Пептид, що має імуногеропротекторну дію, фармацевтична композиція на його основі і спосіб її застосування

1. Пептид глутаміл-аспартил-пролін загальної формули: H-Glu-Asp-Pro-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1]. 2. Пептид глутаміл-аспартил-пролін загальної формули: H-Glu-Asp-Pro-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1], що має імуногеропротекторну дію. C2 2 91135 1 3 кції імунорегуляторних пептидів. Вікові зміни імунологічної реактивності пов'язані з порушенням структури і функції генів, що контролюють імунну відповідь, у тому числі генів системи гістосумісності. [Донцов В.И., Крутько В.Н., Подколзин A.A. Фундаментальные механизмы геропрофилактики. - Μ.: Биоинформсервис, 2002. с.464]. Як відомо, терапевтичний потенціал багатьох пептидних препаратів проявляється в стимуляції імунних і репаративних процесів. Пептиди викликають метаболічні зміни, керування якими здійснюється через механізми генної регуляції [Khavinson V.Kh. Malinin V.V. Gerontological Aspects of Genome Peptide Regulation. - Basel: Karger, 2005. - 104p.]. Відомі імуностимулятори пептидної природи: тактивін (патент Франції №2570278), тимозин (Goldstein a.L. et.al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1972, v.69, p.1856-1863). Ці препарати і являють собою набір поліпептидів різної довжини, що впливають на різні ланки імунної відповіді, а також на інші фізіологічні функції організму, що веде до появи небажаних побічних ефектів. Слід також зазначити, що ці препарати отримані з природної сировини, тому практичне використання цих препаратів утруднене в зв'язку зі складністю способів їхнього витягування, малим виходом, а також значною варіабельністю їхніх фізико-хімічних властивостей. Відомі синтетичні пептидні імуностимулятори: аналоги тимопептину (патент США №5013723), тимоген (патент РФ №1737798, ЕР №0445581). З порушеннями роботи імунної системи асоціюються багато захворювань похилого і старечого віку, до яких, насамперед, належать аутоімунні захворювання, пухлини, хвороби суглобів, нирок, амілоїдоз, патологія серцево-судинної системи, інфекційні захворювання. Розширення діапазону несприятливих впливів на організм людини викликає передчасне старіння і прискорює розвиток вікової патології. Виходячи з цього, розробка ефективних імуногеропротекторних засобів стає все більш актуальною. Структурних аналогів, представлених у рівні техніки, запропонований пептид не має. Даним винаходом поставлена і вирішена задача одержання пептиду, що має імуногеропротекторну дію. Технічний результат винаходу полягає в створенні пептиду, що має імуногеропротекторну дію, а також фармацевтичної композиції, що містить як активне начало цей пептид, використання якого стимулює процеси проліферації і диференціювання лімфоцитів за рахунок відновлення синтезу тканиноспецифічних білків, нормалізації метаболічних і молекулярно-генетичних показників при вікових порушеннях клітинного і гуморального імунітету. Даний винахід стосується пептиду глутаміласпартил-пролін загальної формули: H-Glu-AspPro-OH послідовності 1 [SEQ ID NО:1]. Пептид глутаміл-аспартил-пролін загальної формули: H-Glu-Asp-Pro-OH послідовності 1 [SEQ ID NО:1] має імуногеропротекторну дію. 91135 4 Пропонується застосування пептиду глутаміласпартил-пролін загальної формули: H-Glu-AspPro-OH послідовності 1 [SEQ ID NО:1] для приготування фармацевтичної композиції, що має імуногеропротекторну дію. Інший аспект даного винаходу стосується фармацевтичної композиції, що має імуногеропротекторну дію, що характеризується тим, що композиція містить як активне начало ефективну кількість пептиду глутаміл-аспартил-пролін загальної формули: H-Glu-Asp-Pro-OH послідовності 1 [SEQ ID NО:1], а також фармацевтично прийнятний носій. При цьому фармацевтична композиція знаходиться у формі, що підходить для парентерального введення. Наступний аспект даного винаходу стосується способу профілактики і/або корекції вікових порушень клітинного і гуморального імунітету шляхом стимулювання процесів проліферації і диференціювання лімфоцитів, що полягає у введенні пацієнту фармацевтичної композиції, що містить як активне начало ефективну кількість пептиду глутаміласпартил-пролін загальної формули: H-Glu-AspPro-OH послідовності 1 [SEQ ID NО:1] у дозі 0,01100мкг/кг маси тіла, принаймні, один раз на день протягом періоду, необхідного для досягнення терапевтичного ефекту. При цьому введення здійснюють парентерально. Пептид глутаміл-аспартил-пролін загальної формули: H-Glu-Asp-Pro-OH одержують класичним методом пептидного синтезу в розчині. Можливість об'єктивного прояву технічного результату при використанні винаходу підтверджена достовірними даними, наведеними в прикладах, що містять відомості експериментального характеру, отримані в процесі проведення досліджень по методиках, прийнятих у даній галузі. Пептид глутаміл-аспартил-пролін з наступною амінокислотною послідовністю: H-Glu-Asp-Pro-OH, проявляє біологічну активність, а саме - має імуногеропротекторну дію шляхом стимулювання процесів проліферації і диференціювання лімфоцитів за рахунок відновлення синтезу тканиноспецифічних білків, нормалізації метаболічних і молекулярно-генетичних показників при вікових порушеннях клітинного і гуморального імунітету. Стимулююча дія пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH на функціональну активність лімфоцитів виявлена при його експериментальному вивченні. Вивчення біологічної активності пептиду HGlu-Asp-Pro-OH проводили на експлантатах тимусу, у культурі епітеліальних клітин тимусу, в експериментальній моделі радіаційного старіння і на лімфоцитах пацієнтів старечого віку. Поняття «фармацевтична композиція» має на увазі різні лікарські форми, що містять пептид HGlu-Asp-Pro-OH, що можуть знайти лікувальне застосування в медицині як засіб, що має імуногеропротекторну дію. Для одержання фармацевтичних композицій, що відповідають винаходу, ефективну кількість пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH, як активне начало, змішують з фармацевтично прийнятним носієм 5 згідно з прийнятими у фармацевтиці способами компаундування. Під поняттям "ефективна кількість" мають на увазі використання такої кількості активного начала, що відповідно до його кількісних показників активності і токсичності, а також на підставі знань фахівця повинно бути ефективним у даній лікарській формі. Носій може мати різні форми, що залежать від лікарської форми препарату, бажаної для введення в організм. Для парентерального введення носій звичайно включає фізіологічний розчин або стерильну воду, хоча можуть бути включені інші інгредієнти, що сприяють стабільності, або для збереження стерильності. Суть винаходу пояснюється фігурами і таблицями. На Фіг.1 показаний вплив пептиду H-Glu-AspPro-OH на розвиток експлантатів тимусу старих щурів. На Фіг.2 показаний вплив пептиду H-Glu-AspPro-OH на розвиток експлантатів селезінки старих щурів. У Таблиці 1 представлений вплив пептиду HGlu-Asp-Pro-OH на проліферацію тимусних епітеліальних клітин, що були піддані 1, 4 і 7 пасажам. У Таблиці 2 представлений вплив пептиду HGlu-Asp-Pro-OH на хроматин у лімфоцитах осіб старечого віку. У Таблиці 3 представлено вплив пептиду HGlu-Asp-Pro-OH на морфологічні і біохімічні показники периферичної крові морських свинок при вивченні токсичності. У Таблиці 4 представлений вплив пептиду HGlu-Asp-Pro-OH на показники клітинного і гуморального імунітету в осіб літнього і старечого віку, що були піддані впливу малих доз іонізуючого випромінювання. Винахід ілюструється прикладом синтезу пептиду формули глутаміл-аспартил-пролін (H-GluAsp-Pro-OH) (приклад 1), прикладами випробовування біологічної активності пептиду (приклади 2, 3, 4, 5, 6), прикладом токсичності (приклад 7) і прикладом результатів клінічного застосування пептиду, що демонструє його фармакологічні властивості і підтверджує можливість досягнення терапевтичного ефекту (приклад 8). Приклад 1. Синтез пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH 1. Назва сполуки: глутаміл-аспартил-пролін. 2. Структурна формула: H-Glu-Asp-Pro-OH 3. Брутто-формула без протиіона: C14H21NaО8. 4. Молекулярна вага без протиіона: 359,33. 5. Протиіон: ацетат. 6. Зовнішній вигляд: білий аморфний порошок без запаху. 91135 6 7. Спосіб синтезу: пептид отриманий класичним методом синтезу в розчині за схемою: ВОС - трет.бутилоксикарбонільна група, OSu - N-оксисукцинімідний ефір, DCC - Ν,Ν'-дицикдогексилкарбодіімід, OBzl - бензиловий ефір, TFA - трифтороцтова кислота, HOBt - N-оксибензотриазол. 6. Характеристики готового препарату: - вміст основної речовини: 97,19 % (по ВЕРХ, 220нм), - ТШХ - індивідуальний, Rf=0,67 (ацетонітрилвода 2:1), - вміст вологи: 6%, - pH 0,01% розчину: 4,7, - Питоме оптичне обертання: [α]D22: -29° (с=1, Н2О), "Polamat A", Carl Zeiss Jena. Приклад синтезу: 1) BOC-GIu(OBzI)-OSu, N-оксисукцинімідний ефір N-трет.бутилоксикарбоніл-( бензил)глутамінової кислоти (І). N-трет.бутилоксикарбоніл-( бензил)глутамінову кислоту BOC-Glu(OBzl)-ОН (33,7г, 0,1моль) розчиняли в 50мл Ν,Ν'диметилформаміду, охолоджували до температури -10°С, додавали при перемішуванні охолоджені (4-6°С) розчини Ν,Ν'-дициклогексилкарбодііміду (23,0г, 0,11моль) у 30мл Ν,Ν'-диметилформаміду і Ν-гідроксисукциніміду (13,0г, 0,11моль) у 20мл Ν,Ν'-диметилформаміду. Реакційну суміш перемішували протягом 12год. при охолодженні льодом і далі протягом доби при кімнатній температурі. Ν,Ν'-дициклогексилсечовину, що випала, відфільтровували й отриманий розчин активованого ефіру використовували без виділення на наступній стадії. 2) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzI)-OH, Nтрет.бутилоксикарбоніл-( -бензил)глутаміл-(βбензил)аспартат(ІІ). (β-Бензил)аспарагінову кислоту H-Asp(OBzl)OH (28,0г, 0,12моль) і 36мл (0,12моль) триетиламіну суспендували в 50мл Ν,Ν'-диметилформаміду і перемішували протягом 1год. Потім додавали порціями розчин активованого ефіру BOCGIu(OBzl)-OSu (І), отриманого на попередній стадії. Реакційну суміш перемішували при кімнатній 7 температурі протягом 1 діб. Потім підкисляли 0,5н сірчаною кислотою до pH2-3 і екстрагували етилацетатом 4 50мл. Витяжки поєднували і послідовно промивали 0,5н H2SO4 3 50мл, водою 2 50мл, 5% розчином NaHCO3 2 50мл, водою 2 50мл, насиченим розчином NaCl 2 50мл. Органічний шар сушили над Na2SO4, упарювали розчинник у вакуумі, залишок кристалізували під гексаном. Отримано 50г продукту (92%). Rf=0,34 (бензол-ацетон 2:1). 3) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Pro-OBzl (III), бензиловий ефір N-трет.бутилоксикарбоніл-( бензил)глутаміл-(β-бензил)аспартил-проліну (III). 1,2г (2,2ммоль) дипептиду і 0,40г (3ммоль) оксибензотриазолу розчиняли в тетрагідрофурані (5мл) і охолоджували до температури -10°С. 0,62г (3ммоль) дициклогексилкарбодііміду розчиняли в 5мл тетрагідрофурану і охолоджували до тієї ж температури. 0,84г (3,5ммоль) тозилату бензилового ефіру проліну розчиняли в 10мл тетрагідрофурану, додавали 0,5мл (3,5ммоль) триетиламіну і охолоджували до тієї ж температури. При охолодженні на крижаній бані й інтенсивному перемішуванні об'єднували розчини дипептиду з оксибензотриазолом і карбодііміду, через 10хв. додавали розчин тозилату бензилового ефіру проліну. Реакційну суміш перемішували протягом 3год. при охолодженні льодом і протягом 1 доби при кімнатній температурі. Дициклогексилсечовину, що випала, відфільтровували, фільтрат упарювали у вакуумі, залишок розчиняли в етилацетаті (100мл). Розчин промивали послідовно 0,5н сірчаною кислотою, водою, 5% розчином бікарбонату натрію, водою, сушили над безводним сульфатом натрію. Етилацетат упарювали у вакуумі, кристалізували залишок у системі етилацетат/гексан. Перекристалізацію проводили з ізопропанолу. Отримано після сушіння у вакуумі 0,83г продукту (65%). Rf=0,86 (бензол-ацетон 1:1). 4) H-Glu-Asp-Pro-OH (IV), глутаміл-аспартилпролін. Захищений трипептид BOC-Glu(OBzl)Asp(OBzl)-Pro-OBzl (III) (0,8г) розчиняли в суміші метиловий спирт-вода (3:1) (20мл) і гідрували над каталізатором Pd/C (5%) протягом 4год. Каталізатор відфільтровували, розчинник упарювали у вакуумі, залишок сушили у вакуумі над КОН і Р2О5. Далі продукт розчиняли в 10мл суміші хлористий метилен-трифтороцтова кислота (5:1) і витримували при кімнатній температурі протягом 2год. Повноту проходження реакції деблокування контролювали по ТШХ у системі ацетонітрил-вода (1:3). Розчинник упарювали у вакуумі, залишок сушили у вакуумі над КОН. Для очищення 290мг препарату розчиняли в 4мл 0,01% трифтороцтової кислоти і піддавали високоефективній рідинній хроматографії на колонці з оберненою фазою 50 250мм Diasorb-130С16Т, 7mkm. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. Умови хроматографування: А: 0,1% TFA; В: MeCN/0,1% TFA, градієнт В 0 50% за 100хв. Об'єм проби 5мл, детекція при 215нм, сканування при 190-600нм, швидкість потоку 10мл/хв. Відбирали фракцію основного піка. Розчинник упарюва 91135 8 ли у вакуумі при температурі не вище 40°С, упарювання багаторазово (не менше 5 разів) повторювали з 10мл 10% розчину оцтової кислоти. Остаточно залишок розчиняли в 20мл деіонізованої води і ліофілізовували. Отримано 125мг очищеного препарату у вигляді аморфного білого порошку без запаху. 5) Аналіз готового препарату. - Вміст основної речовини визначали методом ВЕРХ на колонці Phenomenex С 18 LUNA 4,6 150mm. A: 0,1% TFA, B: MeCN; grad. В 0-100% in 10min. Швидкість потоку 1мл/хв. Детекція при 220нм, сканування 190-600нм, проба 20μl. Вміст основної речовини 97,19%. - ТШХ: індивідуальний, Rf=0,67 (ацетонітрилвода 2:1, пластинки ПТШХ-П- В-УФ Sorbfil, силікагель СТХ-1ВЕ 8-12мкм, проявлення хлор/бензидин). - Вміст вологи: 6% (гравіметрично по втраті маси при сушінні 20мг при 100°С). - pH0,01% розчину: 4,7 (потенціометрично). - Питоме оптичне обертання: [α]D22: -29° (с=1, Н2О), "Polamat A", Carl Zeiss Jena. Приклад 2. Вплив пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH на розвиток експлантатів тимусу і селезінки старих щурів Експерименти проведені на 35 фрагментах тимусу і 45 фрагментах селезінки щурів у віці 24 міс. Поживне середовище для культивування експлантатів складалося з 35% розчину Ігла, 25% фетальної сироватки теляти, 35% розчину Хенкса, 5% курячого ембріонального екстракту, у середовище додавали глюкозу (0,6%), інсулін (0,5од./мл), пеніцилін (100од./мл), глютамін (2мМ). Фрагменти тимусу і селезінки поміщали в це середовище і культивували в чашках Петрі в термостаті при 36,7°С протягом 2 діб. В експериментальне середовище додавали пептид H-Glu-Asp-Pro-OH у концентраціях 0,5, 10 і 100нг/мл. Критерієм біологічної активності служив індекс площі (ІП) - співвідношення площі усього експлантата разом із зоною росту до вихідної площі фрагмента тимусу або селезінки. Значення ІП виражали у відсотках, контрольне значення ІП приймалося за 100%. Установлено, що через 1 добу культивування відбувалося розпластування експлантатів на колагеновій підкладці і починалося виселення клітин, що проліферують і мігрують по периферії експлантата. На 3-тю добу культивування при концентрації пептиду 0,5нг/мл спостерігалося достовірне підвищення ІП експлантатів тимусу на 24%, у порівнянні з контрольними значеннями ІП (Фіг.1). При дослідженні експлантатів тимусу на більш тривалих термінах культивування (7 днів) була виявлена аналогічна стимулююча дія пептиду в тій же концентрації. При культивуванні експлантатів селезінки з пептидом H-Glu-Asp-Pro-OH спостерігалося достовірне підвищення ІП експлантатів на 28% при концентрації пептиду 10нг/мл (Фіг.2). При дослідженні на 7-му добу культивування була виявлена стимулююча дія пептиду в тій же концентрації, але менш виражена. 9 Таким чином, відносно тканин тимусу і селезінки старих щурів пептид H-Glu-Asp-Pro-OH чинив тканиноспецифічну дію, що проявляється в стимуляції росту експлантатів. Приклад 3. Вплив пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH на продукцію факторів, що активують лімфоцит, у мишей різного віку Одним з інформативних показників, що характеризують функції імунної системи, є зміна продукції мононуклеарними фагоцитами лімфоцитактивуючих факторів (ЛАФ), що включають цитокіни ІЛ-1, ІЛ-6 і ФНПα. Вивчали особливості продукції ЛАФ перитонеальними макрофагами в молодих мишей і старіючих мишей, а також дії на неї пептиду H-Glu-AspPro-OH. ЛАФ-активність макрофагів оцінювали за їхньою здатністю чинити комітогенну дію на проліферацію тимоцитів, стимульованих субоптимальними дозами лектинів в умовах in vitro. Встановлено, що резиденты макрофаги старіючих мишей, 19-20-ти місячних, так само як і молодих, 2-місячних тварин, не продукують ЛАФ без додаткової стимуляції. Виділення ЛАФ макрофагами після їхньої стимуляції ЛПС менш виражене в старіючих мишей, ніж у молодих тварин. Результати дослідження показали, що пептид H-Glu-Asp-Pro-OH, внесений в культуральне середовище в послідовних розведеннях до кінцевої концентрації від 0,5 до 500нг/мл, індукує продукцію ЛАФ нестимульованими перитонеальними макрофагами старіючих мишей і підсилює продукцію ЛАФ під впливом ЛПС. Така ж тенденція в зміні продукції ЛАФ макрофагами спостерігалася при дії на них пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH і в молодих мишей, але не у всьому діапазоні використаних концентрацій. Результати дослідження показали, що вікова зміна продукції ЛАФ макрофагами є одним з механізмів порушень функцій імунної системи при старінні, внаслідок чого пептид H-Glu-Asp-Pro-OH може застосовуватися для їхньої корекції. Приклад 4. Вплив пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH на проліферативну активність епітеліальних клітин тимусу при старінні клітинних культур Дослідження проводили in vitro у культурі тимусних епітеліальних клітин, як такі використовували клітини суспензійної лінії VTEC2.H/S, отриманої шляхом трансформації тимусних епітеліальних клітин ембріонального тимусу людини матеріалом, що містить вірус SV40, і подальшого клонування трансформованих клітин. Пептид H-Glu-Asp-Pro-OH вводили в культури клітин у послідовних розведеннях до кінцевих концентрацій 2, 20 і 200нг/мл. Проліферацію тимусних епітеліальних клітин, що пройшли 1, 4 і 7 пасажів, оцінювали радіометричним методом по включенню 3Н-тимідину. Установлено, що пептид H-Glu-Asp-Pro-OH у трьох випробуваних концентраціях істотно підсилював проліферацію тимусних епітеліальних клітин, особливо в 7 пасажі, причому найбільш вираженим був ефект пептиду в концентрації 200нг/мл (Таблиця 1). Отримані дані свідчать про здатність пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH підсилювати проліферацію ти 91135 10 мусних епітеліальних клітин у старих культурах, що підтверджує імуногеропротекторну дію пептиду. Приклад 5. Вплив пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH на клітини тимусу щурів при передчасному старінні, викликаному впливом іонізуючого випромінювання Експерименти виконані на 40 самцях білих щурів лінії Вістар у віці 2-місяців, що мають масу тіла 180-200г. Для моделювання передчасного старіння використовували гамма-опромінення, на апараті ЛУЧ-1 (джерело 60Со; потужність дози 17,166 10-4Гр/с). Тварини одержували щоденну дозу 6Гр протягом 5 днів. Усі тварини були розділені на 6 груп: 1 і 1а - інтактні щури; 2 і 2а - опромінені щури; 3 і 3а - опромінені тварини, яким вводили пептид H-Glu-Asp-Pro-OH підшкірно через 24 години після першого сеансу опромінення по 0,5мкг на тварину в 0,5мл стерильного 0,9% фізіологічного розчину NaCl протягом 10 днів. Тваринам 2 і2а груп вводилася еквівалентна кількість стерильного фізіологічного розчину по тій же схемі. Умертвіння тварин і виділення тимусу проводили під нембуталовим наркозом (50мг/кг). Тимус у тварин 1-3 груп брали на 14 добу від початку експерименту, а в 1a-3а груп - на 21 добу від початку експерименту. Для світло-мікроскопічних досліджень шматочки тимусу фіксували протягом 24год. у кислій рідині Буєна. Зневоднювання матеріалу і заливання в парафін проводилися по загальноприйнятих методиках. Парафінові зрізи (7мкм) вміщували на предметні стекла, покриті плівкою з полі-L-лізину (Sigma). Загальногістологічне і імуногістохімічне вивчення проводили з використанням мікроскопа Jenamed-2 (Zeiss). Оглядове фарбування препаратів здійснювали гематоксиліном - еозином. Тучні клітини селективно забарвлювали 1% розчином толуїдинового синього (Fluka) у 0,5М НСl при pH0,5. Для електронної мікроскопії шматочки тимусу фіксували по Карновському. Зневоднювання матеріалу і заливання в суміш епонів проводили по загальноприйнятих методиках. Ультратонкі зрізи (100нм), приготовлені на ультрамікротомі LKB-7A (LKB), контрастували уранілом-ацетатом і цитратом свинцю. Електронно-мікроскопічне дослідження здійснювали в електронному мікроскопі JEM100S (Jeol). Для вивчення проліферативної активності клітин використовували мишачі моноклональні антитіла до проліферативного клітинного ядерного антигену (proliferative cell nuclear antigen - PCNA, клон PC 10, Calbiochem, титр 1:50). Візуалізацію імуногістохімічної реакції проводили авідин-біотинпероксидазним методом з використанням набору для виявлення мишачих імуноглобулінів (АВР-kit, Vectastain). Морфометричні дослідження виконані за допомогою системи комп'ютерного аналізу мікроскопічних зображень Imstar із застосуванням пакета ліцензійних програм Morphostar і Colquant-2, відповідно до основних принципів стереології і мор 11 фометрії. Для кожної тварини підрахунок відповідних структур проводили в 10 візуальних полях зору по трьох зрізах. Тестова площа включала не менше 10000 ядер тимоцитів. Тучні клітини в ти2 мусі вимірювали на площі не менше 5мм . Індекс проліферативної активності (IPCNA) обчислювали за формулою: IPCNA(%)-NPCNA/Nядер 100. При світловій мікроскопії на гістологічних зрізах, пофарбованих гематоксиліном-еозином, тимус контрольних тварин має часточкову будову. Форма і розміри часточок варіабельні. Між часточками видні тонкі прошарки сполучної тканини, що містять дрібні кровоносні судини. У часточках чітко розрізняються розташоване зовні коркова речовина і центрально розташована мозкова речовина. Усередині коркового шару знаходяться, головним чином, малі тимусні лімфоцити, що не діляться, розташовані між епітеліальними клітинами кори. Епітеліальні клітини нечисленні, мають зірчасту форму за рахунок довгих і тонких цитоплазматичних відростків, що, з'єднуючись один з одним, утворюють мережу, у якій розташовуються тимоцити коркової речовини. Тимоцити мають округле добре забарвлене ядро з ядерцями. У мозковій речовині кількість лімфоцитів істотно менше, ніж у корковій, а клітинна сполука представлена, в основному, епітеліальними клітинами. На 14-ту і 21-ту добу після опромінення (2, 2а групи) на гістологічних зрізах, пофарбованих гематоксилін-еозином, відзначається, порушення структурної організації тимусу, що виражається, насамперед в атрофічних змінах. Кількість часточок і їхні розміри значно зменшені. Поділ на коркову і мозкову речовину стирається, межа між шарами фактично зникає. У мозковій речовині незначно збільшений вміст лімфоцитів. Співвідношення між паренхімою і стромою порушене у бік збільшення останньої. Кортикальні тимоцити представлені переважно великими і середніми лімфоцитами. У тільцях Гасаля відзначається розпад і дегенерація клітин. При мікроскопічному аналізі препаратів тимусу тварин, яким після першого сеансу опромінення вводився пептид H-Glu-Asp-Pro-ОН (3, 3а групи) відзначалися менш виражені інволютивні зміни в порівнянні з тваринами 2 і 2а груп. Електронно-мікроскопічне вивчення тимусу тварин контрольних груп показало, що в корковій речовині часточок тимоцити утворюють скупчення, що складаються з клітин, що мають подібні розміри і морфологічну структуру. Ці клітини мають великі ядра з конденсованим по периферії хроматином, одним-двома ядерцями великого розміру, і вузький обідок цитоплазми, що містить невелике число мітохондрій і полірибосом. Серед цих клітин зустрічаються великі тимоцити, що мають більш широкий обідок цитоплазми й що містять велике число мітохондрій, так називані активовані лімфоцити. Тучні клітини зустрічаються в міжчасточковій сполучній тканині, поблизу кровоносних судин. Ретикуло-епітеліальні клітини, що частіше добре видні в мозковій речовині часточок, мають відростчасту форму, пухке ядро неправильної форми і 91135 12 цитоплазму, багату канальцями ендоплазматичного ретикулуму. При радіаційному старінні у тварин 2 групи серед найбільш виражених змін у тимусі відзначені наступні: відшарування ділянок зовнішньої ядерної мембрани, порушення тісних контактів між окремими тимоцитами. Однак опромінення не зменшує числа тимоцитів, які діляться, що знаходяться на різних стадіях мітозу. Серед тучних клітин спостерігаються розходження в реакції на опромінення. Так, одні клітини не відрізняються по своїй структурі від мастоцитів контрольних тварин, тоді як в інших спостерігається утворення великих вакуолею, в яких одночасно може знаходитися до десятка секреторних гранул різного ступеня електронної густини, що відбиває різні стадії лізису секреторного матеріалу. У ретикуло-епітеліальних клітинах спостерігається помітне відшарування зовнішньої мембрани, розширення мембран ендоплазматичного ретикулуму, поява численних дрібних вакуолею, набрякання і лізис крист мітохондрій. На 21 день після початку експерименту у тварин при радіаційному старінні (група 2а) у корковій речовині часточок тимусу не спостерігається виражених змін у порівнянні з групою 2. У тварин, яким вводився пептид H-Glu-AspPro-OH, у моделі радіаційного старіння на 14 добу від початку опромінення виражених змін з боку тимоцитів не відзначено. У корковій речовині тимусу вони розташовуються, тісно прилягаючи один до одного, мають відносно однакові за розміром ядра з одним-двома ядерцями. Обідок цитоплазми дуже тонкий, зустрічаються одиничні мітохондрії, у яких добре проглядаються кристи. У ретикулоепітеліальних клітинах спостерігається слабко виражене відшарування каріолеми і зменшення вакуолізації цитоплазми. На 21 добу після опромінення у тварин, що одержували пептид H-Glu-Asp-Pro-OH (група 3а) звертає на себе увага скупчення тучних клітин не тільки в міжчасточковій сполучній тканині, але й у корковій речовині часточок тимусу. При електронно-мікроскопічному дослідженні тимусу опромінених тварин, що одержували пептид H-Glu-Asp-ProOH, у корковій речовині з'являються гранулярні лейкоцити, а також плазматичні клітини, що розташовуються невеликими групами. Ретикулоепітеліальні клітини не виявляють виражених морфологічних змін, але кількість секреторних гранул у їхній цитоплазмі знижується. Таким чином, проведені дослідження показали, що після фракціонованого опромінення в діапазоні сублетальних доз, що моделює передчасне старіння, у тимусі тварин, що одержували пептид H-Glu-Asp-Pro-OH, проявляються особливості структурно-функціональної організації, що виявляються, в основному, на ультраструктурному рівні. Інфільтрація коркової речовини зернистими лейкоцитами і плазматичними клітинами при цьому, можливо, пов'язана саме з інтенсифікацією репаративних процесів, тому що відомо, що гранулоцити чутливі до активації різними гуморальними і клітинними факторами. Скупчення тучних клітин у корковій речовині може бути викликане 13 тим, що для остаточного диференціювання мастоцитів потрібна присутність ІЛ-3, що продукується Т-лімфоцитами. При комп'ютерному аналізі мікроскопічних зображень у 1 групі встановлено, що основна популяція клітин, що проліферують, у тимусі інтактних тварин (IPCNA=26%) розташовується в корковій речовині з тенденцією концентруватися в периферичній зоні часточок, контурованих сполучнотканинними перегородками. У тимусі тварин контрольної групи тучні клітини складають відносно невелику фракцію клітин (16±2 на 1мм2) і зосереджені у вигляді характерних ланцюжків у тонких сполучнотканинних перегородках. В 2 групі PCNA-позитивні ядра зосереджені переважно в периферичній зоні редукованих часточок. Звертає на себе увагу збільшення числа тучних клітин у сполучнотканинних перегородках (27±3). Високий IPCNA і гіперплазія тучних клітин свідчать про період пострадіаційного відновлення тимусу, що почався. У 3 групі під впливом пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH у тимусі реєструється активізація відновних процесів по індексах проліферації. IPCNA досягає 55%. Проліферативна активність в екстрамедулярних зонах кровотворення. Звертає на себе увагу збільшення числа тучних клітин у тимусі опромінених тварин після введення пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH (32±5). Результати проведеного комп'ютерного аналізу мікроскопічних зображень показали, що в опромінених тварин, що одержували пептид H-Glu-AspPro-OH, підсилюється проліферативний потенціал клітин. Ці дані показують, що пептид Н-Glu-AspPro-OH може впливати на купування віддалених наслідків опромінення і, тим самим, чинити імуногеропротекторну дію в радіаційній моделі передчасного старіння. Приклад 6. Вплив пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH на хроматин у лімфоцитах крові людей старечого віку in vitro Відомо, що необхідною умовою для транскрипційної активності генів є активний хроматин. При старінні відбувається посилений процес гетерохроматинізації, що супроводжується інактивацією активних раніше генів. Вивчали вплив пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH на систему хроматинових доменів у культурах лімфоцитів осіб старечого віку, зокрема, на реактивацію хроматину - дегетерохроматинізацію гетерохроматинових супутникових ниток (активність синтетичних процесів рибосомних генів), загального гетерохроматину, структурного гетерохроматину (мінливість С-блоків 1, 9 і 16 хромосом) і факультативного гетерохроматину. Дослідження проводилися на хромосомах 150 ФГА-стимульованих і 40 ФГА-нестимульованих культур лімфоцитів, отриманих від 95 практично здорових індивідів у віці 75-88 років (контроль - 25 донорів у віці 20-40 років). Вивчали по 2 клітинні культури від кожного індивіда - інтактну і з додаванням пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH у культуральне середовище до кінцевої концентрації пептиду 0,01мкг/мл. Для вивчення кожного параметра аналізували від 30 до 50 метафаз як інтактних, так і оброблених пептидом культур лімфоцитів (по 10 культур). 91135 14 Для визначення активності рибосомних генів в інтактних культурах і при дії пептиду застосовували методи Ag-бендування й обліку асоціацій ділянок ядерцевих організаторів (РЯО) акроцентричних хромосом. Мінливість рівня активності визначали шляхом порівняння двох біноміальних сукупностей. Визначали поліморфізм структурного Сгетерохроматину 1, 9 і 16 хромосом. Для порівняльного аналізу С-забарвлених хромосом інтактних і оброблених пептидом культур застосовували стандартну систему класифікації, відповідно до якої розміри С-сегментів 1, 9, 16 хромосом порівнювали з коротким плечем 16 хромосоми і результати розподіляли на 5 категорій - a, b, c, d, e. Про мінливість факультативного гетерохроматину судили по частоті сестринських хроматидних обмінів (СХО) в інтакних і оброблених пептидом лімфоцитах. Аналіз частоти виявлення Ag-позитивних РЯО показує, що аргентофільність визначених акроцентриків відрізняється в контрольних і оброблених пептидом культурах клітин (Таблиця 2). Виявлено, що кількість Ag-позитивні РЯО, що асоціюють акроцентриків на одну клітину в культурах, оброблених пептидом, статистично вірогідно підвищене в порівнянні з показниками контрольних культур в осіб старечого віку. Слід зазначити, що під дією пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH відбувалося рівномірне наростання частоти асоціацій DD-, DG- і GG-типів. Підвищення кількості Ag-позитивних РЯО і частоти асоціацій акроцентричних хромосом у культурах лімфоцитів, що були піддані дії пептиду НGlu-Asp-Pro-OH, свідчить про дегетерохроматинізацію супутникових ниток, що обумовлює активацію рибосомних генів при старінні. Установлено, що пептид H-Glu-Asp-Pro-OH у лімфоцитах осіб старечого віку розвертає вищі рівні організації хроматину, дегетерохроматинізує загальний (факультативний і структурний) гетерохроматин (Таблиця 2). Дані гетероморфізму (зменшення розмірів великих блоків) структурного гетерохроматину (Ссегменти) окремо по 1, 9 і 16 хромосомам в інтактних і оброблених пептидом H-Glu-Asp-Pro-OH лімфоцитах осіб старечого віку представлені в Таблиці 2. При впливі пептидом H-Glu-Asp-Pro-OH гетероморфними виявилися 1 і 9 хромосоми. При цьому ступінь виразності гетероморфізму для зазначених хромосом статистично достовірний. Відомо, що 1 і 9 хромосоми відрізняються вираженою варіабельністю абсолютного і відносного розмірів С-гетерохроматину при деяких патологіях і при дії хімічних речовин, у той час як розподіл варіантів С-сегментів гетерохроматину по 16 хромосомі залишається стабільним. Крім того, відзначається достовірне збільшення С-сегментів 1 хромосоми (гетерохроматинізація прицентромерного гетерохроматину) в осіб старечого віку. Відповідно до отриманих результатів, вплив пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH на лімфоцити обумовлює зменшення розмірів С-блоків 1 і 9 хромосом, що свідчить про вибіркову здатність пептиду викликати деконденсацію (дегетерохроматинізацію) 15 структурного гетерохроматину в клітинах осіб старечого віку. Пептид H-Glu-Asp-Pro-OH викликав підвищення частоти сестринських хроматидних обмінів у клітинах осіб старечого віку (Таблиця 2). Виявлене зростання значень СХО в лімфоцитах осіб старечого віку відбувається за рахунок деконденсації гетерохроматинізованих еухроматинових ділянок хромосом, зумовленої дією пептиду H-Glu-AspPro-OH. Таким чином, пептид H-Glu-Asp-Pro-OH викликає деконденсацію щільноупакованих фібрил хроматину, що корелює з відновленням експресії генів, репресованих у результаті гетерохроматинізації еухроматинових ділянок хромосом при старінні. Приклад 7. Вивчення токсичності пептиду HGlu-Asp-Pro-OH Загальнотоксичну дію пептиду H-Glu-Asp-ProOH досліджували відповідно до вимог «Пособия по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005): гострої токсичності при однократному введенні препарату, а також підгострої і хронічної токсичності при тривалому введенні пептиду. Дослідження з вивчення гострої токсичності проведене на 60 білих безпородних мишах-самцях масою 18-21г. Тварини були рандомізовано розділені на 6 однакових груп.Препарат уводили тваринам однократно внутрішньом'язово в дозах 1мг/кг, 2мг/кг, 3мг/кг, 4мг/кг, 5мг/кг у 0,25мл стерильного 0,9% розчину NaCl. Тваринам контрольної групи в тому ж об'ємі вводили стерильний 0,9% розчин NaCl. Дослідження з вивчення підгострої токсичності проведене на 50 білих безпородних щурахсамцях з масою тіла 170-210г. Щодня однократно тваринам піддослідних груп вводили препарат внутрішньом'язово протягом 90 днів у дозах 1мкг/кг, 0,1мг/кг, 1мг/кг у 0,5мл стерильного 0,9% розчину NaCl. Тваринам контрольної групи вводили в тому ж об'ємі стерильний 0,9% розчин NaCl. До введення препарату, на 30, 60 і 90 добу після початку введення препарату у тварин досліджували морфологічний склад і властивості периферичної крові. При завершенні експерименту досліджували біохімічні і коагулологічні показники крові. Дослідження з вивчення хронічної токсичності проводили протягом 6 місяців, виходячи з тривалості клінічного призначення препарату, що рекомендується, на 80 морських свинках-самцях з масою тіла 280-310г. Тварини піддослідних груп одержували щодня однократно внутрішньом'язово пептид протягом 6 міс. у дозах 1мкг/кг, 0,1мг/кг, 1мг/кг у 0,5мл стерильного 0,9% розчину NaCl. У контрольній групі тваринам вводили за аналогічною схемою стерильний 0,9% розчин NaCl в тому ж об'ємі. У тварин у периферичній крові загальноприйнятими методами визначали: кількість еритроцитів, гемоглобіну, ретикулоцитів, тромбоцитів, лейкоцитів, лейкоцитарну формулу, швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ), резистентність еритроцитів. Поряд з цим визначали вміст у сироватці крові загального білка по методу Лоурі, калію і натрію методом плазменної спектрофотометрії. Після завершення експерименту проводили пато 91135 16 морфологічне дослідження головного і спинного мозку, спинномозкових гангліїв, щитовидної залози, паращитовидних залоз, надниркових залоз, сім'яників, гіпофіза, серця, легень, аорти, печінки, нирки, сечового міхура, підшлункової залози, шлунка, тонкої кишки, товстої кишки, тимусу, селезінки, лімфатичних вузлів, кісткового мозку. При вивченні гострої токсичності встановлено, що однократне введення досліджуваного пептиду тваринам в дозі, що перевищує терапевтичну, рекомендовану для клінічного застосування, більш ніж у 5000 разів, не викликає токсичних реакцій, що свідчить про велику терапевтичну широту препарату. Вивчення підгострої і хронічної токсичності пептиду свідчить про відсутність побічних ефектів при тривалому застосуванні препарату в дозах, що перевищують терапевтичну в 100-1000 разів. При дослідженні не відзначено достовірного впливу досліджуваного пептиду на морфологічні, біохімічні показники в периферичній крові, а також на ШОЕ і резистентність еритроцитів (Таблиця 3). При оцінці загального стану тварин, морфологічних і біохімічних показників периферичної крові, морфологічного стану внутрішніх органів, стану серцево-судинної і дихальної систем, функції печінки і нирок патологічні зміни в організмі не виявлені. Відсутність загальнотоксичної дії дозволяє рекомендувати фармацевтичну композицію, що містить як активне начало пептид H-Glu-Asp-Pro-OH, для проведення клінічних досліджень. Приклад 8. Ефективність застосування пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH у літніх хворих з віковим зниженням імунного статусу Відомо, що різні фактори фізичної, хімічної і біологічної природи в залежності від тривалості або інтенсивності їхнього впливу на організм людини можуть приводити до виснаження адаптаційних і компенсаторних механізмів і викликати глибокі порушення в різних ланках системи імунного захисту. Патологічні порушення в системі імунітету сприяють, як правило, затяжному перебігу основного захворювання зі схильністю до рецидивів, зниженню опірності організму до інфекції і розвитку важких ускладнень. Особливу групу хворих складають пацієнти літнього і старечого віку, що відрізняються віковим зниженням імунного статусу і страждають звичайно на декілька захворювань, перебіг яких подовжується порушеннями в системі імунітету. Вивчення ефективності застосування фармацевтичної композиції, що містить як активне начало ефективну кількість пептиду H-Glu-Asp-Pro-OH, проводили в хворих літнього і старечого віку, що були піддані тривалому впливу малих доз іонізуючого випромінювання. Основну групу склали 38 літніх хворих (18 чоловіків, 20 жінок), яких розділили на 3 підгрупи в залежності від ступеня виразності .змін імунного статусу. При виражених порушеннях імунного статусу, що супроводжувалися значним погіршенням загального стану, пацієнтам додатково до загальноприйнятих засобів лікування вводили фармацевтичну композицію, що містить пептид H-Glu-AspPro-ОН, у дозі 5,0мг у 1,0мл стерильного 0,9% фі 17 91135 зіологічного розчину внутрішньом'язово однократно щодня протягом 10 днів, при середньому ступені виразності порушень імунного статусу - у дозі 10,0мкг у 1,0мл стерильного 0,9% фізіологічного розчину внутрішньом'язово однократно щодня протягом 10 днів. Хворим літнього і старечого віку з віковим зниженням імунного статусу вводили фармацевтичну композицію, що містить пептид HGlu-Asp-Pro-OH, у дозі 1,0мкг у 1,0мл стерильного 0,9% фізіологічного розчину внутрішньом'язово однократно щодня протягом 10 днів. 32 хворих контрольної групи (14 чоловіків, 18 жінок) одержували тільки загальноприйняті засоби терапії. Вік хворих обох груп складав від 62 до 83 років. Ефективність застосування фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Pro-OH, оцінювали по динаміці скарг хворих і по ряду об'єктивних показників: загальноклінічному дослідженню крові і сечі, імунологічному дослідженню периферичної крові (кількість Т- і В-лімфоцитів визначали методом імунофлуоресценції з моноклональними антитілами, отриманими до диференціювальних антигенів лімфоцитів CD3, CD4, CD8, CD20; вміст імуноглобулінів різних класів - методом радіальної імунодифузії в гелі по Манчіні; функціональну активність Т-лімфоцитів - у реакції гальмування міграції лімфоцитів (РГМЛ) з КонА). Проведені дослідження показали, що в 92% осіб, що проживають на екологічно несприятливій території, мають місце порушення в імунному статусі, що виявляються в зниженні кількості CD3+, СО4+-клітин при незначному збільшенні кількості лімфоцитів з фенотипом CD8+, що свідчить про зниження рівня імунореактивності організму (порушення співвідношення CD4+/CD8+). Результати РГМЛ із КонА характеризують зниження функціональної активності Т-лімфоцитів (переважно CD8+, тобто Т-супресорів/кілерів). Вміст СВ20+клітин, що представляють субпопуляцію Bлімфоцитів, вірогідно не відрізнявся від нормальних показників, але, разом з тим, спостерігалося збільшення кількості імуноглобулінів Μ і G у сироватці крові літніх хворих, що свідчить про порушення й удій ланці імунітету (Таблиця 4). Необхідно відзначити, що кількісні показники вмісту CD3+ і СО4+-клітин характерні для нижніх границь фізіологічних коливань їхньої кількості в осіб старших вікових груп, що свідчить про виснаження і передчасне старіння імунної системи. Як правило, особи з вторинним імунодефіцитним станом мали вира 18 жений астенічний синдром і істотні зміни з боку серцево-судинної системи. Результати проведених досліджень переконливо свідчать про те, що фармацевтична композиція, що містить як активне начало пептид H-Glu-Asp-Pro-OH, є ефективним засобом для корекції вторинних імунодефіцитів, що розвиваються у відповідь на вплив екстремальних факторів і що характеризують передчасне старіння організму. Застосування фармацевтичної композиції, що містить пептид H-Glu-Asp-Pro-OH, у комплексі із симптоматичними засобами дозволило нормалізувати порушені показники імунної системи в 82% хворих (у контрольній групі - у 56% хворих). Як випливає з наведених у Таблиці 4 даних, найбільший ефект від застосування пептиду HGlu-Asp-Pro-OH відзначався у відношенні субпопуляцій Т-лімфоцитів і їхньої функціональної активності (достовірне підвищення вмісту CD3+- і СО4+лімфоцитів, нормалізація співвідношення CD4+/CD8+). Менш виразна реакція спостерігалася з боку В-системи імунітету, імовірно, унаслідок її більшої консервативності. Однак чітко видна тенденція до нормалізації вмісту імуноглобулінів Μ і G, причому в групі хворих, що одержували пептид H-Glu-Asp-Pro-OH, ці показники знизилися до вікової норми, щоскладає 1,65 і 15,45г/л, відповідно. Після проведеного курсу лікування з застосуванням фармацевтичної композиції, що містить як активне начало пептид H-Glu-Asp-Pro-OH, літні пацієнти, що одержали малі дози іонізуючого випромінювання, відзначали значне поліпшення загального стану і зниження виразності астенічного синдрому, що завжди супроводжує вторинні імунодефіцити. Таким чином, застосування фармацевтичної композиції, що містить як активне начало пептид H-Glu-Asp-Pro-OH у різних дозуваннях у залежності від ступеня виразності порушення імунного статусу, сприяє поліпшенню самопочуття пацієнтів літнього і старечого віку, що піддавалися тривалому впливу малих доз іонізуючого випромінювання, нормалізації в них показників клітинного і гуморального імунітету, не викликає побічної дії, ускладнень і лікарської залежності і може. застосовуватися з лікувально-профілактичною метою в поєднанні з будь-якими засобами симптоматичної і патогенетичної терапії, використовуваними для корекції вторинних імунодефіцитних станів (імуномодуляторами, адаптогенами, вітамінами та ін.) Таблиця 1 Варіант досліду Контроль Пептид H-Glu-Asp-Pro-OH Доза, нг/мл 0 2 20 200 * - Р