силикагелем 60 (Мерк). После хроматографирования пятна, содержащие [14C]-сахарозу и [14C]трегалозу, соскребают с пластинок и измеряют величину радиоактивной метки на сцинтилляционном счетчике. Активность АГФ-азы Активность АГФ-азы определяют по методу Мюллера-Ребера с соавт. (Мüller-Röber B., Sonnewald, U., and Willmitger, L., ЕМВО J., 1992, 11, 1229). Образование глюкозо-1-фосфата из АДФ-глюкозы определяют в НАД-сопряженной глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназной системе. Реакционная среда для тестирования содержит 80 мМ HEPES, РН 7,4, 10 мМ MgCl2, 1 мМ АДФглюкозы, 0,6 мМ Н АД, 10 мкМ глюкозо-1,6дифосфата, 3 м М ДТТ, 0,02% бычьего сывороточного альбумина, 1 ед. фосфоглюкомутазы из мышцы кролика (Сигма), 2,5 ед. НАД-сопряженной глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы из Leuconostoc mesenteroides и экстракт из клубней. Реакция запускается с момента добавления пирофосфата натрия до конечной концентрации 2 мМ. Восстановление НАД определяют спектрофотометрически, при длине волны 340 нм и при температуре 30°С. Единица активности АГФ-азы определяется как количество нмолей глюкозо-1-фосфата, образованных в минуту при температуре 30°С. Пример І Клонирование orsA гена E. Coli полной длины В Е. Coli трегалозо-фосфат-синтаза (ТФС) кодируется otsA геном, расположенным на опероне otsBA. Локализация и направление транскрипции этого оперона на хромосоме E. Coli уже известны (Kaasen J., Falkenberg P., Styrvold O.B., and Strom A.B., J. Bact., 1992, 174, 889). Ген otsBA локализован на 42' и, в соответствии с данными Каасена, охватывается фрагментом размером 18,8 kb в геномном клоне EMBL 4, обозначенном на карте Кохара в соавт. как 7F11 (Kohara Y., Aki yama K., and Isono K., Cell, 1987, 50, 495). Из лизата ламбда клона 7F11 получают ДНК, которую затем расщепляют рестриктазой Hind111. Выделенный Hind111 фрагмент размером 2,9 kb (как это уже было отмечено Каасеном с соавт., на карте Кохара с соавт. во вставке отсутствуе т "правая рука" НindІІІ сайта на расстоянии 14,3 kb) клонируют в рСU18, линеаризованном с применением НindІІІ. Далее проводят секвенирование HihdІІІ вставки размером 2,9 kb в полученной плазмиде, обозначенной pMOG674. Было показано, что последовательность содержит часть аrа H гена в опероне транспорта арабинозы (Scripture J.B., Voelker C., Miller S., O Donnell R.T., Polgar L., Rade J., Horagdovsky B.F., and Hogg R.W., J. Mol. Biol., 1987, 197, 137), otsB ген, кодирующий ТФФ, с той же локализацией, как и указывал Каасен с соавт., и часть otsA гена, кодирующего ТФС. Было пока зано, что, в от-личие от данных Каасена с соавт., otsА не ограничивается Hind111 фрагментом размером 2,9 kb. Для завершения характеристики последовательности был выделен и частично секвенирован перекрывающийся ВаmH1/EcoR1 фрагмент. Полная последовательность otsA гена, кодирующего ТФС, показана на SEQ1D NО:2. Положение оtsА гена в клоне 7F11, определенное на основании данных по сайтам рестрикции рестрикционных эндонуклеаз, показано на фиг. 8. Кроме того, на "левой руке" сайта в Hind111 фрагменте размером 2,9 kb был обнаружен дополнительный Hind111 сайт, не отмеченный на карте Кохара с соавт. В плазмиде pMOG180 Hind111 сайт был заменен Sst сайтом посредством клонирования олигонуклеотидного дуплекса: в рМОG180, разрезанной с использованием Ніhd111. Полученный вектор обозначен как pMOG746. Олигон уклеотидный дуплекс: клонируют в векторе рМОG746, линеризованном с помощью Ваm Н1. Вектор вместе с олигонуклеотидным дуплексом, ориентированным в нужном направлении (верность ориентации тестируется методом переваривания рестрикционными ферментами) обозначаются как рМОG747. Hind111 фрагмент плазмиды pMOG674 размером 2,9 kb клонируют в рМОG747, линеаризованной с применением Hind111, что приводит к образованию вектора pMOG748. Выделяют EcoRV/Sst1 и Sst1/Sma1 фрагменты pMOG748, размером соответственно около 2,4 kb и 3,5 kb, которые затем лигируют и трансформируют в Е. Соli, что приводит к делегированию Hind111 фрагмента размером 2,9 kb на 3' конце. Полученная плазмида обозначается как pMOG749. 5' конец otsA гена синтезируют методом ПЦР с использованием синтетических олигонуклеотидов ТФС1 и ТФС2, а также рМОG749 в качестве матрицы. Результаты секвенирования подтвердили, что ПЦР фрагмент размером 0,4 kb имеет верную последовательность. BamH1/Hind111 фрагмент рМОG749 размером 1 kb клонируют вместе с Хmal/BamH1 ПЦР фрагментом размером 0,4 kb в рМОG747, линеаризованном с применением Хmal и Hind111. В полученной плазмиде, после расщепления ее ферментами Hind111 и Sst1 клонируют синтетический дуплекс ТФSС/7, который кодирует три аминокислоты на С-конце ТФС. В полученной плазмиде, после расщепления ее 11 39958 рестриктазами Hind111 и Sst1, клонируют Hind111/Sst1 фрагмент размером 0,25 kb в плазмиде рМОG749, которая включает терминатор из нопалинсинтазного гена (NOS) Аgrobacterium tumefaciens что приводит к получению плазмиды pMOG798. Эта плазмида содержит otsА ген Е. Соli в правильной ориентации под контролем 35S промотора вируса табачной мозаики [ВТМ (CaMV)], содержащего двойной энхансер (Ynilley et al., Cell, 1982, 30, 763), РНК4 лидерную последовательность из вируса мозаики люцерны [ВМЛ (AMV)] (Brederode et al., Nucl Acids Res., 1980, 8, 2213) и терминирующую последовательность транскрипции нопалинсинтазы из Аgrobacterium tumefaciens. Полигенный экспрессирующий кластер полностью клонируют в виде EcoR1/Sst1 фрагмента в бинарном векторе pMOG23, линеаризованном с применением EcoR1 и Sst1. Полученный бинарный вектор рМОG799 (фиг. 9) используют для трансформации картофеля и табака [штамм E.coli, несущий pMOG799, был депонирован в Коллекции Утрехта, Нидерланды, 23 августа 1993 г. под депозитным номером СВS 430. 93 (Centrall Bureau voor Schimmelcultures, Phabagen collections, Padualaan 8, Utrecht, The Netherlands); pMOG23 был депонирован в CBS 29 июня 1990 г. под депозитным номером CBS 102.90]. Пример II. Образование трегалозы в табаке, трансформированном с использованием pMOG799 С использованием Аgrobacterium tumefaciens, несущей бинарный вектор pMOG799, проводят трансформацию листовых дисков табака. На наличие трегалозо-фосфат-синтазной активности (ТФС) было проанализировано 20 отдельных трансгенных побегов. Было показано, что некоторые растения табака, растущие in vitro, имеют очень толстые корни, в отличие от нетрансформированных растений. При исследовании корней в таких трансгенных растениях табака было выявлено превышение содержания трегалозы над уровнем ее в нетрансгенных растениях. Пример III Образование трегалозы в растениях картофеля, трансформированных с использованием рМОG799 Проводят трансформацию дисков картофельных клубней бинарным вектором рМОG799 при использовании для этой процедуры Аgrobacterium tumefaciens. C использованием канамицина отбирают трансгенные побеги. На наличие трегалозофосфа т-синтазной активности (ТФС) было проанализировано 20 отдельных трансгенных побегов. Было показано, что побеги, содержащие этот фермент, вырастают до зрелых растений. Анализ зрелых клубней полученных таким образом трансгенных растений картофеля выявляет повышение уровня трегалозы в сравнении с нетрансгенными контрольными растениями. При этом трансгенную линию растений pMOG799.1 размножают для целей дальнейших исследований. Пример IV Конструирование pMOG664 Синтезируют два олигон уклеотида, соответствующи х последовательности кДНК для малой субъединицы АДФ-глюкозо-пирофосфорилазы (АГФ-азы В) из клубней картофеля, сорт Дезире (cv. Desiree) (Muller-Rober, B., Kossmann, J., Hannah, L.C., Willmitger, L., and Sonnewald, U., Mol. Yen. Yenet., 1990, 224, 136-146): Синтез проводят с уче том введения в состав олигонуклеотидов на их концах подходящих сайтов рестрикции (ВаmН1 и Ncol, на схеме подчеркнуты) для создания условий, благоприятствующих группированию в полигенном кластере экспрессии в антисмысловом направленнии после расщепления упомянутыми ферментами. Указанные олигонуклеотиды используют для целей амплификации методом ПЦР фрагмента ДНК размером 1 kb с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из библиотеки кДНК растений картофеля, сорт Дезире (cv. Desiree), полученной из ткани 2месячного листа (Сlontech). Результаты проведенного секвенирования показали, что этот фрагмент идентичен последовательности АГФ-азыВ в растениях картофеля, сорт Дезире (cv. Desiree) (Muller-Rober, B., Kossmann, J., Hannah, L.C., Willmitger, L., and Sonnewald, U., Mol. Yen. Yenet., 1990, 224, 136-146). После расщепления упомянутого фрагмента ферментами BamH1 и Ncol проводят его клонирование в рМОG18, линеаризованном с применением ВаmН1 и Ncol. Далее осуществляют клонирование EcoR1/BamH1 фрагмента полученной плазмиды размером 1,85 kb [содержащего 35S промотор из ВТМ (CaMV), РНК4 лидер из ВМЛ (АМV) и фрагмент АГФ-азы в антисмысловой ориентации], а также BamH1/Hind111 фрагмента, содержащего терминатор нопалинсинтазного (NOS) гена из Аgrobacterium tumefaciens, с применением процедуры трехкратного лигирования в бинарном векторе рМОG22, линеаризованном с помощью ЕсоR1 и Hind111. Бинарный вектор pMOG22 содержит экспрессируемый в растении НРТ11 ген, используемый для селекции трансгенных растений на гигромицине [рМОG22 был депонирован в Центральном Коллекторе культур 29 января 1990 г. под депозитным номером 101.90 (Сentraul Burean voor Schimmelcultures)]. Полученный бинарный вектор рМОG664 (фиг. 4) был использован для трансформации растений картофеля. Пример V Конструирование pMOG801 Был проведен синтез множества олигонуклеотидов, комплементарных к последовательности кДНК для сахарозо-фосфат-синтазы (СФС) из кукурузы (Worrell, A.C., Brunean, J.M., Summerfalt, K., Boersig, M., and Voelker, T.A., Plant Cell, 1991, 3, 1121). Их последовательность выглядит следующим образом: Указанные олигонуклеотиды используют для целей амплификации методом ПЦР фрагмента ДНК размером 370 н.п. с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из библиотеки кДНК растений картофеля, сорт Дезире (cv. Desiree), полученной из ткани 2-месячного листа (Сlontech). В результате секвенирования этого фрагмента было показано, что он гомологичен СФС последо 12 39958 вательности из растений кукурузы [см. фиг. 3 и ссылку: Воррелл с соавт. (Worrell et al., 1991)]. ПЦР фрагмент используют для скрининга библиотеки, содержащей ламбда gt 10, в библиотеке кДНК растений картофеля, сорт Дезире (cv. Desiree), полученной из ткани 2-месячного листа (Clontech). Далее проводят секвенирование одного клона, показывающего положительные результаты гибридизации. Было показано, что последовательность фрагмента ДНК размером 654 н.п. на 65% идентична последовательности соответствующей части СФС в растениях кукурузы [начало от нуклеотида под номером 349, как показано на фиг. 11, в соответствии с данными Воррелла с соавт. (Worrell et al., 1990)]. ЕсоР1 вставку из этого клона клонируют в рМОG180, расщепляют с использованием ВаmН1, проводят трехкратное лигирование с указанным ниже синтетическим олигонуклеотидным дуплексом. В результате анализа трансгенных клубней на наличие АГФ-азной активности было показано, что в индивидуальных трансгенных линиях происходит снижение уровня активности в сравнении с нетрансгенным контролем. С применением нозерн-блоттинга было продемонстрировано, что в трансгенных растениях имеет место также снижение в сравнении с нетрансгенными контрольными растениями уровня мРНК для АГФ-азы. Уровень трегалозы в клубнях трансгенных растений, которые, как было выявлено, обладают активностью ТФС и сниженным уровнем АГФ-азы, повышен в сравнении с его значением, показанным для клубней трансгенной растительной линии MOG799.1. Пример VIII Продуцирование трегалозы в растениях картофеля, трансформированных с использованием pMOG799 и pMOG801 Диски картофельных клубней устойчивой к канамицину растительной линии МОG799.1, экспрессирующей ТФС (пример IX), трансформируют с применением для этой процедуры бинарного вектора рМОG801, который содержит антисмысловой полигенный кластер экспрессии СФС. Трансгенные побеги, отобранные в присутствии 10 мг/л гигромицина, исследуют методом ПЦР на наличие ТФС и антисмысловой СФС последовательностей. Трансгенные растения, содержащие оба упомянутых вида последовательностей, анализируют далее на наличие ТФС и СФС активностей. При исследовании трансгенных клубней на наличие СФС активности было показано, что в индивидуальных трансгенных линиях имеет место снижение рассматриваемой активности в сравнении с нетрансгенным контролем. С применением метода нозерн-блоттинга было показано, что уровень мРНК для СФС в трансгенных растениях также снижен в сравнении с его значением, характерным для нетрансгенных контрольных растений. Уровень трегалозы в клубнях трансгенных растений картофеля, которые, как было выявлено, обладают активностью ТФС и сниженным уровнем СФС, повышен в сравнении с его значением, показанным для клубней трансгенной растительной линии MOG-799.1. Пример IX Продуцирование трегалозы в растениях картофеля, трансформированных с применением рМО&799 и pMOG802 Диски картофельных клубней устойчивой к канамицину растительной линии MOG799.1, экспрессирующей ТФС (пример IX), трансформируют с применением для этой процедуры бинарного вектора рМОG-802, который содержит антисмысловые полигенные кластеры экспрессии СФС и АГФ-азы. Трансгенные побеги, отобранные в присутствии 10 мг/л гигромицина, исследуют методом ПЦР на наличие ТФС, антисмысловой АГФ-азной и антисмысловой СФС последовательностей. Трансгенные растения, содержащие все три упомянуты х конструкции, анализируют далее на наличие ТФС, АГФ-азной и СФС активностей. При исследовании трансгенных клубней на наличие АГФ-азной и СФС активности, было отмечено снижение активности обоих ферментов в индивидуальных трансгенных линиях в сравнении Плазмиду, несущую СФС фрагмент в антисмысловой ориентации относительно 35S промотора BTM(С АМV), обозначили как pMOG787. EcoR1/Hind111 фрагмент плазмиды рМОG787 клонируют в бинарном векторе рМОG22, линеаризованном с помощью EcoR1, применяя трехкратное лигирование с синтетическим линкером: Бинарный вектор рМОG22 содержит экспрессируемый в растении ген НРТ11 для целей селекции трансгенных растений на гигромицине [pMOG22 был депонирован в Центральном Коллекторе Культур 29 января 1990 г. под депозитным номером 101.90 (Centraal Bureau voor Schimmelcultures)]. Полученный в результате описанных процедур бинарный вектор pMOG801 (фиг. 10) был применен для трансформации растений картофеля. Пример VI Конструирование рМОG802 ЕсоR1 фрагмент плазмиды pMOG801, содержащий полигенный кластер экспрессии СФС, клонируют в бинарном векторе рМОG664 (содержит антисмысловой полигенный кластер экспрессии АГФ-азы), линеаризованном с помощью EcoR1. Полученный бинарный вектор получил название pMOG802 (фиг. 11). Пример VII Продуцирование трегалозы в растениях картофеля, трансформированных с применением pMOG799 и pMOG664 Диски картофельных клубней растительной линии pMOG799.1, экспрессирующей ТСФ (пример IX) , трансформируют с применением бинарного вектора рМОG664, который содержит антисмысловой полигенный кластер экспрессии АГФазы. Трансгенные побеги, отобранные при добавлении гигромицина в количестве 10 мг/л, исследуют с помощью метода ПЦР на наличие ТФС и антисмысловой АГФ-азной последовательностей. Те трансгенные растения, которые содержат оба упомянутых вида последовательностей анализируют на наличие ТФС и АГФ-азной активностей. 13 39958 с нетрансгенным контролем. С применением метода нозерн-блоттинга было показано, что уровень мРНК для АГФ-азы и СФС в трансгенных растениях также снижен в сравнении с их значениями, характерными для нетрансгенных контрольных растений. Уровень трегалозы в клубнях трансгенных растений картофеля, которые, как было выявлено, обладают активностью ТФС и сниженным уровнем СФС, повышен в сравнении с его значением, показанным для клубней трансгенных растений линии MOG799.1. Депонированные штаммы: рМОG22; Депозитный № СВS 101.90 [с. 23 (оригинала), строки 18-21; с. 24 (оригинала), строки 21-23]; рМОG23; Депозитный № СВS 102.90 [c. 22 (оригинала), строка 10]; рМОG799; Депозитный № CBS 430.93 [с. 22 (оригинала), строка 6]. Перечень последовательностей (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: Информация о последовательности SEQ ID NO: 1; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: Характеристики последовательности; (A) LENGTH: 370 base pairs. Длина: 370 пар оснований (B) TYPE: nucleic acid. Тип: нуклеиновая кислота (C) STRANDEDNESS: double. Нитчатость: двунитевая (D) TOPOLOGY: linear. Топология: линейная (іі) MOLECULE TYPE: cDNA to Mrna. Молекулярный тип: кДНК и мPHK (ііі) HYPOTHETIC AL: NO. гипотетическая: нет (vi) ORIGINAL SOURCE: певоначальный источник: (A) ORGANISM: Solanun tuberosmn. Организм: Solanun tuberosmn (B) STRAIN: Desiree. Штамм: Дезире (Desiree) (F) TISSUE TYPE: Leaf. Тип ткани: лист (хі) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: Описание последовательности: SEQ ID NO: 1 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: Информация о последовательности SEQ ID NO: 2; (і) SEQUENCE CHARACTERISTICS: Характеристики последовательности: (A) LENGTH: 1446 base pairs. Длина: 1446 пар основний (B) TYPE: nucleic acid. Тип: нуклеиновая кислота (C) STRANDEDNESS: double. Ниточность: двулинейная (D) TOPOLOGY: linear. Топология: линейная (іі) MOLECULE TYPE: DNA (genomic). Молекулярный тип: ДНК (геномная) (ііі) HYPOTHETIC AL: NO. Гипотетическая: нет (vi) ORIGIN AL SOURCE: Первоначальный источник: (A) ORGANISM: Escherichia coli. Организм: Escherichia coli (vii) IMMEDIATE SOURCE: Непосредственный источник: (B) CLONE: 7F11. Клон: 7F11 (viii) POSITION IN GENOME: Положение в геноме: (B) MAP POSITION: 41-42' Расположение на карте: 41-42' (ix) FEATURE: Особые характеристики: (A) N AME/KEY: CDS Hаименование/ключ: CDS (B) LOCATION: 19…1446. Локализация: 19…1446 (D) OTHER INFORMATION: /produc="trehalose phosphate synthase"/gene=" otsA". Другая информация (продукт="трегалозо-фосфатсинтаза /ген=otsA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: Описание последовательности SEQ ID NO: 2: 14 39958 15 39958 16 39958 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3: Информация о последовательности SEQ ID NO: 3 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: Характеристики последовательности:(A) LENGTH: 476 amino acids. Длина: 476 аминокислот (B) ТУРЕ: amino acid. Тип: аминокислота (D) TOPOLOGY: linear. Топология: линейная (іі) MOLECULE TYPE: protein. Молекулярный тип: белок (хі) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3: Описание последовательности SEQ ID NO: 3: 17 39958 18 39958 (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 4: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 22 пары оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 4: ТЦЦЦЦАТГГА АТЦАААГЦАТ ЦЦ (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 5: (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 22 пары оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 5: ГАТТГГАТЦЦ АГГГЦАЦГГЦ ТГ (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 6: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 33 пары оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 6: ГТАГГТЦГТГ АТТЦТГАТАЦ АГГТГГЦЦАГ ГТГ (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 7: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 35 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: ДНК (геномная) (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 7: ЦФГЦФТЦГГЦ АТАГТГЦЦЦА ТГТАТЦАЦГТ ААГГЦ (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 8: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 18 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 8: АГЦТЦАЦГАГ ЦТЦТЦАГГ (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 9: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИН А: 18 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (В) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 9: ГТГЦТЦГАГА ГТЦЦТЦГА (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 10: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 24 пары оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 10: ГАТЦЦЦЦЦГГ ГГЦАТГЦААГ ЦТТГ (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 11: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 24 пары оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 11: ГГГГЦЦЦЦГТ АЦГТТЦГААЦ ЦТАГ (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 12: 19 39958 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 23 пары оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ii) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 12: ГАГААААТАЦ ЦЦГГГГТГАТ ГАЦ (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 13: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 25 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 13: ГАТААТЦГТГ ГАТЦЦАГ АТА АТГТЦ (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 14: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 16 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 14: ГАТЦГТЦАГ А ТЦТАГЦ (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 15: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИН А: 16 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (В) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 15: ЦАГТЦТАГАТ ЦГТТАА (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 16: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 13 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 16: АГЦТТЦЦЦЦЦ ЦЦГ (2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 17: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 13 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (іі) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (ііі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 17: АГГГГГГГЦТ ТАА Фиг. 1 20 39958 Фиг. 2 Фиг. 3 Фиг. 4 21 39958 Фиг. 5 Фиг. 6 Фиг. 7 22 39958 Фиг. 8 Фиг. 9 23 39958 Фиг. 10 Фиг. 11 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 24