Стабільний рідкий склад amg 416 (велкалсетиду)

Реферат: Винахід стосується фармацевтичного складу, що включає AMG 416 у водному розчині, де склад має pH від 2,0 до 5,0. UA 115373 C2 (12) UA 115373 C2 UA 115373 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Дана заявка заявляє перевагу попередньої заявки на патент США № 61/840618, поданої 28 червня 2013 року, зміст якої включено в даний документ за допомогою посилання у всій його повноті. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Дане розкриття відноситься до рідкого складу, що включає пептидний агоніст кальційчутливого рецептора, зокрема, до такого складу, який залишається стабільним після зберігання протягом тривалого періоду. Дане розкриття також спрямовано на способи отримання та застосування даного складу. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ Було описано ряд сполук, що мають активність щодо зниження рівнів паратироїдного гормону. Див. міжнародну заявку № WO 2011/014707. В одному варіанті здійснення ця сполука може бути представлена наступним чином: . Основний ланцюг містить 7 амінокислот, усі в D-конфігурації, та залишок цистеїну бокового ланцюга у L-конфігурації. Аміно-кінець є ацетильованим, а карбоксильний кінець є амідованим. Ця сполука ("AMG-416") застосовується для лікування вторинного гіперпаратиреозу (SHPT) у пацієнтів на гемодіалізі. Рідкий склад, що включає AMG-416, може бути введеним суб'єкту внутрішньовенно. Гідрохлорид AMG-416 може бути представлений наступним чином: . Терапевтичні пептиди становлять ряд проблем стосовно їх складання. Пептиди загалом і, зокрема, такі, що містять дисульфідний зв'язок, як правило, мають лише помірну або слабку стабільність у водному розчині. Пептиди схильні до гідролізу амідного зв'язку як за умов високого, так і низького рН. Дисульфідні зв'язки можуть бути нестабільними навіть за доволі м'яких умов (близьких до нейтрального рН). Крім того, пептиди, що містять дисульфіди, які не є циклічними, особливо схильні до утворення димерів. Відповідно, терапевтичні пептиди часто представлені в ліофілізованій формі, у вигляді сухого порошку або брикету для подальшого відновлення. Ліофілізований склад терапевтичного пептиду має перевагу в забезпеченні стабільності протягом тривалих періодів часу, але є менш зручним для використання, оскільки вимагає додавання одного або декількох розріджувачів, та існує потенційний ризик помилок через використання невідповідних типу або кількості розріджувача, а також ризик забруднення. Крім того, процес ліофілізації є часовитратним та дорогим. Відповідно, існує потреба в рідкому водному складі, що містить пептидний агоніст кальційчутливого рецептора, такий як AMG 416. Було б бажано, щоб рідкий склад залишався стабільним протягом відповідного періоду часу за придатних умов зберігання і був придатним для введення внутрішньовенно або іншими парентеральними шляхами. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Представлено рідкий склад, що включає пептидний агоніст кальцій-чутливого рецептора, такий як AMG 416. В одному варіанті здійснення склад має pH від приблизно 2,0 до приблизно 5,0. В іншому варіанті здійснення склад має pH від 2,5 до 4,5. В іншому варіанті здійснення склад має pH від 2,5 до 4,0. В іншому варіанті здійснення склад має pH від 3,0 до 3,5. В іншому варіанті здійснення склад має pH від 3,0 до 4,0. В іншому варіанті здійснення склад має pH від 2,8 до 3,8. В іншому варіанті здійснення pH складу підтримується за допомогою фармацевтично прийнятного буферу. Такі буфери включають, без обмеження, сукцинатні буфери, ацетатні буфери, цитратні буфери та фосфатні буфери. В іншому варіанті здійснення буфер являє собою сукцинатний буфер. Значення pH складу може бути відрегулювано за необхідності кислотою або основою, такими як HCl або NaOH. В іншому варіанті здійснення пептидний агоніст кальцій-чутливого рецептора присутній у концентрації від 0,1 мг/мл до 20 мг/мл. В іншому варіанті здійснення пептид присутній у 1 UA 115373 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 концентрації від 1 мг/мл до 15 мг/мл. В іншому варіанті здійснення пептид присутній у концентрації від 2,5 мг/мл до 10 мг/мл. В іншому варіанті здійснення пептид присутній у концентрації приблизно 1 мг/мл, приблизно 5 мг/мл або приблизно 10 мг/мл. В іншому варіанті здійснення AMG 416 присутній у концентрації від приблизно 0,1 мг/мл до приблизно 20 мг/мл. В одному варіанті здійснення AMG 416 присутній у концентрації від приблизно 1 мг/мл до приблизно 15 мг/мл. В іншому варіанті здійснення AMG 416 присутній у концентрації від приблизно 2,5 мг/мл до приблизно 10 мг/мл. В іншому варіанті здійснення AMG 416 присутній у концентрації приблизно 1 мг/мл, приблизно 2,5 мг/мл, приблизно 5 мг/мл або приблизно 10 мг/мл. В іншому варіанті здійснення AMG 416 присутній у концентрації від 0,1 мг/мл до 20 мг/мл. В одному варіанті здійснення AMG 416 присутній у концентрації від 1 мг/мл до 15 мг/мл. В іншому варіанті здійснення AMG 416 присутній у концентрації від 2,5 мг/мл до 10 мг/мл. В іншому варіанті здійснення AMG 416 присутній у концентрації від 1 мг/мл до 5 мг/мл. В іншому варіанті здійснення AMG 416 присутній у концентрації від 5 мг/мл до 10 мг/мл. В іншому варіанті здійснення AMG 416 присутній у концентрації від 0,5 до 1,5 мг/мл, від 2,0 до 3,0 мг/мл, від 4,5 до 5,5 мг/мл або від 9,5 до приблизно 10,5 мг/мл. В іншому варіанті здійснення склад додатково включає фармацевтично прийнятний модифікатор тонічності або суміш фармацевтично прийнятних модифікаторів тонічності. В іншому варіанті здійснення модифікатор тонічності (або суміш модифікаторів тонічності) присутній у концентрації, достатній для отримання складу, приблизно ізотонічного рідинам організму (наприклад, крові людини). В іншому аспекті модифікатор тонічності являє собою NaCl. В іншому варіанті здійснення склад включає терапевтично ефективну кількість пептидного агоніста кальцій-чутливого рецептора. У переважному варіанті здійснення склад включає терапевтично ефективну кількість AMG 416. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менше 10 %, коли зберігається при 28 °C строком до 2 років. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менше 10 %, коли зберігається при 2-8 °C строком до 3 років. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менше 10 %, коли зберігається при 2-8 °C строком до 4 років. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менше 8 %, коли зберігається при 2-8 °C строком до 2 років. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менше 8 %, коли зберігається при 2-8 °C строком до 3 років. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менше 8 %, коли зберігається при 2-8 °C строком до 4 років. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менше 10 %, коли зберігається при кімнатній температурі протягом 3 місяців. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менше 10 %, коли зберігається при кімнатній температурі строком до 6 місяців. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менше 10 %, коли зберігається при кімнатній температурі строком до 1 року. В іншому варіанті здійснення забезпечено склад, який включає від 0,5 мг/мл до 20 мг/мл пептидного агоніста кальцій-чутливого рецептора (наприклад, AMG 416) у водному розчині, сукцинатний буфер, який підтримує склад при pH від приблизно 3,0 до приблизно 3,5, та достатню концентрацію хлориду натрію для того, щоб склад був приблизно ізотонічним із кров'ю людини. КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ Фігура 1 являє собою серію графіків, які наводять чистоту (%) в залежності від часу (дні) для розчинів AMG 416 у сукцинатно-сольовому буферному розчині (рН 4,5) при кімнатній температурі (RT). На фігурі 1A показана стабільність розчинів AMG 416, що мають концентрації 200, 66, 20, 6,7, 2,2 та 0,67 мг/мл AMG 416. На фігурі 1B масштаб збільшено, щоб чіткіше проілюструвати характер деградації при концентраціях 20 мг/мл та нижче. Фігура 2 являє собою графік, який наводить чистоту (%) в залежності від часу (дні) для розчинів AMG 416 у сукцинатно-сольовому буферному розчині (рН 4,5) при 40 °C, що мають концентрації у діапазоні 20, 6,7, 2,2 та 0,67 мг/мл AMG 416. Фігура 3 являє собою серію графіків, які наводять чистоту (%) в залежності від часу (дні) для розчинів AMG 416 у сукцинатно-сольовому буферному розчині (pH 2, 3, 4, 5 та 6) при 40 °C. На фігурі 3A концентрація AMG 416 складає 10 мг/мл, а на фігурі 3B концентрація AMG 416 складає 2,5 мг/мл. Фігура 4 являє собою серію графіків, які наводять чистоту (%) на 28 день в залежності від pH для розчинів AMG 416 у сукцинатно-сольовому буферному розчині при 2-8 °C, RT та 40 °C. На фігурі 4A концентрація AMG 416 складає 10 мг/мл, а на фігурі 4B концентрація AMG 416 складає 2,5 мг/мл. 2 UA 115373 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 5 являє собою серію хроматограм HPLC. Крива HPLC на фігурі 5A відноситься до розчину AMG 416 (5 мг/мл, pH 2,25), який зберігався протягом 27 днів при 40 °C (87,8 % чистота). На фігурі 5B масштаб збільшено, щоб чіткіше проілюструвати піки. Фігура 6 являє собою серію хроматограм HPLC. Крива HPLC на фігурі 6A відноситься до розчину AMG 416 (5 мг/мл, pH 3,5), який зберігався протягом 27 днів при 40 °C (91,7 % чистота). На фігурі 6B масштаб збільшено, щоб чіткіше проілюструвати піки. Фігура 7 являє собою графік, який наводить чистоту (%) в залежності від часу (дні) для серії розчинів AMG 416 (5 мг/мл) у сукцинатно-сольовому буферному розчині (pH 2,25, 2,5, 3,0 та 3,5) при 2-8 °C. Фігура 8 являє собою графік, який наводить чистоту (%) в залежності від часу (дні) для серії розчинів AMG 416 (5 мг/мл) у сукцинатно-сольовому буферному розчині (pH 2,25, 2,5, 3,0 та 3,5) при RT. Фігура 8 являє собою графік, який наводить чистоту (%) в залежності від часу (дні) для серії розчинів AMG 416 (5 мг/мл) у сукцинатно-сольовому буферному розчині (pH 2,25, 2,5, 3,0 та 3,5) при 40 °C. Фігура 10 являє собою серію графіків, які наводять продукт розпаду (%) в залежності від часу (дні) для серії розчинів AMG 416 (5 мг/мл) у сукцинатно-сольовому буферному розчині (pH 2,25, 2,5, 3,0 та 3,5). Залежність C-кінцевого деамідування від часу показано при 2-8 °C (фігура 10A), RT (фігура 10B) та при 40 °C (фігура 10C). Зверніть увагу, що шкала осі ординат відрізняється в кожному графіку. Фігура 11 являє собою серію графіків, які наводять продукт розпаду (%) в залежності від часу (дні) для серії розчинів AMG 416 (5 мг/мл) у сукцинатно-сольовому буферному розчині (pH 2,25, 2,5, 3,0 та 3,5). Залежність утворення гомодимера від часу показано при 2-8 °C (фігура 11A), RT (фігура 11B) та при 40 °C (фігура 11C). Зверніть увагу, що шкала осі ординат на фігурі 11C відрізняється від такої на фігурах 11A та 11B. Фігура 12 являє собою серію графіків, які наводять чистоту (%) в залежності від pH (2,8-3,8), концентрації AMG 416 (4-6 мг/мл) та NaCl (0,7-1,0 %) для серії розчинів у сукцинатно-сольовому буферному розчині, які зберігалися при 2-8 °C (фігура 12A), 25 °C (фігура 12B) та 40 °C (фігура 12C). Фігура 13 являє собою серію графіків, які наводять чистоту (%) в залежності від часу (місяці) для серії розчинів AMG 416 (3,4 мг/мл) у сукцинатно-сольовому буферному розчині (pH 2,5, 3,0, 3,5), які зберігалися при 2-8 °C (фігура 13A), 25 °C (фігура 13B) та 40 °C (фігура 13C). ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ДАНОГО ВИНАХОДУ Заголовки розділів, використані у даному документі, призначені для організаційних цілей та не повинні бути витлумачені як обмежувальні щодо описаного об'єкту даного винаходу. Якщо в даному документі не вказано інакше, наукові та технічні терміни, використані у зв'язку з даною заявкою, повинні мати значення, які зазвичай зрозумілі середнім спеціалістам у даній галузі техніки. Крім того, якщо інше не передбачено контекстом, терміни в однині включають до себе множину і терміни в множині включають до себе однину. Як правило, найменування, використані щодо методів молекулярної біології та хімії білків, описані в даному документі, є добре відомими і широко використовуються у рівні техніки. Способи та методи даної заявки, як правило, виконуються відповідно до звичайних способів, добре відомих у рівні техніки, і як описано в різних загальних і конкретніших посиланнях, які цитуються і обговорюються в даному описі, якщо не вказано інше. Див., наприклад, Laszlo, Peptide-Based Drug Design: Methods and Protocols, Humana Press (2008); Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press (2005); Ausubel та співавт., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), які включено в даний документ за допомогою посилання для будь-яких цілей. Методи очищення виконуються відповідно до специфікацій виробника, як це зазвичай здійснюється в даній галузі, або як описано в даному документі. Пов'язана термінологія і лабораторні процедури та методи аналітичної хімії, хімії органічного синтезу та медичної і фармацевтичної хімії, описані в даному документі, є добре відомими і широко використовуються у рівні техніки. Стандартні методи можуть бути використані для хімічного синтезу, хімічних аналізів, фармацевтичного препарату, складу і доставки та для лікування пацієнтів. Необхідно розуміти, що це розкриття не обмежено конкретною методологією, протоколами, реагентами та ін., описаними в даному документі, і, по суті, може змінюватися. Термінологія, використана в даному документі, присутня виключно з метою опису конкретних варіантів здійснення і не призначена для обмеження розкрити той обсяг, який визначено виключно формулою винаходу. Як зазначено в даному документі, термін "приблизно" в контексті даного значення або 3 UA 115373 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 діапазону відноситься до значення або діапазону, що знаходиться в межах 20 %, переважно, в межах 10 %, та більш переважно, в межах 5 % від заданого значення або діапазону. I. Загальні визначення Внаслідок угоди, як використовується в даному документі, однина означає "один або більше", якщо спеціально не вказано інше. Термін "AMG 416" відноситься до сполуки, що має хімічну назву: N-ацетил-D-цистеїніл-Dаланіл-D-аргініл-D-аргініл-D-аргініл-D-аланіл-D-аргінаміду дисульфід з L-цистеїном, яку можна представити як: . Терміни "гідрохлорид AMG 416" або "AMG 416 HCl" є взаємозамінними і відносяться до сполуки, що має хімічну назву: N-ацетил-D-цистеїніл-D-аланіл-D-аргініл-D-аргініл-D-аргініл-Dаланіл-D-аргінаміду дисульфід з L-цистеїн гідрохлоридом, яку можна представити як: . Як зазначено в даному документі, терміни "амінокислота" та "залишок" є взаємозамінними та, при використанні в контексті пептиду або поліпептиду, відносяться одночасно до природних та синтетичних амінокислот, а також до аналогів амінокислот, міметиків амінокислот та неприродних амінокислот, які хімічно подібні природним амінокислотам. Термін "лікування" відноситься до будь-якого показника успіху в лікуванні або ослабленні ушкодження, патології або стану здоров'я, у тому числі будь-якого об'єктивного чи суб'єктивного параметру, такого як ослаблення симптомів; ремісія; зменшення ознак чи симптомів або перетворення ушкодження, патології чи стану здоров'я на стерпніший для пацієнта; уповільнення темпів дегенерації чи виснаження; перетворення кінцевої точки дегенерації на менш виснажливу; поліпшення фізичного або психічного здоров'я пацієнта. Лікування або ослаблення ознак чи симптомів може бути засноване на об'єктивних чи суб'єктивних параметрах; у тому числі за підсумками медичного обстеження, наприклад, лікування SHPT шляхом зменшення підвищених рівнів паратироїдного гормону (PTH). Терміни "терапевтично ефективна доза" і "терапевтично ефективна кількість", як використовується у даному документі, означає кількість, яка викликає таку біологічну або медичну відповідь у тканинній системі, тварині або людині, якої намагається досягти дослідник, лікар або інший клініцист, яка включає полегшення або ослаблення ознак або симптомів захворювання або розладу, що підлягає лікуванню, наприклад, кількість AMG 416, що викликає бажане зниження підвищеного рівня PTH. Термін "кімнатна температура", як використовується у даному документі, відноситься до температури приблизно 25 °C. Зберігання в "охолодженому стані", як використовується у даному документі, відноситься до зберігання при температурі 2-8 °C. Терміни "пептид", "поліпептид" та "білок" є взаємозамінними та відносяться до полімеру амінокислот, як правило, з'єднаних разом за допомогою пептидних або дисульфідних зв'язків. Терміни також відносяться до полімерів амінокислот, в яких один або декілька амінокислотних залишків являють собою аналог або міметик відповідної природної амінокислоти, а також до полімерів природних амінокислот. Терміни можуть також стосуватись полімерів амінокислот, які були модифіковані, наприклад, шляхом додавання вуглеводних залишків з утворенням глікопротеїнів, або фосфорильовані. Пептиди, поліпептиди і білки можуть бути отримані шляхом синтезу в рідкій фазі або твердофазного синтезу, або за допомогою генно-інженерної або рекомбінантної клітини. "Варіант" пептиду або поліпептиду включає амінокислотну послідовність, де один або більше амінокислотних залишків вставлений в, видалений з та/або заміщений в амінокислотній послідовності відносно послідовності іншого поліпептиду. Варіанти включають до себе гібридні білки. "Похідне" пептиду або поліпептиду являє собою пептид або поліпептид, який був хімічно 4 UA 115373 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 модифікований яким-небудь способом, відмінним від варіантів вставки, делеції або заміни, наприклад, шляхом кон'югації з іншим хімічним фрагментом. Така модифікація може включати ковалентне додавання групи до аміно- та/або карбокси-кінця пептиду або поліпептиду, наприклад, ацетилювання аміно-кінця та/або амідування карбокси-кінця пептиду або поліпептиду. Термін "амінокислота" включає його звичайне значення у даній галузі. Двадцять природних амінокислот та їх абревіатури підлягають звичайному використанню. Див., Immunology-A Synthesis, 2nd Edition, (E. S. Golub та D. R. Green, ред.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991), яку включено в даний документ за допомогою посилання для будь-яких цілей. Стереоізомери (наприклад, D-амінокислоти) 19 звичайних амінокислот (крім гліцину), неприродні амінокислоти, такі як [альфа]-, [альфа]-бізаміщені амінокислоти, N-алкіловані амінокислоти та інші нестандартні амінокислоти можуть також бути придатними компонентами поліпептидів і включені у визначення "амінокислота". Приклади нестандартних амінокислот включають: гомоцистеїн, орнітин, 4-гідроксипролін, [гамма]-карбоксиглутамат, [епсилон]-N, N,Nтриметиллізин, [епсилон]-N-ацетиллізин, O-фосфосерин, N-ацетилсерін, N-формілметионін, 3метилгістидин, 5-гідроксилізин, [сигма]-N-метиларгінин та інші аналогічні амінокислоти та імінокислоти (наприклад, 4-гідроксипролін). У позначенні поліпептиду, використаному в даному документі, аміно-кінець знаходиться ліворуч, а карбокси-кінець знаходиться праворуч у відповідності до стандартного використання і звичаю. "Суб'єкт" або "пацієнт", як зазначено у даному документі, може бути будь-яким ссавцем. У типовому варіанті здійснення суб'єкт або пацієнт є людиною. "Буфер", як зазначено в даному документі, відноситься до композиції, де композиція містить слабку кислоту та її сполучену основу (зазвичай у вигляді солі сполученої основи), слабку основу та її сполучену кислоту, або їх суміші. Спеціалісти у даній галузі техніки легко розпізнають різні буфери, які можна використовувати в складах, використаних у даному винаході. Типові буфери включають, але без обмеження, фармацевтично прийнятні слабкі кислоти, слабкі основи або їх суміші. Зразкові фармацевтично прийнятні буфери включають ацетат (наприклад, ацетат натрію), сукцинат (наприклад, сукцинат натрію). Вираз "слабка кислота" означає хімічну кислоту, яка не повністю іонізується у водному розчині; тобто, якщо кислоту представлено загальною формулою HA, тоді у водному розчині утворюється A-, але все ще залишається суттєва кількість недисоційованої HA. Константа -16 дисоціації кислоти (Ka) для слабкої кислоти варіює між 1,8 × 10 та 55,5. Вираз "слабка основа" означає хімічну основу, яка не повністю іонізується у водному розчині; тобто, якщо основу представлено загальною формулою B, тоді у водному розчині утворюється BH+, але все ще залишається суттєва кількість недисоційованого B. Константа -16 дисоціації кислоти (Ka) отриманої сполученої слабкої кислоти BH+ варіює між 1,8 × 10 та 55,5. Вираз "сполучена кислота" означає кислотний член, HX+, частину із двох сполук (HX+, X), які трансформуються одна в одну шляхом приєднання або втрати протона. Вираз "сполучена основа" означає основний член, X-, пару із двох сполук (HX, X-), які трансформуються одна в одну шляхом приєднання або втрати протону. Вираз "сіль сполученої основи" означає іонну сіль, яка включає сполучену основу, X-, та позитивно заряджений протийон. Вираз "буферна система" означає суміш, яка включає щонайменше два буфери. Термін "q.s.” означає додавання кількості, достатньої для досягнення необхідної функції, наприклад, доведення розчину до необхідного об'єму (тобто 100 %). Вираз "модифікатор тонічності" означає фармацевтично прийнятну інертну речовину, яка може бути додана до складу для регулювання тонічності складу. Модифікатори тонічності, придатні для даного винаходу, включають, але без обмеження, хлорид натрію, хлорид калію, маніт або гліцерин та інші фармацевтично прийнятні модифікатори тонічності. II. Варіанти здійснення Дане розкриття відноситься до рідких складів, які включають пептидний агоніст кальційчутливого рецептора, де склад має pH від приблизно 2,0 до приблизно 5,0. У переважному варіанті здійснення дане розкриття відноситься до рідкого складу, що включає AMG 416, де склад має pH від приблизно 2,0 до приблизно 5,0. AMG 416 та його отримання описано у міжнародній пат. публікації № WO 2011/014707. Наприклад, AMG 416 може бути зібраний за допомогою твердофазного синтезу з відповідних Fmoc-захищених D-амінокислот. Після відщеплення від смоли матеріал може бути оброблений Boc-L-Cys(NPyS)-OH, щоб сформувати дисульфідний зв'язок. Вос-групу можна потім видалити за допомогою трифтороцтової кислоти (TFA), а отриманий продукт очистити за допомогою обернено-фазової рідинної хроматографії високого тиску (HPLC) і виділити у вигляді солі TFA шляхом ліофілізації. Сіль TFA може бути 5 UA 115373 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перетворена у фармацевтично прийнятну сіль шляхом проведення подальшої процедури обміну солі. Такі процедури добре відомі в рівні техніки та включають, наприклад, метод іонного обміну необов'язково з подальшим очищенням отриманого продукту (наприклад, шляхом обернено-фазової рідинної хроматографії або зворотного осмосу). Склади, розкриті в даному документі, описані в першу чергу з точки зору терапевтичного пептиду AMG 416 в якості активного інгредієнта. Однак як легко зрозуміє спеціаліст в даній галузі, дане розкриття також поширюється на варіанти та похідні AMG 416. Наприклад, в одному варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-D-цистеїніл-D-аланіл-D-аргініл-D-аргініл-D-аргініл-D-аланіл-D-аргінаміду дисульфідом з D-цистеїном. В іншому варіанті здійснення розкритий склад також можуть бути використані із N-ацетил-D-цистеїніл-D-аланіл-D-аргініл-D-аргініл-D-аргініл-D-аланіл-D-аргінаміду дисульфідом з N-ацетил-D-цистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-D-цистеїніл-D-аланіл-D-аргініл-D-аргініл-D-аргініл-D-аланіл-Dаргінаміду дисульфідом з N-ацетил-L-цистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-Lцистеїніл-L-аланіл-L-аргініл-L-аргініл-L-аргініл-L-аланіл-L-аргінаміду дисульфідом з D-цистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-Lцистеїніл-L-аланіл-L-аргініл-L-аргініл-L-аргініл-L-аланіл-L-аргінаміду дисульфідом з L-цистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-Lцистеїніл-L-аланіл-L-аргініл-L-аргініл-L-аргініл-L-аланіл-L-аргінаміду дисульфідом з N-ацетил-Dцистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-L-цистеїніл-L-аланіл-L-аргініл-L-аргініл-L-аргініл-L-аланіл-L-аргінаміду дисульфідом з N-ацетил-L-цистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-Dцистеїніл-D-аргініл-D-аргініл-D-аланіл-D-аргініл-D-аланіл-D-аргінаміду дисульфідом з Dцистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-D-цистеїніл-D-аргініл-D-аргініл-D-аланіл-D-аргініл-D-аланіл-D-аргінаміду дисульфідом з L-цистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-D-цистеїніл-D-аргініл-D-аргініл-D-аланіл-D-аргініл-D-аланіл-D-аргінаміду дисульфідом з N-ацетил-D-цистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-D-цистеїніл-D-аргініл-D-аргініл-D-аланіл-D-аргініл-D-аланіл-Dаргінаміду дисульфідом з N-ацетил-L-цистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-Lцистеїніл-L-аргініл-L-аргініл-L-аланіл-L-аргініл-L-аланіл-L-аргінаміду дисульфідом з D-цистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-Lцистеїніл-L-аргініл-L-аргініл-L-аланіл-L-аргініл-L-аланіл-L-аргінаміду дисульфідом з L-цистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-Lцистеїніл-L-аргініл-L-аргініл-L-аланіл-L-аргініл-L-аланіл-L-аргінаміду дисульфідом з N-ацетил-Dцистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із: N-ацетил-L-цистеїніл-L-аргініл-L-аргініл-L-аланіл-L-аргініл-L-аланіл-L-аргінаміду дисульфідом з N-ацетил-L-цистеїном. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із однією або декількома сполуками, наведеними в таблиці 1, таблиці 2, таблиці 3, таблиці 4, таблиці 5, таблиці 6, таблиці 7, таблиці 8, таблиці 9 та/або таблиці 10 міжнародної пат. публікації № WO 2011/014707. В іншому варіанті здійснення розкриті склади також можуть бути використані із однією або декількома сполуками, описаними в міжнародній пат. публікації № WO 2011/014707. В деяких варіантах здійснення склад містить терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта (наприклад, AMG 416). Терапевтично ефективна кількість активного інгредієнта в будь-якому даному варіанті здійснення складу даного розкриття буде залежати від об'єму складу, який необхідно доставити даному суб'єкту, а також від віку і ваги суб'єкта та природи хвороби або розладу, який лікують. Залежно від лікарської форми в деяких випадках терапевтично ефективна кількість може бути надана пацієнту за одне введення, тоді як в інших випадках може знадобитись кілька введень. Рідкий склад даного розкриття являє собою фармацевтичну композицію, придатну для введення внутрішньовенно, внутрішньоартеріально, внутрішньом'язово та підшкірно. У переважному варіанті здійснення рідкий склад придатний для введення внутрішньовенно або іншими парентеральними шляхами. Переважно, рідкий склад є стерильним водним розчином. Як правило, розчинник являє собою воду ін'єкційної якості, або суміш води та одного або більше розчинника(ів), що змішується з водою, такого як пропіленгліколь, поліетиленгліколь та етанол. Використання стерильної деіонізованої води в якості розчинника є переважним. Можуть, однак, 6 UA 115373 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бути використані й інші розчинники, які є придатними та звичайними для фармацевтичних препаратів. Склад, як правило, містить від приблизно 0,1 мг/мл до приблизно 100 мг/мл активного інгредієнта (наприклад, AMG 416), від приблизно 0,1 мг/мл до приблизно 20 мг/мл активного інгредієнта, від приблизно 0,5 мг/мл до приблизно 15 мг/мл активного інгредієнта, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 10 мг/мл активного інгредієнта, або від приблизно 2 мг/мл до приблизно 5 мг/мл активного інгредієнта. У деяких варіантах здійснення склад містить приблизно 1 мг/мл активного інгредієнта, приблизно 2 мг/мл активного інгредієнта, приблизно 2,5 мг/мл активного інгредієнта, приблизно 5 мг/мл активного інгредієнта, приблизно 10 мг/мл активного інгредієнта або приблизно 20 мг/мл активного інгредієнта. В іншому варіанті здійснення склад містить від 0,1 мг/мл до 100 мг/мл активного інгредієнта, від 0,1 мг/мл до 20 мг/мл активного інгредієнта, від 0,5 мг/мл до 15 мг/мл активного інгредієнта або від 1 мг/мл до 10 мг/мл активного інгредієнта, або від 2 мг/мл до 5 мг/мл активного інгредієнта. У переважному варіанті здійснення склад містить від 1 мг/мл до 10 мг/мл активного інгредієнта. В іншому переважному варіанті здійснення склад містить від 2 мг/мл до 5 мг/мл активного інгредієнта. Склад, як правило, має pH від приблизно 2,0 до приблизно 5,0, pH від приблизно 2,5 до приблизно 4,5, pH від приблизно 2,5 до приблизно 4,0, pH від приблизно 3,0 до приблизно 3,5 або pH від приблизно 3,0 до приблизно 3,6. У деяких варіантах здійснення склад має pH приблизно 2, pH приблизно 2,5, pH приблизно 3,0, pH приблизно 3,3, pH приблизно 3,5 або pH приблизно 4,0. У деяких варіантах здійснення склад має pH від 2,0 до 5,0, pH від 2,5 до 4,5, pH від 2,5 до приблизно 4,0, pH від 3,0 до 3,5 або pH від 3,0 до 3,6. Як описано більш докладно в прикладах, стабільність AMG 416 залежить від pH розчину. Автори даного винаходу виявили, що два головних продукти розпаду є результатом C-кінцевого деамідування та утворення гомодимерів. Крім того, автори даного винаходу виявили, що динаміка деструкції за цими шляхами залежить від pH. Див. приклад 6. При низькому pH переважає деструкція шляхом C-кінцевого деамідування (див. фігуру 10), тоді як при вищому pH переважає деструкція шляхом утворення гомодимерів (див. фігуру 11). Таким чином, утворення двох головних продуктів розпаду має зворотний взаємозв'язок між рН і ступенем деструкції. Ці протилежні тенденції лежать в основі даних загальної стабільності в діапазоні значень рН і підтримують ідентифікацію рН від приблизно 3,0 до приблизно 3,5 як рН максимальної стабільності розчинів AMG 416. Як правило, склад містить фізіологічно прийнятний буферний засіб, який підтримує рН складу в бажаному діапазоні. В одному варіанті здійснення буфер підтримує pH від приблизно 2,0 до приблизно 5,0, pH від приблизно 2,5 до приблизно 4,5, pH від приблизно 2,5 до приблизно 4,0, pH від приблизно 3,0 до приблизно 3,5 або pH від приблизно 3,0 до приблизно 3,6. У деяких варіантах здійснення буфер підтримує pH приблизно 2, pH приблизно 2,5, pH приблизно 3,0, pH приблизно 3,3, pH приблизно 3,5 або pH приблизно 4,0. У деяких варіантах здійснення буфер підтримує pH від 2,0 до 5,0, pH від 2,5 до 4,5, pH від 2,5 до приблизно 4,0, pH від 3,0 до 3,5 або pH від 3,0 до 3,6. Будь-який буфер, здатний підтримувати рН складу при будь-якому рН або в будь-якому діапазоні рН, наведеному вище, придатний для використання в складах даного розкриття за умов, що він не вступає в реакцію з іншими компонентами складу, не викликає утворення видимого осаду, або іншим чином не викликає хімічної дестабілізації активного інгредієнту. Буфер, використаний у даному складі, зазвичай включає компонент, вибраний з групи, яка складається з сукцинату, цитрату, малату, едентату, гістидину, ацетату, адипату, аконітату, аскорбату, бензоату, карбонату, бікарбонату, малеату, глутамату, лактату, фосфату і тартрату, або суміші цих буферів. У переважному варіанті здійснення буфер включає сукцинат, наприклад, сукцинат натрію. Концентрацію буферу вибирають так, щоб було забезпечено стабілізацію pH, а також достатню буферну ємність. В одному варіанті здійснення буфер присутній у складі в концентрації від приблизно 0,5 до приблизно 100 ммолів/л, від приблизно 0,75 до приблизно 50 ммолів/л, від приблизно 1 до приблизно 20 ммолів/л, або від приблизно 10 до приблизно 20 ммолів/л. В інших варіантах здійснення буфер присутній в концентрації приблизно 5 ммолів/л, приблизно 10 ммолів/л, приблизно 15 ммолів/л або приблизно 20 ммолів/л. В інших варіантах здійснення буфер присутній у складі в концентрації від 0,5 до 100 ммолів/л, від 0,75 до 50 ммолів/л, від 1 до 20 ммолів/л або від 10 до 20 ммолів/л. У переважному варіанті здійснення буфер присутній в концентрації приблизно 10 ммолів/л. У іншому переважному варіанті здійснення буфер являє собою сукцинат, присутній у концентрації приблизно 10 ммолів/л. З погляду сумісності рідкого складу з внутрішньовенним введенням бажано, щоб значення рН рідкого складу було якомога ближче до фізіологічного рН. Рідкі склади, які мають значення 7 UA 115373 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 pH, далеке від фізіологічного pH, або які сильно забуферено, можуть викликати біль чи дискомфорт під час введення. Як вже обговорювалося, рідкі склади AMG 416 при фізіологічному рН або вище не залишаються стабільними протягом тривалого періоду часу. Таким чином, у переважному варіанті здійснення рідкий склад даного розкриття слабо забуферений так, щоб введена кількість швидко нейтралізувалася фізіологічними рідинами організму суб'єкта. Несподівано, що хороша стабільність і хороший контроль рН підтримується низькою концентрацією буфера. У переважному варіанті здійснення сіль HCl AMG 416 використовується в приготуванні рідкого складу, щоб мінімізувати буферну ємність. Оскільки HCl є сильною кислотою, вона не діє в якості буферу. Це надає переваги використанню більш слабкої кислоти, такої як оцтова кислота. Використання ацетатної солі AMG 416, наприклад, само по собі забезпечувало б деяку буферну ємність і дозволяло б встановити буферну ємність складу меншої гнучкості та може привести до складу, який більш стійкий до нейтралізації всередині організму і тому гірше переноситься. Оскільки AMG 416 є полікатіонним пептидом, ефект буде підвищеним у порівнянні з більшістю пептидів, які мають більш нейтральний характер. Як правило, бажано, щоб склад для введення внутрішньовенним, або іншим парентеральним шляхом, був ізотонічним із рідинами організму. У деяких варіантах здійснення склад даного розкриття містить фізіологічно прийнятний модифікатор тонічності. Модифікатори тонічності, корисні в даному розкритті, можуть включати хлорид натрію, маніт, сахарозу, декстрозу, сорбіт, хлорид калію, або їх суміші. У переважному варіанті здійснення модифікатором тонічності є хлорид натрію. Якщо засіб тонічності присутній, він переважно присутній у кількості, достатній, щоб зробити рідкий склад приблизно ізотонічним із рідинами організму (тобто, від приблизно 270 до приблизно 300 мОсм/л) та придатним для парентерального введення ссавцю, такому як суб'єктлюдина, внутрішньошкірно, підшкірно або внутрішньом'язово чи IV (внутрішньовенно). Ізотонічність може бути виміряна за допомогою, наприклад, осмометра конденсаційного або кріоскопічного типу. Залежно від концентрацій інших компонентів у складі, хлорид натрію присутній у складі в концентрації від приблизно 7,0 до приблизно 10 мг/мл, від приблизно 7,5 до приблизно 9,5 мг/мл, або від приблизно 8,0 до приблизно 9,0 мг/мл. В одному варіанті здійснення хлорид натрію присутній у складі в концентрації приблизно 8,5 мг/мл. В інших варіантах здійснення хлорид натрію присутній у складі в концентрації від 7,0 до 10 мг/мл, від 7,5 до 9,5 мг/мл, або від 8,0 до 9,0 мг/мл. Склади даного розкриття можуть включати в себе інші звичайні фармацевтичні носії, наповнювачі чи допоміжні засоби. Наприклад, склади даного винаходу можуть включати стабілізуючі засоби (наприклад, EDTA та/або тіосульфат натрію) або консерванти (наприклад, бензиловий спирт). Крім того, склади даного розкриття можуть включати в себе додаткові лікарські та/або фармацевтичні засоби. Наприклад, у способах лікування SHPT у пацієнтів з CKD-MBD на гемодіалізі AMG 416 може бути сумісно введено при нирковій остеодистрофії з одним або декількома активними засобами, такими як терапія з вітаміном D (наприклад, паракальцитол), яка є визнаним засобом для лікування SHPT. В одному варіанті здійснення склад має деструкцію менш ніж 5 %, коли зберігається при приблизно 2-8 °C протягом 1 року. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менш ніж 5 %, коли зберігається при кімнатній температурі протягом 1 року. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менше ніж 10 %, коли зберігається при приблизно 2-8 °C протягом 1 року. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менше ніж 10 %, коли зберігається при кімнатній температурі протягом 1 року. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менш ніж 5 %, коли зберігається при приблизно 2-8 °C протягом 2 років. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менш ніж 5 %, коли зберігається при кімнатній температурі протягом 2 років. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менш ніж 10 %, коли зберігається при приблизно 2-8 °C протягом 2 років. В іншому варіанті здійснення склад має деструкцію менш ніж 10 %, коли зберігається при кімнатній температурі протягом 2 років. В одному варіанті здійснення рідкий склад включає від 0,1 мг/мл до 20 мг/мл терапевтичного пептиду, буфер, який підтримує склад при рН від 2,0 до 5,0, і забезпечено достатню концентрацію хлориду натрію для того, щоб склад був приблизно ізотонічним. В іншому варіанті здійснення рідкий склад включає від 1 мг/мл до 15 мг/мл терапевтичного пептиду, буфер, який підтримує склад при рН від 2,5 до 4,5, і забезпечено достатню концентрацію хлориду натрію для того, щоб склад був приблизно ізотонічним. В іншому варіанті здійснення рідкий склад включає від 2,5 мг/мл до 10 мг/мл терапевтичного пептиду, буфер, який підтримує склад при рН від 2,5 до 4,0, і забезпечено достатню концентрацію хлориду натрію для того, щоб склад був приблизно ізотонічним. В іншому варіанті здійснення рідкий склад включає від 2,5 мг/мл до 5 8 UA 115373 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мг/мл терапевтичного пептиду, буфер, який підтримує склад при рН від 2,5 до 3,5, і забезпечено достатню концентрацію хлориду натрію для того, щоб склад був приблизно ізотонічним. В іншому варіанті здійснення склад включає від 2 мг/мл до 20 мг/мл терапевтичного пептиду у водному розчині, сукцинатний буфер, який підтримує склад при рН від приблизно 3,0 до приблизно 3,5, і забезпечено достатню концентрацію хлориду натрію для того, щоб склад був приблизно ізотонічним. В одному варіанті здійснення рідкий склад включає від 0,1 мг/мл до 20 мг/мл AMG 416, буфер, який підтримує склад при рН від 2,0 до 5,0, і в якому забезпечено достатню концентрацію хлориду натрію для того, щоб склад був приблизно ізотонічним. В іншому варіанті здійснення рідкий склад включає від 1 мг/мл до 15 мг/мл AMG 416, буфер, який підтримує склад при рН від 2,5 до 4,5, і в якому забезпечено достатню концентрацію хлориду натрію для того, щоб склад був приблизно ізотонічним. В іншому варіанті здійснення рідкий склад включає від 2,5 мг/мл до 10 мг/мл AMG 416, буфер, який підтримує склад при рН від 2,5 до 4,0, і в якому забезпечено достатню концентрацію хлориду натрію для того, щоб склад був приблизно ізотонічним. В іншому варіанті здійснення рідкий склад включає від 2,5 мг/мл до 5 мг/мл AMG 416, буфер, який підтримує склад при рН від 2,5 до 3,5, і в якому забезпечено достатню концентрацію хлориду натрію для того, щоб склад був приблизно ізотонічним. В іншому варіанті здійснення склад включає від 2 мг/мл до 20 мг/мл AMG 416 у водному розчині, сукцинатний буфер, який підтримує склад при рН від приблизно 3,0 до приблизно 3,5, і в якому забезпечено достатню концентрацію хлориду натрію для того, щоб склад був приблизно ізотонічним. У переважному варіанті здійснення склади даного розкриття отримують шляхом розміщення деякої кількості буфера, розрахованої для створення потрібного рН у підходящій посудині і його розчинення у воді для ін'єкцій (WFI), додавання деякої кількості речовини (наприклад, солі гідрохлориду AMG 416), достатньої для досягнення потрібної концентрації активного інгредієнта (наприклад, AMG 416), додавання деякої кількості модифікатора тонічності (або суміші модифікаторів тонічності), обчисленої для надання отриманому складу ізотонічності із рідинами організму, і додавання кількості WFI, необхідної для доведення загального об'єму до потрібної концентрації. Після того, як інгредієнти змішують, рН доводиться до рівня від приблизно 3,0 до приблизно 3,5, і компоненти знову перемішуються. Якщо регулювання потрібно для того, щоб досягти бажаного діапазону рН, значення рН може бути доведено за допомогою відповідних розчинів; з кислими розчинами, якщо вказано зменшення значення рН, і лужним розчином, якщо вказано збільшення значення рН. Прикладами придатних кислотних розчинів без обмеження є, наприклад, хлористоводнева кислота, фосфорна кислота, лимонна кислота і гідрофосфат натрію або калію. Прикладами придатних лужних розчинів без обмеження є гідроксиди лужних та лужноземельних металів, карбонати лужних металів, ацетати лужних металів, цитрати лужних металів і гідрофосфати лужних металів, наприклад, гідроксид натрію, ацетат натрію, карбонат натрію, цитрат натрію, гідрофосфат динатрію або дикалію, або аміак. Процедура, як правило, проводиться при температурі від приблизно 2-8 °C до приблизно 50 °C та при атмосферному тиску. Отриманий склад потім може бути перенесений в однодозові або багатодозові контейнери (такі як пляшки, флакони, ампули або попередньо заповнені шприци) для зберігання до моменту використання. Склади можуть бути отримані та введені, як описано вище. В якості альтернативи, склади можуть бути введені після розчинення, диспергування та ін. складу (отриманого, як описано вище) у такому носії, як, наприклад, рідина для інфузій або кров/рідина, повернена пацієнту під час гемодіалізу (наприклад, під час зворотного переливання). Отримання рідких складів відповідно до даного розкриття є відомим або буде очевидним для спеціалістів у даній галузі, наприклад, див. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 17th edition, 1985. ПРИКЛАДИ Наступні приклади, у тому числі проведених експериментів та отриманих результатів, наведені тільки в ілюстративних цілях і не повинні бути витлумачені як обмеження обсягу прикладеної формули винаходу. ПРИКЛАД 1 Розчинність AMG 416 у сукцинатно-сольовому буферному розчині У даному дослідженні була досліджена розчинність AMG 416 у сукцинатно-сольовому буферному розчині. AMG 416 HCl (103 мг порошку, 80 мг пептиду) був розчинений у 200 мкл сольового буферного розчину сукцинату натрію (25 мM сукцинату, 0,9 % фізіологічного розчину, pH 4,5). Після короткочасного струшування був отриманий прозорий розчин з номінальною концентрацією 400 мг/мл. Оскільки розширення об'єму розчину не було визначено, розчинність 9 UA 115373 C2 5 10 15 AMG 416 може бути із запасом вказана як щонайменше 200 мг/мл. Хоча максимальна розчинність в цьому експерименті не була визначена, AMG 416 є розчинним у сукцинатносольовому буферному розчині з рН 4,5 до концентрацій щонайменше 200 мг/мл. ПРИКЛАД 2 Дослідження залежної від концентрації стабільності У даному дослідженні була досліджена стабільність AMG 416 у діапазоні концентрацій в сукцинатно-сольовому буферному розчині (pH 4,5). Розчин 200 мг/мл AMG 416 з прикладу 1, див. вище, був додатково розведений з використанням 200 мкл сукцинатно-сольового буферного розчину (pH 4,5) до номінальної концентрації 200 мг/мл, яку серійно розвели сукцинатно-сольовим буферним розчином (pH 4,5) до 66, 20, 6,7, 2,2 та 0,67 мг/мл. Зразки були витримані при кімнатній температурі (тобто приблизно 25 °C) та аліквоти були проаналізовані за допомогою HPLC з інтервалами до 29 днів. Друга серія зразків AMG 416, що охоплюють діапазон концентрацій від 20 до 0,67 мг/мл, була інкубувана при 40 °C і проаналізована тим же чином. Чистота у 29-денний момент часу для зразків при кімнатній температурі та 40 °C наведено у таблицях 1 та 2 відповідно. Результати забезпечують профіль стабільності AMG 416 в залежності від концентрації та температури. Таблиця 1 Стабільність AMG 416 при RT у 25 мM сукцинатно-сольовому буферному розчині (pH 4,5) Чистота за часом (дні) Концентрація (мг/мл) 0 1 2 5 13 29 200 99,8 99,6 98,4 96,4 89,0 63,8 66 99,6 99,4 99,0 98,1 97,7 91,5 20 6,7 2,2 0,67 99,6 99,4 99,3 99,4 99,7 99,6 99,2 99,5 99,7 99,5 99,3 99,5 99,6 99,5 99,4 99,7 99,3 99,3 99,3 99,5 98,7 98,9 99,1 99,3 Таблиця 2 Стабільність AMG 416 при 40 °C у 25 мM сукцинатно-сольовому буферному розчині (pH 4,5) Чистота за часом (дні) 2 5 98,1 н.д. Концентрація (мг/мл) 20 0 99,6 1 99,1 6,7 99,4 99,1 98,7 2,2 99,3 99,3 0,67 99,4 99,4 13 90,5 29 72,9 н.д. 95,2 90,0 99,0 98,4 97,0 94,3 99,3 99,0 97,2 94,4 20 25 30 Залежність від часу деструкції AMG 416 в залежності від концентрації при кімнатній температурі показано на фігурі 1A. На фігурі 1B масштаб збільшено щоб чіткіше проілюструвати характер деструкції при концентраціях препарату 20 мг/мл та нижче. Залежність деструкції AMG 416 від часу в залежності від концентрації при 40 °C показано на фігурі 2. Дані показують, що стабільність розчину AMG 416 залежить від концентрації у діапазоні дослідження від 0,67 мг/мл до 200 мг/мл. Дані також показують, що стабільність розчину AMG 416 залежить від температури інкубації. Таблиця 3 вказує прогнози ступеня деструкції для розчинів різних концентрацій AMG 416 при кімнатній температурі на основі ступеня деструкції на 29 день, зберігання при кімнатній температурі в SBS з рН 4,5. Дані на 29 день при кімнатній температурі з таблиці 1 були екстраполювані на вказаний період часу за припущення лінійної кінетики деградації. Дані при кімнатній температурі були екстраполювані на 5 °C. 20 °C різниця була припущена еквівалентною 4-кратному зниженню швидкості деструкції. Екстраполяції були проведені із використанням простого застосування рівняння Ареніуса, де при підвищенні температури на 10 UA 115373 C2 10 °C забезпечується 2-кратне збільшення швидкості реакції, припускаючи той самий механізм реакції і те, що енергія активації для кожної відповідної реакції становить близько 50 кДж/моль. Заштриховані значення вказують концентрації/умови зберігання, які мають деструкцію менше 10 % деградацією, що може бути перевагою для рідкого складу. 5 Таблиця 3 Прогнози стабільності для розчинів AMG 416 Прогнозований ступінь деструкції за: Концентрація (мг/мл) 1 рік RT 2 роки 5 °C 1 рік 5 °C 66 >100 >100 50,1 25,0 20 20,9 10,4 5,2 2,6 6,7 2,2 13,9 5,2 7,0 2,6 3,5 1,3 1,7 0,7 0,67 10 2 роки RT 2,7 1,4 0,7 0,3 Порівняння даних, показаних у таблицях 1 і 2, дозволяє оцінити підвищення температури в якості інструменту, щоб спрогнозувати довгострокову стабільність розчинів AMG 416. Дані від 0,67 до 20 мг/мл представлені в таблиці 4, див. нижче, та показують збільшення деструкції при 40 °C, яка помітно вища, ніж передбачено рівнянням Ареніуса (з описаними припущеннями, див. вище). Це свідчить, що прискорені дані стабільності будуть прогнозувати більший ступінь деструкції, ніж буде спостерігатися при фактичній температурі зберігання. Таблиця 4 Залежність температури та концентрації від деструкції AMG 416 у розчині із pH 4,5 Концентрація (мг/мл) Деструкція на 29 день, RT (%) Деструкція на 29 Прискорення RT -> день, 40 40C (згортання) С (%) Очікуване прискорення (згортання) 20 25 30 29,7 4 9,4 18,8 4 0,2 5,0 25,0 4 0,67 20 26,7 0,5 2,2 15 0,9 6,7 0,1 5,0 50,0 4 ПРИКЛАД 3 Стабільність рідких складів AMG 416 у діапазоні pH У даному дослідженні стабільність рідких складів AMG 416 у концентрації 10 мг/мл була визначена в діапазоні pH в сукцинатно-сольовому буферному розчині. AMG 416 HCl (257 мг порошку) був розчинений у 20 мл сукцинатно-сольового буферного розчину з pH 4,5,щоб отримати концентрації пептиду 10,0 мг/мл (з поправкою на вміст пептиду в порошку). Розчин був рівномірно розділений на п'ять частин по 4 мл, в яких було доведено рН до 2, 3, 4, 5 і 6 відповідно за допомогою NaOH та HCl за необхідності. Три розчини по 1 мл були відібрані аліквотами із кожної частини та інкубовані при 2-8 °C, кімнатній температурі (приблизно 25 °C) та 40 °C відповідно. Розчин 1 мл, що залишився у кожній аліквоті, був розведений сукцинатносольовим буферним розчином з pH 4,5 до 4 мл з концентрацією пептиду 2,5 мг/мл, доведений за pH та інкубований таким же чином. Зразки були отримані згідно з графіком та розведені деіонізованою водою до 1,0 мг/мл для аналізу HPLC. Чистота в 28-денний момент часу для всіх перевірених зразків наведена у таблиці 5 (примітка: початкове значення чистоти для цього дослідження склало 99,3 %). Результати забезпечують профіль стабільності в залежності від рН, температури та концентрації. 11 UA 115373 C2 Таблиця 5 Чистота в 28-денний момент часу для розчинів AMG 416 pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 5 10 15 20 25 10 мг/мл RT 98,7 99,1 98,6 93,8 71,8 2-8 °C 99,1 99,4 99,4 99,0 96,9 40 °C 94,0 98,2 85,0 64,4 53,6 2-8 °C 98,9 99,1 99,2 98,9 97,0 2,5 мг/мл RT 98,7 99,0 98,9 96,1 80,0 40 °C 89,8 97,2 92,2 73,0 52,9 Залежність від часу деструкції AMG 416 в залежності від рН показано на фігурі 3. В обох розчинах, 10 мг/мл (фігура 3A) та 2,5 мг/мл (фігура 3B), найменша деструкція спостерігається при pH 3. В обох розчинах деструкція при pH 6 відбувається найшвидше з чистотою, що наближається до 50 % біля 29-денного моменту часу. Аналіз HPLC показав, що основний продукт розпаду при pH 2 відрізняється від спостереженого при pH більше, ніж 3. За більш низького pH деструкція має місце переважно внаслідок деамідування шляхом гідролізу, а за більш високого pН деструкція являє собою переважно утворення гомодимерів. Профіль стабільності в залежності від pH у 28-денний момент часу показано на фігурі 4. Знов можна бачити як при 10 мг/мл (фігура 4A), так і при 2,5 мг/мл (фігура 4B), що у даній серії експериментів pH найменшої деструкції складає приблизно 3,0. Крім того, зменшення чистоти пов'язано з температурою на всіх рівнях pH з найменшою деструкцією, що спостерігається у зразках, інкубованих при 2-8 °C, та найбільшою деструкцією, що спостерігається у зразках, інкубованих при 40 °C. На підставі ступеня деструкції на 28 день були розраховані прогнози ступеня деструкції, як описано, див. вище. Прогнози для розчину 10 мг/мл наведено у таблиці 6 та прогнози для розчину 2,5 мг/мл наведено у таблиці 7. Заштриховані значення вказують умови, які демонструють деструкцію менше 10 % та які можуть бути переважними для рідкого складу. Умови, за яких зразок на 28 день показав дещо вищу чистоту, ніж вихідні дані, представлено як 0,0 % для всіх проекцій. Ці екстраполяції свідчать про деструкцію менше 10 % через 2 роки при кімнатній температурі для розчинів 2,5 або 10 мг/мл при pH 3. В цілому, дані за більш високої температури прогнозують більшу деструкцію у 2 роки, ніж дані за більш низької температури. Таким чином, для досліджень 10 мг/мл (таблиця 6), у той час, як pH 3 прогнозує деструкцію менше 10 % за усіх температурних даних, дані при 2-8 °C прогнозують менший ступінь деструкції, ніж за більш високих температур, і дійсно, при 2-8 °C дані за умов pH 4 також підтримують деструкцію менше 10 %. Так само, при 2,5 мг/мл діапазону pH 2-4 за прогнозами має деструкцію менше 10 % протягом 2 років у RT шляхом екстраполяції даних при 2-8 °C. Таблиця 6 Прогнози стабільності для розчинів AMG 416 10 мг/мл на підставі ступеня деструкції на 28 день 2-8 °C Спостережувана деструкція на 28 день (%) pH=2 pH=3 pH=4 pH=5 pH=6 0,3 -0,2 -0,1 0,3 1,9 Розрахована деструкція за 360 днів (%) 3,8 0,0 0,0 3,5 23,9 30 12 за 1 рік RT (%) 15,4 0,0 0,0 13,8 95,7 за 2 роки 5 °C (%) 7,7 0,0 0,0 6,9 47,8 за 2 роки RT (%) 30,7 0,0 0,0 27,6 >100 UA 115373 C2 Продовження таблиці 6 RT Спостережувана деструкція на 28 день (%) pH=2 pH=3 pH=4 pH=5 pH=6 0,6 0,2 0,7 5,6 26,9 40 °C Спостережувана деструкція на 28 день (%) pH=2 pH=3 pH=4 pH=5 pH=6 5,3 1,1 14,3 34,9 45,1 Розрахована деструкція за 360 днів (%) 8,1 2,6 8,6 71,4 >100 за 1 рік RT (%) 8,1 2,6 8,6 71,4 >100 за 2 роки 5 °C (%) 4,0 1,3 4,3 35,7 >100 за 2 роки RT (%) 16,1 5,1 17,1 >100 >100 Розрахована деструкція за 360 днів (%) 68,4 14,1 >100 >100 >100 за 1 рік RT (%) 17,1 3,5 45,8 >100 >100 за 2 роки 5 °C (%) 8,6 1,8 22,9 55,9 72,2 за 2 роки RT (%) 34,2 7,0 91,7 >100 >100 Таблиця 7 Прогнози стабільності для розчинів AMG 416 2,5 мг/мл на підставі ступеня деструкції на 28 день Розрахована деструкція (%) 2-8 °C Спостережувана деструкція на 28 день (%) 1 рік 2-8 °C 1 рік RT 2 роки 2-8 °C 2 роки RT pH=2 pH=3 pH=4 pH=5 pH=6 0,0 0,0 -0,1 0,2 0,8 0,0 0,0 0,0 2,9 10,7 0,0 0,0 0,0 11,8 43,0 0,0 0,0 0,0 5,9 21,5 0,0 0,0 0,0 23,5 86,0 RT Спостережувана деструкція на 28 день (%) 1 рік 1 рік RT 2 роки 2-8 °C 2 роки RT pH=2 pH=3 pH=4 pH=5 pH=6 0,6 0,0 0,3 2,9 18,1 7,9 0,0 3,6 37,7 231,0 7,9 0,0 3,6 37,7 231,0 4,0 0,0 1,8 18,9 115,5 15,9 0,0 7,2 75,5 462,1 40 °C Спостережувана деструкція на 28 день (%) 1 рік 1 рік RT 2 роки 2-8 °C 2 роки RT pH=2 pH=3 pH=4 pH=5 pH=6 9,1 1,8 6,9 26,1 45,0 116,5 22,5 88,7 333,6 575,7 29,1 5,6 22,2 83,4 143,9 14,6 2,8 11,1 41,7 72,0 58,3 11,3 44,3 166,8 287,8 Розрахована деструкція (%) Розрахована деструкція (%) 13 UA 115373 C2 Таблиця 8 представляє ефект температурного прискорення для цих даних подібним чином до таблиці 4, див. вище. Це ще раз показує, що підвищення температури, як правило, забезпечує більше прискорення деструкції, ніж очікується шляхом екстраполяції на основі простого застосування принципів Ареніуса. 5 Таблиця 8 Температурне прискорення в залежності від pH Прискорення: дані 10 мг/мл 28 д Дес 10 мг/мл pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 10 15 20 25 30 2-8 °C 0,2 -0,1 -0,1 0,3 2,4 RT 0,6 0,2 0,7 5,6 27,5 40 °C 5,3 1,1 14,3 34,9 45,7 RT/ 2-8 очікуване 40C/ 2-8 3 >2 >7 19 12 4 4 4 4 4 28 >10 >100 116 19 очікуване 40C/ очікуване RT 16 9 4 16 6 4 16 22 4 16 6 4 16 2 4 При кожному значенні pH дані деструкції для кожної з трьох температур порівнюються із даними для інших двох температур для обчислення спостереженого прискорення. Прогнозоване прискорення отримується простим застосуванням принципів Ареніуса, як описано вище. Як описано, див. нижче, аналіз HPLC показує, що переважний механізм деструкції при pH менше ніж приблизно 3 відрізняється від спостереженого при pH більше ніж приблизно 3. ПРИКЛАД 4 Ефект наповнювачів для тонічності на стабільність У цьому дослідженні були визначені ефекти різних фармацевтичних наповнювачів на стабільність AMG 416 в рідкому складі. Були приготовані розчин 10 мг/мл AMG 416 та вихідні розчини маніту, гліцину, аргініну, NaCl та Na2SO4 у 2x ізотонічних концентраціях. Значення рН розчину AMG 416 і п'яти розчинів наповнювачів та деіонізованої води окремо були доведені до рН 3,5 за допомогою HCl/NaOH. Аліквоти 500 мкл кожного з шести розчинів були додані у скляні флакони, а 500 мкл розчину AMG 416 були додані в ті самі флакони і добре перемішані. Це було виконано тричі для одержання вісімнадцяти флаконів зі зразками, кожен з яких містить 5 мг/мл AMG 416 та ізотонічну концентрацію наповнювача (або деіонізовану воду). Це було повторено з набором розчинів, доведених до pH 4,5, із одержанням додаткових вісімнадцяти флаконів зі зразками. Зразки були інкубовані та перенесені для аналізу HPLC у відповідні моменти часу. Дані стабільності у 56-денний момент часу показано у таблиці 9. Діапазон стабільних властивостей був спостережений залежно від наповнювача. За більшості перевірених умов склади з NaCl продемонстрували найменшу величину деструкції. Винятками є дані для 2-8 °C при pH 3,5 та 4,5. Більша варіабельність спостережена для інших наповнювачів, хоча аргінін виявився шкідливим у зразках при 40 °C та у зразку з рН 4,5 при кімнатній температурі (приблизно 25 °C), а сульфат натрію виявився шкідливим у зразках з рН 4,5 при кімнатній температурі та при 40 °C. 14 UA 115373 C2 Таблиця 9 Ступінь деструкції (%) на 56 день для розчину 5 мг/мл AMG 416 Темп pH 2-8 °C 40 °C RT 4,5 3,5 4,5 3,5 4,5 ДІ Вода 0,0 0,7 1,0 3,6 8,2 24 Маніт 0,0 0,5 0,5 2,2 4,9 23 Gly Arg NaCI 0,0 0,0 0,1 0,6 0,5 1,1 0,6 0,6 0,3 6,4 29 1,8 17 28 3,0 28 67 18 Na2SО4 5 3,5 0,0 0,4 0,4 51 9,4 30 Таблиця 10 екстраполює дані зберігання у 2 роки при кімнатній температурі, та спостерігається аналогічна тенденція, як обговорено, див. вище, в тому, що зберігання за вищої температури, загалом, прогнозує більш швидку деструкція, ніж очікується за допомогою простого застосування принципів Ареніуса. Таблиця 10 Прогнозований ступінь деструкції (%) для розчинів 5 мг/мл AMG 416 після 2 років зберігання при кімнатній температурі Темп pH ДІ Вода Маніт Gly Arg NaCI Na2SО4 10 15 20 25 2-8 °C 40 °C RT 3,5 1 0 3 2 4 4,5 35 28 31 27 56 3,5 13 7 8 7 4 4,5 47 28 83 >100 24 3,5 27 16 55 90 10 4,5 77 75 90 >100 58 2 22 5 >100 31 98 Дані показують, що хлорид натрію може бути придатним модифікатором тонічності для складів розчину AMG 416. ПРИКЛАД 5 Стабільність розчину у різних буферах У даному дослідженні була оцінена стабільність рідких складів AMG 416 у чотирьох різних буферах протягом 9 днів. Буферні сольові розчини були приготовані у концентрації 25 мM, pH 4,5 для чотирьох різних аніонних буферів у формі натрієвої солі: ацетатного, цитратного, лактатного та сукцинатного. AMG 416 HCl (порошок) був розчинений у кожному буферному розчині, щоб одержати розчин 2,5 мг/мл, і рН був доведений до 4,5 за допомогою HCl/NaOH. Розчини були додатково розбавлені буфером з pH 4,5 до 1,0 мг/мл та 0,25 мг/мл. Кожний з отриманих розчинів був розділений на два скляних флакони для HPLC, один зберігався при 28 °C, а інший – при кімнатній температурі (приблизно 25 °C). Аналіз HPLC був проведений на 0, 4 і 9 дні для визначення активності та чистоти. Чистота AMG 416 у більшості зразків на всіх моментах часу склала 100 % за винятком декількох невеликих піків для зразку цитрату на 9 день, що можна віднести до початкової варіації. В усіх перевірених буферах AMG 416 показав хорошу стабільність протягом 9-денного дослідження. ПРИКЛАД 6 Стабільність у буферних розчинах з pH 2,25, 2,5 3,0 та 3,5 У даному дослідженні була досліджена стабільність рідкого складу AMG 416 за умов низького pH. Сукцинатно-сольовий буферний розчин (10 мM, pH 3,5) був приготований шляхом розчинення 59 мг бурштинової кислоти у 45 мл лабораторно обробленої (деіонізованої) води та 15 UA 115373 C2 5 10 15 доведення pH до 3,5 за допомогою 1 N HCl та 1 N NaOH за необхідності та q.s. до 50 мл. У такий спосіб був приготований буферний розчин лактату натрію 10 мM, pH 3,5 (56 мг/50 мл). AMG 416 HCl (128 мг порошку) був розчинений у 20 мл сукцинатного буфера, щоб забезпечити розчин 5 мг/мл AMG 416, який був розділений на дві рівні частини по 10 мл. NaCl (90 мг) додали до одної частини, а маніт (500 мг) додали до іншої. Кожна частина об'ємом 10 мл була знов розділена на дві рівні частини по 5 мл, і pH був доведений до 2,25 та 3,5, відповідно, за допомогою 1 N HCl та 1 N NaOH. У такий спосіб були приготовані чотири розчини по 5 мл за допомогою лактатного буфера. По 1,0 мл кожного з (восьми) отриманих розчинів було додано до 3 флаконів для зразків сироватки. Крім того, сукцинатно-сольовий буферний розчин AMG 416 з pH 2,25, що залишився, який містить NaCl, був доведений до pH 2,5, та аліквоти по 0,5 мл були додані до 3 флаконів для зразків сироватки, а сукцинатно-сольовий буферний розчин з NaCl з pH 3,5, що залишився, був доведений до pH 3,0, та аліквоти по 0,5 мл були додані до 3 флаконів для зразків сироватки. Див. таблицю 11. У кожний момент часу (0, 2, 8, 12 і 24 тижні) всі 30 зразків були повернуті зі зберігання, були урівноважені із кімнатною температурою (приблизно 25 °C), та аліквота на 100 мкл була розведена до 0,5 мг/мл водою для аналізу RP-HPLC. Зразки, що залишилися, були знов запечатані та повернуті до їх відповідних умов зберігання. Таблиця 11 Опис номерів зразків pH 2,25 Буфер Наповнювач 2-8 °C RT 40 °C 20 25 30 Лактат NaCl Маніт 1 2 9 10 17 18 3,5 Сукцинат NaCl Маніт 3 4 11 12 19 20 Лактат NaCl Маніт 5 6 13 14 21 22 2,5 Сукцинат NaCl Маніт 7 8 15 16 23 24 3,0 Сукцинат NaCl NaCl 25 28 26 29 27 30 Репрезентативні дані HPLC для цього дослідження показано на фігурах 5 та 6. Крива HPLC, показана на фігурі 5, являє собою зразок з pH 2,25, що зберігався 67 днів при 40 °C (5 мг/мл, 87,8 % чистота). На фігурі 5B показано інший масштаб, щоб побачити домішки. На фігурі 6 проілюстровано ефект підвищення pH до 3,5 для в усьому іншому еквівалентного складу (pH 3,5, 40 °C, 5 мг/мл, 67 днів, 91,7 % чистота). На фігурі 6B показано інший масштаб, щоб побачити домішки. Як і в попередньому дослідженні, проявляється помітне розходження в профілі продуктів розпаду при змінах рН. Чистота AMG 416 залежно від часу представлена у таблиці 12 (концентрація 10 мM буфера: L = лактат; S = сукцинат. модифікатор тонічності: N=0,9 % NaCl; M=5 % маніт). Слід зазначити, що використана партія містила 3,4 % димера у момент часу 0. 14-денний момент часу для зразка 26 було опущено через помилку у підготовці зразка. Відібрані тенденції даних представлено у графічній формі на фігурах 7-9. Таблиця 12 Стабільність розчину AMG 416 5 мг/мл до 67 днів у буферному розчині Чистота (%) у момент часу (дні) Зразок pH Темп Буфер Тоніч. 0 14 27 49 67 1 2 3 4 5 2,25 2,25 2,25 2,25 3,5 5 5 5 5 5 L L S S L N M N M N 96,8 96,8 95,6 95,4 96,9 96,4 96,4 95,1 95,1 96,6 97,0 95,9 95,1 95,4 96,4 95,7 96,0 94,6 94,0 95,8 95,7 95,7 93,8 94,0 96,2 16 UA 115373 C2 Продовження таблиці 12 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 5 10 15 20 25 30 3,5 3,5 3,5 2,25 2,25 2,25 2,25 3,5 3,5 3,5 3,5 2,25 2,25 2,25 2,25 3,5 3,5 3,5 3,5 2,5 2,5 2,5 3,0 3,0 3,0 5 5 5 25 25 25 25 25 25 25 25 40 40 40 40 40 40 40 40 5 25 40 5 25 40 L S S L L S S L L S S L L S S L L S S S S S S S S M N M N M N M N M N M N M N M N M N M N N N N N N 96,8 95,3 95,4 96,9 96,9 95,3 95,6 96,6 96,5 95,3 95,8 96,7 96,5 95,3 95,4 96,7 96,6 95,3 95,6 95,4 95,2 95,3 95,4 95,6 95,3 96,9 95,7 95,2 96,4 96,6 94,2 94,5 96,3 96,2 95,1 95,3 91,9 93,8 89,9 91,8 94,3 92,2 92,3 91,6 94,9 НД 92,3 95,4 94,9 92,5 96,9 95,5 95,1 95,2 95,6 93,9 94,1 96,3 95,3 94,8 94,7 87,8 89,5 86,9 89,6 91,7 85,9 89,3 88,5 95,2 94,5 90,3 94,9 95,0 90,0 96,0 95,0 95,1 94,0 93,2 91,7 92,5 94,7 94,8 93,4 93,5 83,5 86,6 80,4 85,3 89,5 79,5 86,8 84,2 94,8 93,2 85,0 94,7 93,9 86,9 94,5 95,0 94,4 92,8 94,9 90,6 92,1 95,2 93,3 93,3 93,6 79,4 83,0 76,3 82,9 86,2 77,3 84,2 80,3 94,4 93,2 82,4 94,9 94,2 85,2 Фігура 7 представляє стабільність розчину AMG 416 (5 мг/мл) у сукцинатно-сольовому буферному розчині в залежності від pH в охолодженому стані (2-8 °C). Фігура 8 представляє стабільність розчину AMG 416 (5 мг/мл) у сукцинатно-сольовому буферному розчині в залежності від pH після зберігання при кімнатній температурі. Фігура 9 представляє стабільність розчину AMG 416 (5 мг/мл) у сукцинатно-сольовому буферному розчині в залежності від pH після зберігання при 40 °C. Профіль продуктів розпаду в останній момент часу представлено у таблиці 13, а динаміка появи двох основних продуктів розпаду (C-кінцевого деамідування та утворення гомодимерів) показана в таблицях 14 та 15. Фігури 10 та 11 представляють динаміку деградації для цих індивідуальних продуктів (C-кінцевого деамідування та утворення гомодимерів, відповідно) залежно від pH для окремих складів (тих складів, для яких доступний повний набір умов pH, тобто тих, які містять NaCl та сукцинат, але не лактат або маніт). Фігура 10 вказує на чітку залежність деамідування від pH з суттєво більшою деградацією за цим шляхом при pH 2,25, ніж за більш високого pH, та пряме співвідношення між pH та кількістю деамідування. На противагу цьому, формування гомодимера, наведене на фігурі 11, демонструє протилежний взаємозв'язок між pH та ступенем деструкції. Ці протилежні тенденції лежать в основі даних загальної стабільності, представлених на фігурах 7-9, а максимальна стабільність розчинів AMG 416 в цій серії експериментів спостерігалась при рН 3,0±0,5. Кореляція між стабільністю та композицією наповнювачів є менш чіткою. Що стосується вибору буфера (сукцинат проти лактату), огляд даних таблиць 12-14 не вказує на чітку картину переваг для якогось буфера по відношенню до будь-якого з основних продуктів розпаду при рН 2,25 або 3,5. Всі зразки із сукцинатним буфером показали нижчу чистоту у момент часу 0, ніж відповідні зразки з лактатним буфером, внаслідок більшої інтеграції гомодимерного піку. Причина цього не ясна, хоча і може вказати на зміну у відносній оптичній щільності для вихідної сполуки та димера залежно від буферу. Однак, як зазначено вище, подальша інкубація забезпечує практично ідентичну швидкість деструкції в присутності будь-якого буфера. Що стосується вибору модифікатора тонічності (NaCl або маніт), хлорид натрію, як видається, підвищує швидкість деамідування при рН 2,25 (див. таблицю 13, зразки 9-12 при 25 °C і, 17 UA 115373 C2 особливо, зразки 17-20 при 40 °C). Однак NaCl, як видається, гальмує (у порівнянні з манітом) деструкцію до гомодимера при pH 3,5 (таблиця 14, зразки 13-16 при 25 °C і, особливо, зразки 21-24 при 40 °C). Таблиця 13 Профіль продуктів розпаду для розчину AMG 416 (5 мг/мл) через 67 днів t=67 днів pH Темп Буфер Тоніч. 2,25 2,25 2,25 2,25 3,5 3,5 3,5 3,5 2,25 2,25 2,25 2,25 3,5 3,5 3,5 3,5 2,25 2,25 2,25 2,25 3,5 3,5 3,5 3,5 2,5 2,5 2,5 3,0 3,0 3,0 5 5 5 5 5 5 5 5 25 25 25 25 25 25 25 25 40 40 40 40 40 40 40 40 5 25 40 5 25 40 L L S S L L S S L L S S L L S S L L S S L L S S S S S S S S N M N M N M N M N M N M N M N M N M N M N M N M N N N N N N Основні домішки (% загальної площі) Димер Димер Деацетил Трисульфід трисульфід 9,3 хв. 7,4 хв. 8,2 хв. 9,5 0,4 0,6 0,8 0,1 0,1 1,6 0,1 -0,1 0,3 0,3 0,9 0,4 0,3 0,4 0,4 0,9 1,4 3,1 1,8 2,1 0,1 0,4 0,7 2,9 1,6 0,6 2,0 0,3 0,0 0,2 3,1 2,4 0,6 2,5 0,3 7,4 1,0 0,7 17,0 0,5 1,0 8,1 0,6 0,1 0,6 11,7 0,7 1,3 0,5 0,2 0,4 1,1 0,4 1,9 0,2 0,4 1,3 0,1 5,5 0,6 0,6 0,5 Кислота 8,1 хв. 0,8 0,5 0,8 1,1 1,2 0,2 0,7 2,5 1,2 3,1 1,6 0,2 13,9 8,7 14,2 8,9 1,4 0,5 1,0 1,0 0,5 1,5 8,4 2,4 5 Концентрація 10 мM буферу: L = лактат; S = сукцинат. Модифікатор тонічності: N=0,9 % NaCl; M=5 % маніт). Значення % димера відображає підвищення продукту розпаду після відрахування початкового значення. 18 UA 115373 C2 Таблиця 14 Деамідування розчину AMG 416 (5 мг/мл) у моменти часу до 67 днів Зразок 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 5 10 pH 2,25 2,25 2,25 2,25 3,5 3,5 3,5 3,5 2,25 2,25 2,25 2,25 3,5 3,5 3,5 3,5 2,25 2,25 2,25 2,25 3,5 3,5 3,5 3,5 2,5 2,5 2,5 3,0 3,0 3,0 Темп 5 5 5 5 5 5 5 5 25 25 25 25 25 25 25 25 40 40 40 40 40 40 40 40 5 25 40 5 25 40 Буфер L L S S L L S S L L S S L L S S L L S S L L S S S S S S S S Тоніч. N M N M N M N M N M N M N M N M N M N M N M N M N N N N N N % продукту розпаду у момент часу (дні) 0 14 27 49 67 0,1 0,7 0,8 0,9 0,8 0,5 0,4 0,8 0,8 0,3 1,1 0,3 0,4 1,2 0,2 0,7 1,3 1,6 2,5 1,2 1,2 1,2 1,1 1,4 2,0 3,1 0,7 1,0 1,3 1,6 0,2 3,4 2,5 3,9 2,3 2,0 1,0 6,6 4,8 6,6 4,2 0,9 0,5 1,0 0,4 10,2 7,0 11,0 6,4 0,9 0,6 1,0 0,3 0,7 3,3 1,3 6,7 13,9 8,7 14,2 8,9 1,4 0,5 1,0 1,0 0,5 1,5 8,4 0,3 2,2 2,4 Концентрація 10 мM буферу: L=лактат; S=сукцинат. Модифікатор тонічності: N=0,9 % NaCl; M=5 % маніт). Максимальна стабільність розчинів AMG 416 у цьому наборі експериментів спостерігалась при pH 3,0±0,5. Швидкість загальної деструкції при pH 2,5 та 3,5 є аналогічною, але профіль продуктів розпаду – різний. Стабільність при pH 2,25 є нижчою внаслідок спостереженої більшої кількості деамідування. У той час, як деякий ефект наповнювача можна спостерігати за профілем стабільності, дані не вказують на загальну перевагу серед досліджених систем наповнювачів, складених при рН 3,0. 19 UA 115373 C2 Таблиця 15 Деградація AMG 416 до гомодимера в розчині 5 мг/мл у моменти часу до 67 днів Зразок 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 5 10 15 pH 2,25 2,25 2,25 2,25 3,5 3,5 3,5 3,5 2,25 2,25 2,25 2,25 3,5 3,5 3,5 3,5 2,25 2,25 2,25 2,25 3,5 3,5 3,5 3,5 2,5 2,5 2,5 3,0 3,0 3,0 Темп 5 5 5 5 5 5 5 5 25 25 25 25 25 25 25 25 40 40 40 40 40 40 40 40 5 25 40 5 25 40 Буфер L L S S L L S S L L S S L L S S L L S S L L S S S S S S S S Тоніч. N M N M N M N M N M N M N M N M N M N M N M N M N N N N N N 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Димер (% підвищення) 14 27 49 0,5 -0,1 0,5 0,4 0,0 0,0 0,5 0,1 0,1 0,3 0,0 0,2 0,2 0,1 0,2 -0,1 0,0 0,2 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,1 -0,1 0,5 0,4 0,5 0,3 0,1 0,5 -0,1 0,0 0,0 0,5 0,5 0,2 0,3 0,3 0,9 0,4 0,3 1,5 0,2 0,5 1,1 0,5 1,0 1,4 0,6 0,8 0,5 0,0 0,3 0,6 0,5 0,4 0,8 0,6 0,6 1,3 2,4 3,7 5,5 4,1 9,5 15,0 2,8 4,6 6,3 3,7 6,6 9,0 0,4 0,2 0,0 0,1 0,5 0,6 0,6 1,5 0,0 0,5 0,2 0,6 0,6 0,9 1,6 3,2 4,8 67 0,4 0,6 0,8 0,1 0,1 1,6 0,1 -0,1 0,3 0,4 0,4 0,9 1,4 3,1 1,8 2,1 0,4 1,6 0,0 2,4 7,4 17,0 8,1 11,7 0,5 0,2 1,1 0,2 1,3 5,5 (концентрація 10 мM буферу: L = лактат; S = сукцинат. Модифікатор тонічності: N=0,9 % NaCl; M=5 % маніт). Слід зазначити, що деструкція виражена як підвищення вмісту димера (не димерів загалом), оскільки API (активний фармацевтичний інгредієнт), використаний для даного експерименту, містив помітну кількість димера. Максимальна стабільність розчинів AMG 416 у цьому наборі експериментів спостерігалась при pH 3,0±0,5. Аналіз розчинів, складених при pH 2,5 або 3,5, продемонстрував різні профілі деструкції, при тому що C-кінцевий амідний гідроліз був найбільшим продуктом розпаду при низькому pH, тоді як утворення гомодимера було найбільшим при більш високому pH. Рідкі склади із pH 3,0 спрогнозували загальну деструкцію на рівні 2-4 % протягом 2 років в охолодженому стані. ПРИКЛАД 7 Дослідження стійкості У даному дослідженні була досліджена стабільність рідкого складу AMG 416 за різних виробничих та аналітичних умов. Було приготовано чотирнадцять груп для перевірки складів, кожна з яких мала різні комбінацію pH (2,7, 3,3 або 3,9), концентрацію пептиду (4, 5 або 6 мг/мл) та концентрацію солі (0,7, 0,85 або 1,0 %). Осмоляльність кожного складу підтримувалась 20 UA 115373 C2 однаково (сукцинат 10 мM). Див. таблицю 16. Таблиця 16 Групи перевірки складів Зразок 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 5 10 15 20 25 30 35 pH 3,3 3,9 2,7 3,9 3,3 3,9 3,3 3,3 3,9 3,3 2,7 2,7 2,7 3,9 Сукцинат (мM) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Пептид (мг/мл) 5 4 4 6 4 6 5 5 5 6 6 5 5 4 NaCl (%) 0,85 1,0 0,85 0,7 0,7 1,0 1,0 0,85 0,85 0,85 0,85 1,0 0,7 0,7 Зразки (2,1 мл) з кожної групи перевірки складів були розподілені у 3 мл скляних флаконах типу 1B (Schott, Німеччина) та були запечатані (гумовою пробкою). Набори флаконів зберігались у вертикальному положенні протягом трьох місяців при температурі 4 °C, 25 °C або 40 °C. Зміни pH, осмоляльності, відсоток AMG 416 та продуктів розпаду були оцінені протягом трьох місяців. Залежна від часу поверхня відгуку, визначену за допомогою трьох факторів (pH, % пептиду та % NaCl), була оцінена шляхом пристосування статистичної моделі, яка описує таку поверхню, до даних для кожної відповіді HPLC та кожної температури (статистична програмарозвідник JMP®, SAS). Моделювання за методом Монте-Карло було використано для створення розподілу прогнозованих відповідей HPLC у встановлений точці (pH=3,3, пептид = 5 % та NaCl=8,5 %) залежно від випадкових змін факторів навколо встановленої точки та випадкового шуму. Не було відзначено жодних значних змін рН і осмоляльності із часом. При 4 °C та 25 °C чистота залишилась 92 % або більше, деамідування склало 4 % або менше, а утворення гомодимерів склало 4 % або менше протягом всієї тривалості дослідження. При 40 °C чистота, деамідування та утворення гомодимерів спостерігались, починаючи з 1 місяця. Однак деамідування та утворення гомодимерів були знижені в звуженому діапазоні pH близько 3,3, що вказує на суттєвий вплив pH на утворення цих продуктів розпаду. На підставі цих даних можна забезпечити прогнозування профілю чистоти в діапазоні рН від 2,8 до 3,8. Як показано на фігурі 12, чистота при кожній температурі сильно залежить від pH і менше залежить від концентрації пептиду та NaCl в межах перевіреного діапазону. У охолодженому стані ефект pH є менш значним при значеннях pH вище 3,3, але при кімнатній температурі (приблизно 25 °C) більш високі значення pH пов'язані з більш швидкою деструкції. Склади для терапевтичного застосування можуть бути піддані тривалому зберіганню в охолодженому стані. Крім того, слід також приділяти увагу потенційному впливу на склад високих температур під час виготовлення, пакування, маркування та клінічного використання. Таким чином, в цьому наборі експериментів спостерігалось, що значення рН в перевіреному діапазоні від 2,8 до 3,8 (3,3±0,5) будуть придатними для складів AMG 416. ПРИКЛАД 8 Довгострокова стабільність рідких складів AMG 416 у діапазоні pH У цьому дослідженні була визначена довгострокова стабільність рідкого складу AMG 416 в концентрації 3,4 мг/мл у діапазоні рН в сукцинатно-сольовому буферному розчині. Очищена згідно фармакопеї США (USP) вода (1200 мл) була розлита у скляний стакан. Сукцинат натрію (4,05 г) та хлорид натрію (13,5 г) були додані та перемішані для розчинення. Значення pH доводилось до 2,5 за допомогою 1 N NaOH та/або 1 N HCl за необхідності. AMG 416 HCl (порошок вагою 5,5 г) був доданий, перемішаній до розчинення та q.s. до 1500 мл очищеною 21 UA 115373 C2 5 водою, щоб забезпечити розчин 3,4 мг/мл (AMG 416). Розчин був розділений на три частини, та для кожної частини pHдоводилось до 2,5, 3,0 та 3,5 відповідно. Кожний розчин був окремо 3 профільтрований крізь фільтр PVDF 0,22 мікрон та розлитий по 2 мл у флакони об'ємом 5 см . Після закупорювання, запечатування та маркування флакони були поміщені у камери визначеної стабільності при 5 °C ± 3, 25 °C ± 2 та 40 °C ± 2. Зразки були отримані у відповідності до графіка та розведені деіонізованою водою до 1,0 мг/мл для аналізу HPLC. Чистота по місяцях 0, 1, 2, 3, 5, 12 та 24 представлена у таблиці 17 (примітка: початкове значення чистоти для цього дослідження склало 99,2 %). Результати представляють профіль довгострокової стабільності рідкого складу 3,4 мг/мл AMG 416 в залежності від pH та температури. 10 Таблиця 17 Чистота у момент часу до 24 місяців для розчинів AMG 416 Чистота (%) у момент часу (місяці) pH 2,5 3 3,5 15 20 25 30 Темп (°C) 5 25 40 5 25 40 5 25 40 0 1 2 3 5 12 24 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,0 96,9 88,8 99,1 98,2 93,7 99,2 98,6 94,6 98,8 95,2 81,9 99,1 97,5 90,2 99,2 98,1 91,5 98,8 93,4 75,3 99,2 96,7 86,4 99,2 97,6 88,7 98,1 89,3 60,9 98,7 95,0 78,9 98,8 96,2 83,1 96,8 80,9 39,1 98,3 91,1 61,6 98,6 93,4 67,5 94,8 68,5 20,4 97,7 84,6 39,2 98,3 89,2 46,1 Деструкція у 2 роки 4,4 30,7 78,8 1,5 14,6 60,0 0,9 10,0 53,1 Залежність від часу чистоти рідкого складу AMG 416 при кожному рівні pH показана на фігурі 13. При всіх температурах найбільша чистота спостерігалась при pH 3,5, в той час як найбільша деструкція спостерігалась при pH 2,5. Крім того, при всіх температурах чистота при рН 3,0 і 3,5 була значно більшою, ніж чистота при рН 2,5. Так, наприклад, для охолоджених зразків чистота на 24 місяці склала 98,3 та 97,7 для розчинів при рН 3,5 та 3,0 відповідно, але тільки 94,8 для розчину при рН 2,5. Крім того, спостерігалось, що зниження чистоти було пов'язано з температурою при всіх рівнях pH, з найменшою спостереженою деструкцією у зразках, інкубованих при 2-8 °C, та найбільшою спостереженою деструкцією у зразках, інкубованих при 40 °C. Основним продуктом розпаду, що спостерігався при pH 2,5, був деамідований продукт, а при pH 3,5 спостерігався гомодимер. Ці дані підтверджують, що описані склади здатні підтримувати адекватну стабільність AMG 416 протягом щонайменше дворічного терміну придатності в охолодженому стані. Спостережена деструкція є лінійною у всіх випадках і підтримує висновки, засновані на екстраполяції даних з попередніх експериментів. Виходячи з цих даних, оптимальний рН лежить між 3,0 та 3,5 на основі балансу між різними шляхами деструкції. Усі публікації, патенти і заявки на патент, процитовані в даному описі, включені в даний документ за допомогою посилання так, якби кожна окрема публікація або заявка на патент була конкретно та індивідуально вказана як включена за допомогою посилання. Хоча даний винахід і був описаний в деяких деталях шляхом ілюстрації та прикладу в цілях ясності розуміння, він стане відразу очевидним для середніх спеціалістів у даній галузі техніки в світлі ідей цього винаходу, що певні зміни і модифікації можуть бути до них внесені без відходу від сутності або обсягу прикладеної формули винаходу. 22 UA 115373 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 1. Фармацевтичний склад, що включає AMG 416 у водному розчині, де склад має pH від 2,0 до 5,0. 2. Склад за п. 1, де склад має pH від 2,5 до 4,5. 3. Склад за п. 1, де склад має pH від 2,5 до 4,0. 4. Склад за п. 1, де склад має pH від 3,0 до 3,5. 5. Склад за п. 1, де pH підтримується за допомогою фармацевтично прийнятного буфера. 6. Склад за п. 5, де буфер являє собою сукцинат. 7. Склад за п. 1, де AMG 416 присутній у складі в концентрації від 0,1 мг/мл до 20 мг/мл. 8. Склад за п. 1, де AMG 416 присутній у складі в концентрації від 1 мг/мл до 15 мг/мл. 9. Склад за п. 1, де AMG 416 присутній у складі в концентрації від 2,5 мг/мл до 10 мг/мл. 10. Склад за п. 1, який додатково включає фармацевтично прийнятний модифікатор тонічності. 11. Склад за п. 10, де модифікатор тонічності присутній у складі в концентрації, достатній для того, щоб склад був приблизно ізотонічним. 12. Склад за п. 10, де засіб тонічності являє собою NaCl. 13. Склад за п. 1, де склад деградує менше ніж на 10 % при зберіганні при 2-8 °C протягом 2 років. 14. Склад за п. 1, де склад деградує менш ніж на 10 % при зберіганні при кімнатній температурі протягом 2 років. 15. Склад, що включає від 2 мг/мл до 20 мг/мл AMG 416 у водному розчині, сукцинатний буфер, який підтримує склад при pH від приблизно 3,0 до 3,5, та достатню концентрацію хлориду натрію для того, щоб склад був приблизно ізотонічним. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 23