Hla-a1101-обмежений пептид wt1 і фармацевтична композиція, яка містить його

УКРАЇНА (19) UA (11) 103154 (13) C2 (51) МПК (2013.01) C07K 14/82 (2006.01) C12N 5/07 (2010.01) C12N 15/12 (2006.01) A61K 38/08 (2006.01) A61K 48/00 A61P 35/00 G01N 33/574 (2006.01) ДЕРЖАВНА СЛУЖБА ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ УКРАЇНИ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (21) Номер заявки: a 2009 07944 (22) Дата подання заявки: 14.12.2007 (24) Дата, з якої є чинними 25.09.2013 права на винахід: (31) Номер попередньої 2006-355356 (32) Дата подання 28.12.2006 заявки відповідно до Паризької конвенції: попередньої заявки відповідно до Паризької конвенції: (33) Код держави-учасниці JP Паризької конвенції, до якої подано попередню заявку: (41) Публікація відомостей 26.10.2009, Бюл.№ 20 про заявку: (46) Публікація відомостей 25.09.2013, Бюл.№ 18 про видачу патенту: (86) Номер та дата подання міжнародної заявки, поданої відповідно до Договору PCT PCT/JP2007/074146, 14.12.2007 (72) Винахідник(и): Сугіяма Харуо (JP) (73) Власник(и): ІНТЕРНЕШНЛ ІНСТІТЬЮТ ОФ КЕНСЕР ІММУНОЛОДЖИ, ІНК., 13-9, Enoki-cho, Suita-shi, Osaka, 5640053, Japan (JP) (74) Представник: Мошинська Ніна Миколаївна, реєстр. №115 (56) Перелік документів, взятих до уваги експертизою: WO 0125273 A2, 12.04.2001. US 2003082196 A1, 01.05.2003. US 2006121046 A1, 08.06.2006. JP 2005518192 A, 23.06.2005. JP 2003524021 A, 12.08.2003. JP 2004510425 A, 08.04.2004. JP 2006280324 A, 19.10.2006. VAN DRIESSCHE A ET AL: "Antigen-specific cellular immunotherapy of leukemia" LEUKEMIA (BASINGSTOKE), vol. 19, no. 11, November 2005 (2005-11), pages 1863-1871. (54) HLA-A*1101-ОБМЕЖЕНИЙ ПЕПТИД WT1 І ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЯКА МІСТИТЬ ЙОГО (57) Реферат: Винахід належить до пептиду, здатному зв'язуватися з молекулою HLA-A* 1101 і здатному індукувати цитотоксичний Т-лімфоцит (CTL), який складається з амінокислотної послідовності Thr Gly Val Lys Pro Phe Gin Cys Lys (SEQ ID NО:7), в якій від однієї амінокислоти до п'яти амінокислот можуть бути заміщені іншою (ими) амінокислотою (ами), а також до фармацевтичної композиції для лікування або профілактики злоякісного новоутворення, яка містить зазначений поліпептид, до способу індукції WT1-специфічного цитотоксичного Тлімфоцита, набору, що містить зазначений поліпептид. UA 103154 C2 (12) UA 103154 C2 UA 103154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується HLA-A*1101-обмеженого пептиду WT1, зокрема пептиду, який містить амінокислотну послідовність, що складається з 9 послідовних амінокислот з білка WT1, де пептид має здатність зв'язуватися з молекулою HLA-A*1101, а також індукувати CTL. Даний винахід також стосується пептидного димеру, що має здатність зв'язуватися з молекулою HLAA*1101 і індукувати CTL, в якому два пептидних мономери, кожний з яких містить амінокислотну послідовність, яка складається з 9 послідовних амінокислот білка WT1, і включає щонайменше один залишок цистеїну, зв'язані між собою дисульфідним зв'язком. Крім того, даний винахід стосується полінуклеотиду, що кодує цей пептид, фармацевтичної композиції для лікування і/або профілактики раку, що містить цей пептид, і тому подібне. Рівень техніки Ген WT1 (ген пухлини Вільямса 1) був ідентифікований як ген, відповідальний за пухлину Вільямса, яка являє собою рак нирок у дітей (непатентні документи 1 і 2). WT1 є транскрипційним фактором, зі структурою "цинкового пальця". Спочатку ген WT1 вважався геном-супресором раку. Однак подальші дослідження (непатентні документи 3, 4, 5 і 6) показали, що ген WT1 швидше функціонує як онкоген в гематопоетичних пухлинах і солідних раках. Ген WT1 експресується на високому рівні в багатьох типах злоякісних пухлин. Крім того, було вивчено, чи вільний від мутацій продукт гена WT1, який є аутогенним білком, має імуногенність в живому організмі. Результати показали, що цей білок є продуктом гена WT1, яким експресується на високому рівні в клітинах пухлини, фрагментується внаслідок внутрішньоклітинного процесингу, кінцеві пептиди утворюють комплекси з молекулами MHC класу I, і ці комплекси знаходяться на поверхнях клітин, і що CTL, що розпізнають такі комплекси, можуть бути індуковані за допомогою пептидної вакцинації (непатентні документи 7, 8 і 9). Було також показано, що у миші, імунізованої пептидом WT1 або кДНК WT1, трансплантовані клітини пухлини, що експресують ген WT1, з високою імовірністю відторгаються (непатентні документи 7 і 10), в той час як нормальні тканини, що фізіологічно експресують ген WT1, не ушкоджуються індукованими CTL (непатентний документ 7). Було показано в експериментах in vitro з використанням клітин людини, що, якщо пептид Db126 або пептид WH187 (амінокислоти 187-195 з SEQ ID NО:1, SLGEQQYSV), що має високу здатність зв'язуватися з молекулою HLA-A*0201, яка є однією з молекул MHC класу I людини, використовуються для стимуляції мононуклеарних клітин периферичної крові людини, що мають HLA-A*0201, індукуються WT1-специфічні CTL, ці індуковані CTL мають цитотоксичну активність, специфічну для клітин пухлини, що експресують ендогенно ген WT1 на високому рівні, а цитотоксична активність таких CTL є HLA-A2-обмеженою (непатентний документ 11). Було показано в експериментах in vitro на клітинах людини з використанням пептиду WT1, який відповідає HLA-A*2402 (було виявлено, що серед HLA-A алелей він найчастіше зустрічається у японців) (WT1235; амінокислоти 235-243 з SEQ ID NO:1, CMTWNQMNL), індуковані WT1специфічні CTL (TAK-1) (непатентний документ 12), і індуковані CTL не супресують здібність до утворення колоній нормальних гематопоетичних стволових, які частково фізіологічно експерують ген WT1 (непатентні документи 12 і 13). Ці дані переконливо вказують на те, що не тільки у мишей, але і у людини, можуть бути індуковані WT1-специфічні CTL; такі CTL мають цитотоксичну активність проти пухлинних клітин, що експресують ген WT1 на високому рівні, але не мають цитотоксичної активності проти нормальних клітин, що експресують фізіологічно ген WT1 (непатентні документи 7, 10, 11, 12 і 13). Продуктом гена WT1 є ядерний білок, який розщеплюється протеасомами в цитоплазмі на пептиди. Фрагментовані пептиди транспортуються в просвіт ендоплазматичного ретикулума за допомогою молекул TAP (транспортер, зв'язаний з процесингом антигену), утворюють комплекси з молекулами MHC класу I, і розташовуються на поверхні клітин. WT1-специфічні CTL індукуються внаслідок розпізнавання комплексів WT1 пептид - молекула MHC класу I клітинами-попередниками CTL за допомогою TCR, здійснюючи таким чином цитотоксичний ефект на клітини пухлини, що презентують продукт гена WT1 за допомогою молекул MHC класу I (непатентні документи 7, 8 і 9). Крім того, потрібно щонайменше щоб пептид WT1, що використовується в імунотерапії раку, направленій на продукт гена WT1, знаходився в формі, яка зв'язується з молекулою MHC класу I в живому організмі. Однак молекули MHC класу I різні, і амінокислотні послідовності пептидів WT1, зв'язаних з відповідними молекулами MHC класу I, відрізняються одна від одної. Тому, потрібно одержати пептид, відповідний кожному підтипу 2 1 1 MHC класу I. Проте до теперішнього часу відомі тільки HLA-A*240 , HLA-A*020 -, HLA-A*260 - і HLA-A*3303-обмежені пептиди як HLA-обмежені пептиди WT1. (Патентний документ 1, 1 UA 103154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 непатентний документ 11, патентний документ 2 і патентний документ 3, відповідно). Таким чином, існує необхідність знайти HLA-A*1101-обмежений пептид WT1. Патентний документ 1: WO 2003/106682 Патентний документ 2: WO 2005/095598 Патентний документ 3: Японська Патентна Заявка №2006-45287 Непатентний документ 1: Daniel А. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29; 61(7):1257-69. Непатентний документ 2: Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9; 60(3):509-20. Непатентний документ 3: Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998; 181:151-212. Review. Непатентний документ 4: Yamagami Т et al., Blood. 1996 Apr 1; 87(7):2878-84. Непатентний документ 5: Inoue K et al., Blood. 1998 Apr 15; 91(8):2969-76. Непатентний документ 6: Tsuboi А et al., Leuk Res. 1999 May; 23(5):499-505. Непатентний документ 7: Oka Y et al., J Immunol. 2000 Feb 15; 164(4):1873-80. Непатентний документ 8: Melief CJ et al., Immunol Rev. 1995 Jun; 145:167-77. Непатентний документ 9: Ritz J, J Clin Oncol. 1994 Feb; 12(2):237-8. Непатентний документ 10: Tsuboi А et al., J Clin Immunol. 2000 May; 20(3):195-202. Непатентний документ 11: Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb; 51(2):99-107. Непатентний документ 12: Ohminami Н et al., Blood. 2000 Jan 1; 95(1):286-93. Непатентний документ 13: Gao L et al., Blood. 2000 Apr 1; 95(7):2198-203. Суть винаходу Задачі, що вирішуються винаходом Задачі, що вирішуються даним винаходом, полягають в одержанні пептиду, який є HLAA*1101 - обмеженим і містить амінокислотну послідовність з білка WT1, і полінуклеотиду, що його кодує, а також фармацевтичної композиції для лікування і профілактики раку, що їх містить, і тому подібне. Способи рішення задач Внаслідок інтенсивних досліджень з урахуванням ситуації, описаної вище, автор винаходу виявив, що серед пептидів, кожний з яких містить амінокислотну послідовність, яка включає 9 послідовних амінокислот білка WT1, пептиди, кожний з яких має здатність зв'язуватися з молекулою HLA-A*1101, можуть інтенсивно індукувати WT1-специфічну CTL. Таким чином, був виконаний даний винахід. Даний винахід представляє: (1) пептид, що містить амінокислотну послідовність, що складається з 9 послідовних амінокислот білка WT1, де пептид має здатність зв'язуватися з молекулою HLA-A*1101 і індукувати CTL; (2) пептид згідно (1), де амінокислота в положенні 9 амінокислотної послідовності являє собою Lys або Arg; (3) пептид згідно (1), де амінокислотна послідовність вибрана з групи, що складається з: Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys (SEQ ID NO:2), Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID NO:3), Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys (SEQ ID NO:4), Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO:5), Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys (SEQ ID NO:6), Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO:7), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEQ ID NO:8), Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID NO:9), і Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys (SEQ ID NO:10); (4) пептид згідно (3), де амінокислотна послідовність являє собою Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys (SEQ ID NO:2); (5) пептидний димер, що має здатність зв'язуватися з молекулою HLA-A*1101 і індукувати CTL, в якому два пептидних мономери, кожний з яких містить амінокислотну послідовність, яка складається з 9 послідовних амінокислот з білка WT1, і включає щонайменше один залишок цистеїну, пов'язані один з одним за допомогою дисульфідного зв'язку; (6) пептидний димер згідно (5), де амінокислотна послідовність пептидного мономеру вибрана з групи, що складається з: Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID NO:3), Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO:7), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEQ ID NO:8), і Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID NO:9); (7) фармацевтична композиція для лікування і профілактики раку, що містить пептид згідно (1) і/або пептидний димер згідно (5); 2 UA 103154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (8) спосіб лікування або профілактики раку, що включає введення ефективної кількості пептиду згідно (1) і/або пептидного димеру згідно (5) з HLA-A*1101-позитивним індивідом; (9) полінуклеотид, що кодує пептид згідно (1); (10) вектор експресії, що містить полінуклеотид згідно (9); (11) фармацевтична композиція для лікування і профілактики раку, що містить полінуклеотид згідно (9) або вектор згідно (10); (12) спосіб лікування або профілактики раку, що включає введення ефективної кількості полінуклеотиду згідно (9) або вектора згідно (10) з HLA-A*1101-позитивним індивідом; (13) WT1-специфічний CTL, який індукований за допомогою пептиду згідно (1) і/або пептидного димеру згідно (5); (14) спосіб індукції WT1-специфічного CTL, що включає культивування мононуклеарної клітини периферичної крові в присутності пептиду згідно (1) і/або пептидного димеру згідно (5) для індукування WT1-специфічного CTL з мононуклеарної клітини периферичної крові; (15) набір для індукції WT1-специфічного CTL, що містить пептид згідно (1) і/або пептидний димер згідно (5) як суттєвий компонент; (16) антигенпрезентуюча клітина, що презентує пептид WT1, який індукований за допомогою пептиду згідно (1) і/або пептидного димеру згідно (5); (17) спосіб індукції антигенпрезентуючої клітини, що презентує пептид WT1, що включає культивування незрілої антигенпрезентуючої клітини в присутності пептиду згідно (1) і/або пептидного димеру згідно (5) для індукування антигенпрезентуючої клітини, що презентує пептид WT1, з незрілої антигенпрезентуючої клітини; (18) набір для індукції антигенпрезентуючої клітини, що презентує пептид WT1, що включає пептид згідно (1) і/або пептидний димер згідно (5) як суттєвий компонент; і (19) спосіб діагностики раку, що включає використання CTL згідно (13) або антигенпрезентуючої клітини згідно (16). Здійснення винаходу Даний винахід стосується пептиду, який є HLA-A*1101-обмеженим і містить амінокислотну послідовність, яка складається з 9 послідовних амінокислот білка WT1, і кодуючий його полінуклеотид, а також фармацевтичну композицію для лікування і/або профілактики раку, що містить пептид і тому подібне. Отже, можливо індукувати in vivo і in vitro WT1-специфічні CTL у індивідів, що мають HLA-A*1101. Оскільки частка позитивних HLA-A*1101 серед японців висока (близько 17,9 %), то WT1-специфічні CTL можна індукувати у великої кількості індивідів. Короткий опис креслень Фіг. 1 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого WT1251. Фіг. 2 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого WT1 279. Фіг. 3 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого WT1 312. Фіг. 4 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого WT1 313. Фіг. 5 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого WT1 338. Фіг. 6 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого WT1 378. Фіг. 7 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого WT1 386. Фіг. 8 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого WT1415. Фіг. 9 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого WT1 436. Фіг. 10 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого WT1 378 пептидом (a, b і с представляють цитотоксичну активність, що спостерігається при використанні PBMCs від HLAA*1101-позитивних здорових донорів 1, 2 і 3, відповідно). Фіг. 11 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого WT1 378 пептидним димером (а і b представляють цитотоксичну активність, що спостерігається при використанні PBMCs від HLA-A*1101-позитивних здорових донорів 1 і 2, відповідно). Фіг. 12 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого модифікованим WT1 378 пептидом (G > I) (a, b і з представляють цитотоксичну активність, що спостерігається при використанні PBMCs від HLA-A*1101-позитивних здорових донорів 1, 2 і 3, відповідно). Фіг. 13 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого модифікованим WT1 378 пептидом (G > V) (a, b і з представляють цитотоксичну активність, що спостерігається при використанні PBMCs від HLA-A*1101-позитивних здорових донорів 1, 2 і 3, відповідно). Фіг. 14 представляє цитотоксичну активність CTL, індукованого WT1 379 пептидом (a, b і з представляють цитотоксичну активність, що спостерігається при використанні PBMCs від HLAA*1101-позитивних здорових донорів 1, 2 і 3, відповідно). Найкращий варіант здійснення винаходу У одному з аспектів даний винахід стосується пептиду, що містить амінокислотну послідовність, яка складається з 9 послідовних амінокислот з білка WT1, де пептид має 3 UA 103154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здатність зв'язуватися з молекулою HLA-A*1101 і індукувати CTL (в описі також позначений як "пептид WT1"). Амінокислотна послідовність білка WT1 людини представлена як SEQ ID NO:1. Пептид за даним винаходом містить амінокислотну послідовність, яка складається з 9 послідовних амінокислот амінокислотної послідовності SEQ ID NO:1. Якщо пептид за даним винаходом містить амінокислотну послідовність, яка включає цистеїн(и), таку як амінокислотна послідовність SEQ ID NO:3, 7, 8 або 9, як описано нижче, то стабільність може бути збільшена шляхом заміщення цистеїну(нів) в амінокислотній послідовності іншою речовиною, такою як інша амінокислота (наприклад, серин, аланін і α-амінобутирова кислота) або шляхом модифікування SH-групи цистеїну(нів) захисною групою, відомою в даній галузі техніки (наприклад, карбоксиметильною групою або піридилетильною групою). Пептид за даним винаходом є пептидом ракового антигену, який може індукувати CTL внаслідок презентації (за допомогою антигенпрезентуючої клітини) пептиду, що формується внаслідок процесингу пептиду за даним винаходом в клітині. Як описано вище, об'єктом даного винахід є одержання HLA-A*1101-обмеженого пептиду. Таким чином, пептид за даним винаходом має здатність зв'язуватися з молекулою HLA-A*1101. Здатність до зв'язування може визначатися способом, відомим в даній галузі. Приклади таких способів включають спосіб, оснований на використанні комп'ютера, такого як Rankpep, BIMAS або SYFPEITHI, і дослідження конкурентного зв'язування з відомим пептидом, що має здатність зв'язуватися з молекулою HLA-A*1101. Наприклад, щоб оцінити чи має пептид за даним винаходом здатність до зв'язування, встановлена здатність до зв'язування може порівнюватися з такою у відомого HLA-A*1101-обмеженого пептиду. Приклади пептидів, що мають здатність до зв'язування відповідно до даного винаходу, включають пептид, у якого показник афінності до HLA-A*1101 молекули, як визначено способом, описаним в прикладі 1, становить 4 або більше, переважніше 5 або більше, більш переважно 6 або більше. Пептид за даним винаходом додатково має здатність індукувати CTL. Ген WT1 експресується в своїй нативній формі на високому рівні, наприклад, в гематопоетичних пухлинах, таких як лейкоз, мієлодиспластичний синдром, множинна мієлома або злоякісна лімфома, і солідних раках, таких як рак шлунку, рак товстої кишки, рак легені, рак молочної залози, герміногенний рак, рак печінки, рак шкіри, рак сечового міхура, рак простати, рак матки, рак шийки матки або рак яєчників. Отже, пептид за даним винаходом може індукувати CTL з високою швидкістю у індивіда, страждаючого таким захворюванням. Здатність індукувати CTL стосується здатності індукувати CTL in vivo або in vitro. Таку здатність можна визначити, використовуючи загальний спосіб, такий як спосіб, в якому цитотоксична активність CTL визначається з використанням тесту з вивільненням хрому. Пептид за даним винаходом може мати Lys або Arg в положенні 9 амінокислотної послідовності. Вважається, що при наявності такої амінокислоти, здатність пептиду зв'язуватися з молекулою HLA-A*1101 стає вищою. Амінокислотна послідовність, яка складається з 9 амінокислот, включених в пептид за даним винаходом, переважно являє собою Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys (SEQ ID NO:2), Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID NO:3), Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys (SEQ ID NO:4), Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID NO:5), Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys (SEQ ID NO:6), Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO:7), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEQ ID NO:8), Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID NO:9) або Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys (SEQ ID NO:10). Найбільш переважною послідовністю є послідовність Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO:7). Крім того, послідовність може мати заміщення однієї або декількох, переважно від однієї до п'яти, амінокислот на інші амінокислоти в дев'яти амінокислотах будь-якого з SEQ ID NO:2-10. Будь-яка з цих дев'яти амінокислот або інші заміщені амінокислоти можуть бути відповідним чином модифіковані. У будь-якому випадку, пептид за даним винаходом зберігає здатність зв'язуватися з молекулою HLA-A*1101. Як описано вище, пептидом за даним винаходом може бути будь-який пептид при умові, що він містить амінокислотну послідовність, яка одержана з білка WT1і складається з 9 послідовних амінокислот. Таким чином, пептидом за даним винаходом може бути, наприклад, пептид, що складається тільки з амінокислотної послідовності будь-якої SEQ ID NO:2-10, або білок WT1 або його частина, що включає амінокислотну послідовність будь-якої SEQ ID NO:210. Кількість амінокислот, включених в пептид за даним винаходом, конкретно не обмежена, і ця кількість становить, наприклад, 9-500, 9-300, 9-200, 9-100, 9-50, 9-30 і 9-12 амінокислот. Різні речовини можна приєднати до N-кінця і/або до С-кінця амінокислотної послідовності, що складається з 9 послідовних амінокислот в пептиді за даним винаходом. Наприклад, можна приєднати амінокислоту, пептид або його аналог. Якщо така речовина приєднана до пептиду за даним винаходом, ця речовина може зазнавати обробки, наприклад, ферментом в живому 4 UA 103154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 організмі або за допомогою процесу, такого як внутрішньоклітинний процесинг, і, зрештою, амінокислотна послідовність, що складається з 9 послідовних амінокислот, може продукуватися і презентуватися як комплекс з молекулою HLA-A*1101 на поверхні клітини, тим самим приводячи до ефекту індукування CTL. Такою речовиною може бути речовина, яка модулює розчинність пептиду за даним винаходом, або збільшує його стабільність (стійкість до протеаз, і т.д.). Альтернативно, це може бути речовина, яка специфічно доставляє пептид за даним винаходом, наприклад, до даної тканини або органу, або вона може мати здатність збільшувати ефективність поглинання за допомогою антигенпрезентуючої клітини або тому подібне. Такою може бути речовина, яка збільшує здатність індукувати CTL, така як пептид-помічник або тому подібне. Пептид за даним винаходом може бути синтезований способами, що в основному використовуються в даній галузі або їх варіантами. Такі способи описані, наприклад, в Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide-Gosei, Maruzen Co., Ltd., 1975; Peptide-Gosei No Kiso To Jikken, Maruzen Co., Ltd., 1985; і Iyakuhin No Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide-Gosei, Hirokawa-Book store, 1991. Пептид за даним винаходом може бути також одержаний за допомогою методів генної інженерії, основаних на інформації про нуклеотидну послідовність, яка кодує пептид за даним винаходом. Такі методи генної інженерії добре відомі фахівцям в даній галузі. У додатковому аспекті даний винахід стосується пептидного димеру, що має здатність зв'язуватися з молекулою HLA-A*1101 і індукувати CTL, в якому два пептидних мономери, кожний з яких містить амінокислотну послідовність, що складається з 9 послідовних амінокислот з білка WT1, і включає щонайменше один залишок цистеїну, зв'язані один з одним за допомогою дисульфідного зв'язку (в даному описі позначений як "пептидний димер WT1"). Стабільність пептидного димеру за даним винаходом збільшується в порівнянні з такою у пептидного мономера внаслідок утворення димеру. Пептидним димером за даним винаходом є пептидний димер пухлинного антигену, який може індукувати CTL завдяки презентації (за допомогою антигенпрезентуючої клітини) пептиду, що формується внаслідок процесингу пептиду за даним винаходом в клітині. Пептидний димер за даним винаходом утворюється шляхом зв'язування двох пептидних мономерів за допомогою дисульфідного зв'язку між залишками цистеїну, представленими в мономерах. Таким чином, кожний з пептидних мономерів, включений в пептидний димер WT1 даного винаходу, являє собою пептид WT1, як описаний вище, і включає щонайменше один залишок цистеїну. Пептидний димер WT1 за даним винаходом може бути гомодимером або гетеродимером. В пептидному димері WT1 за даним винаходом амінокислотна послідовність, що входить в склад пептидного мономера, переважно являє собою Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID NO:3), Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO:7), Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEQ ID NO:8) або Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID NO:9). Найбільш переважно послідовність являє собою послідовність Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO:7). Пептидний димер WT1 даного винаходу можна одержати способами, відомими в даній галузі. Наприклад, якщо пептидні мономери включають одну пару залишків цистеїну, то пептидний димер WT1 за даним винаходом може бути одержаний, наприклад, шляхом видалення всіх захисних груп, включаючи групи на цистеїнових бічних ланцюгах, і потім, піддаючи одержаний мономерний розчин окисленню повітрям в лужному середовищі, або доданням оксиданту в лужному або кислому середовищі до утворення дисульфідного зв'язку. Приклади оксидантів включають йод, диметилсульфоксид (DMSO) і гексаціанозалізокислий калій. Якщо кожний з пептидних мономерів включає два або більше залишків цистеїну, то пептидний димер WT1 за даним винаходом можна також одержати способом, описаним вище. У цьому випадку, ізомери одержують за рахунок різних типів дисульфідних зв'язків. Альтернативно, пептидний димер WT1 за даним винаходом можна одержати шляхом вибору комбінації захисних груп для цистеїнових бічних ланцюгів. Приклади комбінацій захисних груп включають комбінації MeBzl (метилбензилову) групу і Acm (ацетамідметилову) групу, Trt (тритильну) групу і Acm групу, Npys (3-нітро-2-піридилтіо) групу і Acm групу, і S-Bu-t (S-третбутилову) групу і Acm групу. Наприклад, у випадку комбінації MeBzl групи і Acm групи, пептидний димер WT1 можна одержати шляхом видалення захисних груп, відмінних від MeBzl групи і захисної групи на цистеїновому бічному ланцюгу, піддаючи одержаний мономерний розчин окисленню повітрям до утворення дисульфідного зв'язку між захищеними цистеїновими залишками, і потім депротекцією і окисленням, із застосуванням йоду до утворення дисульфідного зв'язку між залишками цистеїну, попередньо захищеними Acm. 5 UA 103154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У іншому аспекті, даний винахід стосується фармацевтичної композиції для лікування і профілактики раку, що включає HLA-A*1101-обмежений пептид WT1 і/або пептидний димер WT1. Ген WT1 експресується на високому рівні при різних видах раку і пухлин, включаючи гематопоетичні пухлини, такі як лейкоз, мієлодиспластичний синдром, множинну мієлому або злоякісну лімфому і солідні раки, такі як рак шлунку, рак товстої кишки, рак легені, рак молочної залози, герміногенний рак, рак печінки, рак шкіри, рак сечового міхура, рак простати, рак матки, рак шийки матки або рак яєчників. Отже, фармацевтична композиція за даним винаходом може використовуватися для лікування або профілактики раку. Якщо фармацевтична композиція за даним винаходом вводиться HLA-A*1101-позитивному індивіду, то індукуються WT1-специфічні CTL за допомогою HLA-A*1101-обмеженого пептиду WT1 або пептидного димеру, включених в фармацевтичну композицію, і за допомогою таких CTL ракові клітини у індивіда ушкоджуються. Фармацевтична композиція за даним винаходом може включати, крім HLA-A*1101обмеженого пептиду WT1 і/або пептидного димеру WT1 як активних інгредієнтів, наприклад, носій, ексципієнт або тому подібне. HLA-A*1101-обмежений пептид WT1 або пептидний димер WT1, включений в фармацевтичну композицію за даним винаходом, індукує WT1-специфічний CTL. Таким чином, фармацевтична композиція за даним винаходом може містити відповідний ад'ювант, або може використовуватися разом з відповідним ад'ювантом для посилення ефективності індукції. Приклади переважних ад'ювантів включають, але ними не обмежуються, повний або неповний ад'ювант Фрейнда і гідроокис алюмінію. Спосіб використання фармацевтичної композиції за даним винаходом може бути відповідним чином вибраний, в залежності від умов, таких як тип захворювання, стан індивіда або ділянка-мішень. Приклади таких способів включають, але ними не обмежуються, внутрішньошкірне введення, підшкірне введення, внутрішньовенне введення, назальне застосування і пероральне введення. Кількість пептиду або димеру пептидного, включеного в фармацевтичну композицію за даним винаходом, а також лікарська форма, кількість введень і тому подібне фармацевтичної композиції за винаходом можна відповідним чином вибрати, в залежності від умов, таких як тип захворювання, стан індивіда або ділянка-мішень. Одинична доза пептиду становить звичайно 0,0001 мг-1000 мг, переважно 0,001 мг-1000 мг. У іншому аспекті даний винахід стосується способу лікування і профілактики раку, що включає введення ефективної кількості пептиду WT1 і/або пептидного димеру WT1 HLA-A*1101позитивному індивіду. Рак, на який направлене лікування або профілактика, може бути будьяким, і приклади раку включають гематопоетичні пухлини, такі як лейкоз, мієлодиспластичний синдром, множинна мієлома або злоякісна лімфома і солідних раків, такі як рак шлунку, рак товстої кишки, рак легені, рак молочної залози, герміногенний рак, рак печінки, рак шкіри, рак сечового міхура, рак простати, рак матки, рак шийки матки або рак яєчників. У додатковому аспекті, даний винахід стосується способу визначення наявності або кількості WT1-специфічного CTL у HLA-A*1101-позитивного індивіда, що включає: (a) взаємодію комплексу пептиду WT1 і молекули HLA-A*1101 із зразком індивіда; і (b) визначення наявності і/або кількості CTL, що розпізнає комплекс, який міститься в зразку. Зразок індивіда може бути будь-яким при умові, що існує імовірність, що він містить лімфоцит. Приклади зразків включають рідину організму, таку як кров або лімфу, і тканину. Комплекс пептиду WT1 і молекули HLA-A*1101 може бути одержаний, наприклад, у вигляді тетрамеру або пентамеру із застосуванням способу, відомого фахівцеві в даній галузі, такому як біотинстрептавідин спосіб. Наявність і кількість CTL, що розпізнає такий комплекс, може бути виміряна способом, відомим фахівцеві в даній галузі. У цьому аспекті даного винаходу комплекс може бути помічений. Як мітка може використовуватися відома мітка, така як флуоресцентна мітка або радіоактивна мітка. Мічення робить визначення наявності і кількості CTL легким і швидким. Таким чином, даний винахід також стосується композиції для визначення наявності і кількості WT1-специфічного CTL у HLA-A*1101-позитивного індивіда, що включає HLA-A*1101обмежений пептид WT1. Крім того, даний винахід стосується набору для визначення наявності або кількості WT1специфічного CTL у HLA-A*1101-позитивного індивіда, що містить HLA-A*1101-обмежений пептид WT1. У додатковому аспекті даний винахід стосується способу одержання WT1-специфічного CTL з використанням комплексу пептиду WT1 і молекули HLA-A*1101, що включає: (a) взаємодію комплексу і зразка; і (b) одержання CTL, що розпізнає комплекс, який міститься в зразку. Комплекс пептиду WT1 і молекули HLA-A*1101 описані вище. Зразок може бути будь-яким при умові, що існує імовірність, що він містить лімфоцит. Приклади зразків включають зразок одержаний у індивіда, такий як кров, і культуру клітин. CTL, що розпізнає комплекс, може бути одержаний з 6 UA 103154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використанням способу, відомого фахівцеві в даній галузі, такого як FACS або MACS. Даний винахід дозволяє культивувати одержаний WT1-специфічний CTL і використати його для лікування або профілактики різних типів раку. Таким чином, даний винахід також стосується WT1-специфічного CTL, що одержується способом одержання WT1-специфічного CTL, з використанням комплексу пептиду WT1 і молекули HLA-A*1101. У іншому аспекті даний винахід стосується полінуклеотиду, що кодує HLA-A*1101обмежений пептид WT1. Полінуклеотидом за даним винаходом може бути ДНК або РНК. Послідовність нуклеотидів даного винаходу може бути визначена на основі амінокислотної послідовності HLA-A*1101-обмеженого пептиду WT1. Цей полінуклеотид може бути одержаний відомим способом синтезу ДНК або РНК (наприклад, хімічним синтетичним методом), методом ПЦР або тому подібне. У іншому аспекті даний винахід стосується вектора експресії, що містить цей полінуклеотид. Тип вектора експресії, включену послідовність, відмінну від послідовності полінуклеотиду, і тому подібне, можна відповідним чином вибрати, в залежності від типу хазяїна, в якому продукується вектор експресії за даним винаходом, мети застосування або тому подібного. Можливе лікування і профілактика гематопоетичних пухлин або солідних раків за допомогою введення вектора експресії даного винаходу HLA-A*1101-позитивного індивіду для продукування HLAA*1101-обмеженого пептиду WT1 в живому організмі і індукції WT1-специфічного CTL, і пошкодження клітин гематопоетичної пухлини або клітин солідного раку у індивіда. У додатковому аспекті даний винахід стосується фармацевтичної композиції для лікування і профілактики раку, що містить полінуклеотид або вектор експресії. Ця композиція, спосіб використання і тому подібне фармацевтичної композиції даного винаходу в цьому аспекті описані вище. У іншому аспекті, даний винахід стосується способу лікування і профілактики раку, що включає введення ефективної кількості полінуклеотиду або вектора експресії HLA-A*1101позитивному індивіду. Приклади типів раку для лікування і профілактики включають гематопоетичні пухлини, такі як лейкоз, мієлодиспластичний синдром, множинну мієлому або злоякісну лімфому, і солідних раків, таких як рак шлунку, рак товстої кишки, рак легені, рак молочної залози, герміногенний рак, рак печінки, рак шкіри, рак сечового міхура, рак простати, рак матки, рак шийки матки або рак яєчників. У іншому аспекті даний винахід стосується клітини, що містить вектор експресії. Клітина за даним винаходом може бути одержана, наприклад, шляхом трансформування клітини-хазяїна, такої як Е. coli, дріжджів, клітини комахи або клітин тварини, вектором експресії. Спосіб введення вектора експресії в клітину-хазяїна можна відповідним чином вибрати з декількох способів. Пептид за даним винаходом може бути одержаний шляхом культивування трансформованої клітини, і виділення і очищення одержуваного пептиду WT1. У додатковому аспекті даний винахід стосується WT1-специфічного CTL, який індукується за допомогою HLA-A*1101-обмеженого пептиду WT1 і/або пептидного димеру WT1. CTL за даним винаходом розпізнає комплекс пептиду WT1 і молекули HLA-A*1101. Таким чином, CTL за даним винаходом може використовуватися для специфічного пошкодження клітин пухлини, позитивної по HLA-A*1101, і експресії WT1 на високому рівні. У іншому аспекті даний винахід стосується способу лікування і профілактики раку, що включає введення WT1-специфічного CTL HLA-A*1101-позитивного індивіда. Цей спосіб застосування WT1-специфічного CTL можна відповідним чином вибрати, в залежності від умов, таких як тип захворювання, стан індивіда або ділянка-мішень. Приклади таких способів включають, але ними не обмежуються, внутрішньовенне введення, внутрішньошкірне введення, підшкірне введення, внутрішньом'язове введення, назальне застосування і пероральне введення. У іншому аспекті даний винахід стосується способу індукції WT1-специфічного CTL, що включає культивування мононуклеарної клітини периферичної крові в присутності HLA-A*1101обмеженого пептиду WT1 і/або пептидного димеру WT1 для індукції WT1-специфічного CTL з мононуклеарної клітини периферичної крові. Індивід, у якого одержують мононуклеарну клітину периферичної крові, може бути будь-яким, при умові, що він позитивний по HLA-A*1101. За допомогою культивування мононуклеарних клітин периферичної крові в присутності HLAA*1101-обмеженого пептиду WT1 і/або пептидного димеру WT1, індукуються WT1-специфічні CTL з клітин-попередників CTL, що містяться в мононуклеарних клітинах периферичної крові. Можливо лікування і профілактика гематопоетичних пухлин або солідних раків у HLA-A*1101позитивних індивідів за допомогою введення індивіду WT1-специфічного CTL, одержаного відповідно до даного винаходу. 7 UA 103154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У іншому аспекті даний винахід стосується набору для індукції WT1-специфічного CTL, що містить HLA-A*1101-обмежений пептид WT1 і/або пептидний димер WT1 як суттєвий компонент. Переважно, цей набір використовується в способі індукції WT1-специфічного CTL. Набір за даним винаходом може включати в доповненні до HLA-A*1101-обмеженого пептиду WT1 і/або пептидному димеру WT1, наприклад, спосіб одержання мононуклеарної клітини периферичної крові, ад'ювант, реакційну посудину або тому подібне. Як правило, до набору додається інструкція по застосуванню. Використовуючи набір за даним винаходом, можна ефективно індукувати WT1-специфічні CTL. У додатковому аспекті даний винахід стосується антигенпрезентуючої клітини (такої як дендритна клітина), яка презентує пептид WT1 за допомогою молекули HLA-A*1101, яка індукується за допомогою HLA-A*1101-обмеженого пептиду WT1 і/або пептидного димеру WT1. При застосуванні антигенпрезентуючої клітини даного винаходу ефективно індукуються WT1специфічні CTL. У іншому аспекті даний винахід стосується способу лікування і профілактики раку, що включає введення антигенпрезентуючої клітини, яка презентує пептид WT1 за допомогою молекули HLA-A*1101, HLA-A*1101-позитивному індивіду. Спосіб використання антигенпрезентуючої клітини можна відповідним чином вибрати в залежності від умов, таких як тип захворювання, стан індивіда або ділянка-мішень. Приклади таких способів включають, але не обмежуються такими, внутрішньовенне введення, внутрішньошкірне введення, підшкірне введення, внутрішньом'язове введення, назальне застосування і оральне введення. У іншому аспекті даний винахід стосується способу інтродукції антигенпрезентуючої клітини, яка презентує пептид WT1 за допомогою молекули HLA-A*1101, що включає культивування незрілої антигенпрезентуючої клітини в присутності HLA-A*1101-обмеженого пептиду WT1 і/або пептидного димеру WT1 для індукції антигенпрезентуючої клітини, яка презентує пептид WT1 за допомогою молекули HLA-A*1101 з незрілої антигенпрезентуючої клітини. Незрілою антигенпрезентуючою клітиною називається клітина, така як незріла дендритна клітина, яка може перетворитися в антигенпрезентуючу клітину. Індивід, від якого одержана незріла антигенпрезентуюча клітина, може бути будь-яким, при умові, що він є позитивним по HLAA*1101. Оскільки незрілі антигенпрезентуючі клітини містяться, наприклад, в мононуклеарних клітинах периферичної крові, такі клітини можуть культивуватися в присутності пептиду WT1 і/або пептидного димеру WT1. У іншому аспекті даний винахід стосується набору для індукції антигенпрезентуючої клітини, яка презентує пептид WT1 за допомогою молекули HLA-A*1101, що включає HLA-A*1101обмежений WT1 пептид WT1 і/або пептидний димер WT1 як суттєвий компонент. Переважно, щоб набір застосовувався в способі індукції антигенпрезентуючої клітини. Інший компонент, який повинен включатися в набір даного винаходу і тому подібне, описані вище. Набір даного винаходу може застосовуватися для ефективної індукції антигенпрезентуючої клітини, яка презентує пептид WT1 за допомогою молекули HLA-A*1101. У іншому аспекті даний винахід стосується антитіла проти HLA-A*1101-обмеженого пептиду WT1 або полінуклеотиду, що кодує цей пептид. Антитіло даного винаходу може бути поліклональним або моноклональним антитілом. У додатковому аспекті даний винахід стосується способу діагностики раку, що включає застосування WT1-специфічного CTL, антигенпрезентуючої клітини, яка презентує пептид WT1 за допомогою молекули HLA-A*1101, або антитіла проти HLA-A-обмеженого пептиду WT1 або полінуклеотиду, що кодує цей пептид. Переважно, щоб WT1-специфічний CTL застосовувався в способі діагностики даного винаходу. Наприклад, можливо, діагностика раку за допомогою інкубації CTL, антигенпрезентуючої клітини або антитіла із зразком від HLA-A*1101-позитивного індивіда, або введення цього HLA-A*1101-позитивному індивіду, і визначення, наприклад, положення, сайта або кількості такого. CTL, антигенпрезентуюча клітина або антитіло можуть бути помічені. Приєднуючи мітку, можна ефективно використати на практиці спосіб для діагностики даного винаходу. Приклади Наступні приклади більш детально ілюструють даний винахід, але вони не повинні бути витлумачені, як обмежуючі діапазон його застосування. Приклад 1: Вибір пептиду WT1 RANKPEP (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) застосовувалася для вибору WT1251, WT1279, WT1312, WT1313, WT1338, WT1378, WT1386, WT1415 і WT1436, що має високу здатність зв'язуватися з молекулою HLA-A*1101, одержаною з пептидів з білка WT1 (SEQ ID NO:1). Амінокислотні 8 UA 103154 C2 послідовності, число амінокислот в SEQ ID NO:1 і показники афінності до молекули HLA-A*1101 у цих пептидів представлені в Таблиці 1. Таблиця 1 Пептид WT1251 (SEQ ID NO:2) WT1279 (SEQ ID NO:3) WT1312 (SEQ ID NO:4) WT1313 (SEQ ID NoO:5) WT1338 (SEQ ID NO:6) WT1378 (SEQ ID NO:7) WT1386 (SEQ ID NO:8) WT1415 (SEQ ID NO:9) WT1436 (SEQ ID NO:10) 5 10 15 20 25 30 35 Число амінокислот Амінокислотна послідовність Показник афінності 251-259 AAGSSSSVK 15,18 279-287 PILCGAQYR 11,47 312-320 RSASETSEK 14,96 313-321 SASETSEKR 6,87 338-346 SHLQMHSRK 13,72 378-386 TGVKPFQCK 11,33 386-394 KTCQRKFSR 13,82 415-423 SCRWPSCQK 10,29 436-444 NMHQRNMTK 14,19 Одержання B-LCL клітини Мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMCs) виділялися за допомогою методу центрифугування в градієнті густини на основі фіколу (Ficoll-Hypaque) з периферичної крові, забраної в HLA-A*1101-позитивного здорового донора. PBMCs висівалися в 24-ямочний 7 планшет для клітинних культур з густиною приблизно 1×10 в середовищі RPMI 1640, що містить 10 % ФТС (FCS), з доданням культурального супернатанта клітин B95-8 (клітини, що продукують EB вірус). Вони культивувалися при 37ºС з 5 % CO2 приблизно 1 місяць. Були одержані B-LCL клітини, трансформовані вірусом EB, які були В-клітинними пухлинними клітинами. Було підтверджено, що одержані B-LCL клітини не експресували ген WT1. B-LCL клітини пульсували за допомогою інкубування їх з 20 мкг/мл WT1251, WT1279, WT1312, WT1313, WT1338, WT1378, WT1386, WT1415 або WT1436 протягом 2 годин, і опромінювали при 80 Гр радіації. Одержані в результаті B-LCL клітини (що далі іменуються як B-LCL клітини, пульсовані пептидом WT1) використали як антигенпрезентуючі клітини для подальших експериментів. Індукція WT1-специфічного CTL 6 3×10 аутологічних PBMCs культивували в 24-ямочному планшеті для клітинних культур в повному середовищі (45 % RPMI, 45 % AMI-V середа і 10 % сироватка AB людини), що містить 20 мкг/мл WT1251, WT1279, WT1312, WT1313, WT1338, WT1378, WT1386, WT1415 або WT1436 при 37ºС з 6 5 % CO2 протягом 1 тижня для одержання відповідних клітин. 2×10 одержаних відповідних 6 клітин культивували разом з 1×10 B-LCL клітинами, пульсованими тим же пептидом WT1 в повному середовищі протягом 1 тижня (перша стимуляція). PBMCs кокультивували з B-LCL клітинами, пульсованими пептидом WT1, ще три рази (з другої по четверту стимуляції) за умов, при яких додавали 20 IU/мл (кінцева концентрація) IL2 таким чином: друга стимуляція: два рази через день через 3 дні після ініціювання стимуляції; третя і четверта стимуляції: три рази з інтервалом в один день через день після ініціювання стимуляції. Одержані клітини концентрували, використовуючи набір Negative Selection Columns Gravity Feed (StemSp), так що співвідношення CD8-позитивних Т-клітин ставало рівним приблизно 80 %, і кокультивували з BLCL клітинами, пульсованими пептидом WT1 (п'ята стимуляція). Для вимірювання цитотоксичної активності застосовувалися CD8-позитивні Т-клітини (CTLs), одержані через 5 днів після фінальної стимуляції. Цитотоксична активність CTL 51 Цитотоксична активність CTLs вимірювалася з використанням тесту з вивільненням Cr. CTL клітини (що далі іменуються ефекторні клітини) змішували в співвідношенні (Е/Т відношення) від 1:1 до 30:1 в 200 мкл середовища з клітинами-мішенями, в які інкорпорувався 51 ,і Cr культивували в 96-ямочному планшеті для клітинних культур при 37ºС з 5 % CO2 протягом 4 годин. B-LCL клітини, пульсовані тим же пептидом WT1, який застосовувався для індукції 9 UA 103154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 CTLs (BLCL-Ps), і B-LCL клітини без пульсування пептидом WT1 (BLCL-NPs) використовувалися як клітини-мішені. Після культивування, з допомогою центрифугування збирали супернатанти. 51 Кількостей Cr, вивільнених в супернатанти, вимірювали із застосуванням рідинних сцинтиляційних лічильників. Цитотоксична активність (%) визначалася за наступною формулою: 51 51 (Вивільнення Cr в супернатант зразка - Спонтанне вивільнення Cr)/(Максимальне 51 51 вивільнення Cr - Спонтанне вивільнення Cr) × 100, 51 51 де Спонтанне вивільнення Cr є вивільненням Cr, що спостерігається, коли клітини-мішені, 51 в які інкорпорувався Cr, культивували окремо при тих же умовах, а Максимальне вивільнення 51 51 51 Cr є вивільненням Cr, що спостерігається, коли клітини-мішені, в які інкорпорувався Cr, були повністю лізовані із застосуванням 1 % Тритона X-100. Результати показані на Фіг. 1-9. На цих фігурах, вертикальні осі представляють специфічний лізис (%), а горизонтальні осі представляють Е/Т відношення. BLCL-P зображені суцільними лініями, а BLCL-NP представлені лініями, що складаються з точок. Було підтверджено, що CTL, індуковані WT1 251, WT1279, WT1312, WT1313, WT1338, WT1378, WT1386, WT1415 або WT1436, специфічно ушкоджують BLCL-P, що презентують пептид WT1 як комплекс з молекулою HLA-A*1101, при порівнянні з BLCL-NP. CTL, індуковані WT1251, WT1279, WT1313, WT1338 або WT1386, застосовували для додаткових експериментів нижче. Цитотоксична активність CTL проти клітини, яка ендогенно експресує WT1 Цитотоксична активність CTL, індукованих WT1251, WT1279, WT1313, WT1338 або WT1386, проти B-LCL, що експресують WT1, визначалася способом, описаним вище. Клітина, яка експресує WT1, стосується B-LCL, в яку внесений ген WT1 людини, і яка експресує білок WT1 в клітині, і представляє пептид, що складається приблизно з 9 амінокислот, одержаних внаслідок процесингу молекули HLA-A*1101. Результати показані на Фіг. 1, 2, 4, 5 і 7. На Фігурах, B-LCLs, що експресують WT1, зображені пунктирними лініями. Було підтверджено, що CTL індуковані WT1251, WT1279, WT1313, WT1338 або WT1386, мають цитотоксичну активність проти клітин, які ендогенно експресують ген WT1. Приготування пептидного димеру WT1 Суміш з 227,5 мг WT1378 пептидного мономера, 227,5 мг N-метилглукамін (NMG) і 23 мл води, окисляли повітрям за допомогою перемішування при кімнатній температурі приблизно протягом 2 днів. До одержаної суміші додавали водний розчин 2 г натрію ацетату в 5 мл води, і суміш перемішували при кімнатній температурі приблизно протягом 20 хвилин. До одержаного розчину додавали 200 мл води і близько 200 мл ацетонітрилу, і суміш фільтрували через воронку Киріяма (фільтрувальний папір №5C) і промивали водою (близько 50 мл × 3). До залишку додавали близько 200 мл води, і залишок ліофілізували для одержання 158 мг неочищеного WT1378 пептидного димеру. Очищення неочищеного пептидного димеру WT1 158 мг неочищеного WT1378 пептидного димеру розчиняли в 9 мл DMSO і інжектували в ODS C18 колонку (5 cm Ф × 50 cm L, YMC Co., LTD.), з'єднану з ВЕРХ (HPLC) (Shimadzu, LC8AD тип), і калібрували розчином 1 (H2O/1 % AcOH) із застосуванням ВЕРХ (HPLC) насоса. Колонку залишали приблизно на 30 хвилин, і елюювали в градієнті концентрації розчину 2 від 0 % до 40 % (CH3CN/1 % AcOH) понад 360 хвилин. Фракції, що містять пептидний димер WT1, збирали за допомогою автоматичного колектора фракцій, при УФ моніторингу абсорбції при 220 нм. Зібрані фракції об'єднували, інжектували в ODS C18 колонку (4,6 mm Ф × 25 cm L, YMC Co., LTD.), з'єднану з ВЕРХ (Hitachi, L-4000 тип), і калібрували за допомогою 17 % розчину 2, і елюювали в градієнті концентрації розчину 2 від 0 % до 47 % понад 30 хвилин для одержання 46,6 мг очищеного WT1378 пептидного димеру при часі утримання 20,51 хвилини. + FAB.MS 2365,0 (теоретичне значення (theoretical value): 2342,70) Na F=0,25 % Індукція CTL з допомогою пептидного димеру WT1 Здатність одержаного в результаті WT1378 пептидного димеру, WT1378 пептиду, модифікованого WT1378 пептиду (G > I) (SEQ ID NO:11) і модифікованого WT1378 пептиду (G > V) (SEQ ID NO:12), а також WT1379 пептиду (SEQ ID NO:13, як розкривається в WO 2002/28414), індукувати CTL, були вивчені із застосуванням PBMCs від HLA-A*1101-позитивних здорових донорів 1-3 у відповідності зі способом, описаним вище. Результати показані на Фіг. 10-14. На цих Фіг. , вертикальні осі представляють специфічний лізис (%), а горизонтальні осі представляють Е/Т відношення. BLCL-Ps зображені суцільними лініями, а BLCL-NPs представлені лініями, що складаються з точок. Було підтверджено, що WT1378 пептидний димер має здатність індукувати CTL. Крім того, було виявлено, що здатність кожного WT1 379 пептиду, амінокислотна послідовність якого відрізняється від такої у WT1 378 пептиду на одну амінокислоту в одній амінокислотній послідовності білка WT1, індукувати CTL набагато нижче, 10 UA 103154 C2 5 10 ніж така у WT1378 пептиду, і, таким чином, пептид WT1 даного винаходу має відмінний і несподіваний ефект в порівнянні з відомим пептидом. Промислова застосовність Даний винахід стосується HLA-A*1101-обмеженого пептиду WT1, полінуклеотиду, що кодує цей пептид, фармацевтичної композиції, що містить цей пептид і тому подібного. Отже, даний винахід може використовуватися в медицині і тому подібному, наприклад, в галузі розробки і одержання фармацевтичної композиції для профілактики або лікування різних гематопоетичних пухлин і солідних раків, які експресують ген WT1 на високому рівні. Вільний текст переліку послідовностей SEQ ID NO:11: Модифікований пептид WT1 SEQ ID NO:12: Модифікований пептид WT1 Перелік послідовностей 15 11 UA 103154 C2 12 UA 103154 C2 13 UA 103154 C2 14 UA 103154 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 1. Пептид, який здатний зв'язуватися з молекулою HLA-A*1101 і здатний індукувати цитотоксичний Т-лімфоцит (CTL), який складається з амінокислотної послідовності Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NО:7), в якій від однієї амінокислоти до п'яти амінокислот можуть бути заміщені іншою(ими) амінокислотою(ами). 2. Фармацевтична композиція для лікування або профілактики злоякісного новоутворення, яка містить поліпептид за п. 1. 3. Застосування пептиду за п. 1 для одержання лікарського засобу для лікування або профілактики злоякісного новоутворення у індивіда позитивного по HLA-A*1101. 4. Полінуклеотид, який кодує пептид за п. 1. 5. Вектор експресії, який містить полінуклеотид за п. 4. 6. Фармацевтична композиція для лікування або профілактики злоякісного новоутворення, яка містить полінуклеотид за п. 4 або вектор за п. 5. 7. Застосування полінуклеотиду за п. 4 або вектора за п. 5 для одержання лікарського засобу для лікування або профілактики злоякісного новоутворення у індивіда, позитивного по HLAA*1101. 8. WT1-специфічний цитотоксичний Т-лімфоцит, який індукується за допомогою пептиду за п. 1. 9. Ех vivo спосіб індукції WT1-специфічного цитотоксичного Т-лімфоцита, що включає культивування мононуклеарної клітини периферичної крові в присутності пептиду за п. 1 для індукції WT1-специфічного цитотоксичного Т-лімфоцита з мононуклеарної клітини периферичної крові. 10. Набір, який містить поліпептид за п. 1, для індукції WTl-специфічного цитотоксичного Тлімфоцита. 15 UA 103154 C2 5 10 11. Антигенпрезентуюча клітина, яка презентує пептид WTl, де вказана антигенпрезентуюча клітина індукована пептидом за п. 1. 12. Ех vivo спосіб індукції антигенпрезентуючої клітини, яка презентує пептид WT1, що включає культивування незрілої антигенпрезентуючої клітини в присутності пептиду за п. 1 для індукції антигенпрезентуючої клітини, яка презентує пептид WT1, з незрілої антигенпрезентуючої клітини. 13. Набір, який містить поліпептид за п. 1, для індукції антигенпрезентуючої клітини, яка презентує пептид WT1. 14. Застосування цитотоксичного Т-лімфоцита за п. 8 або антигенпрезентуючої клітини за п. 11 для одержання композиції для діагностики злоякісного новоутворення. 16 UA 103154 C2 17 UA 103154 C2 18 UA 103154 C2 19 UA 103154 C2 20 UA 103154 C2 21 UA 103154 C2 22 UA 103154 C2 23 UA 103154 C2 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 24