Пептид, здатний зв’язуватися з інтерлейкін-1b-конвертуючим ферментом (ісе) та фармацевтична композиція, що його містить

Даний винахід стосується пептидів, які здатні зв'язуватися з ICE і (або) із ферментами сімейства ICE, при тому, що цей пептид містить амінокислотну послідовність за SEQ ID NO: 1, наведену в списку послідовностей, в якій Хаа обраний з аспарагінової кислоти і аланіна, що необов'язково містить одну або декілька амінокислот на її N-кінці і (або) С-кінці. Він також стосується застосування зазначеного пептиду для приготування фармацевтичних композицій, активних при захворюваннях, що вимагають інгібування ICE і (або) придушення ферментів сімейства ICE. ICE (інтерлейкін-1b-конвертуючий фермент) є гетеродимерною цистеїн протеазою, яка недавно була очищена і клонована [1]. Інтерлейкін-1b (ΙL-1b) синтезується у виді неактивного попередника з молекулярною масою 33 або 31кД (plL-1b); зріла форма IL-1b з молекулярною масою 17,5кД, що характеризується повною активністю, починається з залишку Ala117 і утворюється в результаті процесінга між залишками Asp116 і Ala117 [2, 3]. Таким чином, білок-попередник ΙL-1b розщеплюється за участю ICE з утворенням зрілої і біологічно активної форми. Активність ICE була встановлена в моноцитах і клітинах ТНР1, в яких розщеплення plL-1b здійснюється як за Asp116-Ala117, так і за Asp27-Gly28 з утворенням продуктів із молекулярними масами 17,5 і 28кД, відповідно [3, 4]. Розщеплення за кожним з цих сайтів є залежним від залишку аспарагінової кислоти, що знаходиться в положенні Р1 [4, 6, 7]. Стає зрозумілим, що цистеїнові протеази, споріднені білку загибелі клітин сеd-3 нематоди Caenorhabditis elegans, представляють ефекторний компонент у комплексі механізмів апоптозу. ICE був першим охарактеризованим гомологом CED-3, і відомо, що надлишкова експресія ICE або CED-3 у фібробластах Rat-1 індукує апоптоз [8]. Подальші дослідження також підтверджують, що протеази сімейства ICE можуть відігравати важливу роль у механізмах апоптоза. Передбачувано ICE є специфічним ферментом процесінгу plL-1b, тому що він не розщеплює IL-1a або ряд інших білків, що включають велику кількість зв'язків Asp-X. Інтерлейкіни IL-1a і IL-1b є полейотропними цитокінами, що при наявності дуже низького рівня подібності послідовностей виявляють ряд подібних ефектів у різних тканинах і діють при багатьох патологічних станах людини, зокрема, при формуванні імунної відповіді організму і при запальних процесах [9]. Обидва білки характеризуються молекулярною масою біля 17,5кД і початково синтезуються у виді молекул-попередників більшого розміру з молекулярною масою біля 31кД. Інтерлейцини-1 є потенційними запальними і пірогенними цитокінами, що звичайно виявляють сприятливу дію, але також можуть мати і різко негативний вплив на здоров'я організму. Вони можуть, наприклад, брати участь у патогенезі аутоімунних захворювань, таких як системна червона волчанка, і, зокрема, вони залучені в якості медіаторів у посилення ушкодження тканин, наприклад, при ревматоїдному артриті. Багато які з біологічних дій інтерлейкінів-1 подібні з такими, що можуть бути виявлені при сепсисі. Останні дослідження показали, що внутрішньовенне введення IL-1 в дозах 1-10нг/кг приводить до лихоманки, безсоння, анорексії, генералізованної міалгії, артралгії (суглобним болям) і сильних головних болів. Оскільки інтерлейкіни-1 мають плейотропні біологічні активності, багато з яких негативно впливають на організм, потужній вплив IL-1 повинен знаходитися під жорстким фізіологічним контролем. Синтез IL-1 інгібується протизапальними цитокінами, простагландинами і глюкокортикоїдами, і існування множинних рівнів інгібування IL-1 вказує на необхідність жорсткого контролю цього медіатора. Існують два типи рецепторів IL-1, що позначаються IL-1RI і IL-1RII. IL-1RІІ є неінформаційною молекулою, що зв'язує IL-1, яка активна як регульована мішень-пастка для IL-1 [10, 11, 12]. Поліпептид, що є антагоністом рецептора IL-1, в даний час описаний: третім відомим на сьогодні компонентом сімейства рецептор-зв'язуючих білків є антагоніст рецептора IL-1 (IL-1ra) [13, 14, 15]. Усі три компоненти (IL-la, IL-1b, ІL-1га) розпізнають і зв'язуються з тим самим рецептором клітинної поверхні (IL1R); зв'язування IL-1a і IL-1b на IL-1R є інформаційним (передає сигнал), в той час як зв'язування ІL-1rа неінформаційне. IL-1ra є поліпептидом, що зв'язується з IL-1RI і з меншою афінністю з IL-1RII, при відсутності будь-якої агоністичної активності. Продукування IL-1ra індукується дією Імуноглобуліна-G, цитокінів і бактеріальних продуктів у клітинах різного типу, включаючи моноядерні фагоцити, поліморфоядерні клітиники (PMN) і фібробласти. До цього часу дві молекулярні форми IL-1ra ідентифіковані і клоновані: 1) секретований IL-1ra (slL-1ra) включає класичну основну послідовність із 25 амінокислот, що дає зрілий білок із 152 амінокислот; 2) внутрішньоклітинний IL-1ra (iclL-1ra) втрачає основну послідовність, що дозволяє припустити, що такий білок залишається всередині клітини. slL-1ra і ісІL-1r генеруються тим самим геном. Транскрипти ісІL-1rа утворяться внаслідок використання альтернативного сайта початку транскрипції і сплайсінга першого альтернативного екзона за внутрішнім акцепторним сайтом сплайсінга, що розташований в першому екзоні slL-1ra. Таким чином, передбачені білки характеризуються ідентичною амінокислотною послідовністю, за винятком їх NН2 -кінців, в яких 21 амінокислота slL-1ra заміщена 4 амінокислотами в iclL-1ra. Експресія транскриптів, що кодують slL-1ra і ісІL-1rа, регулюється по-різному. Біологічне значення iclL1ra поки не встановлено. Приймаючи до уваги, що IL-1 бере участь у патогенезі багатьох захворювань, безсумнівна необхідність наявності медикаментів, що застосовуються для обмеження негативних проявів IL-1. Нова молекулярна форма iclL-1 була недавно ідентифікована і клонована [16, РСТ/ЕР 95/04023]. Ця молекула утворюється шляхом вставки в кодуючу рамку нового 63-нуклеотидного екзона, розташованого між першим і другим екзонами специфічною для iclL-1ra форми. Експресія цього нового транскрипту була виявлена в фібробластах, кератиноцитах, активованих моноцитах і поліморфоядерних клітинах. Експресія в клітинах COS вказує на те, що ця нова молекула в основному є внутрішньоклітинною і характеризується молекулярною масою приблизно 25кД за даними SDS-PA-GE (електрофорез в поліакриламідному гелі з натрійдодецилсульфатом). Ця нова молекула була позначена iclL-1ra типу II (icIL-1rall). З врахуванням того, що iclL-1rall є внутрішньоклітинним білком, так само як і ICE, заявник також досліджував здатність icIL-1rаІІ пригнічувати активність ICE. Результати наведені в прикладах у даному винаході, і вони показують, що iclL1rall інгібує активність ICE. Основним об'єктом даного винаходу є забезпечення новими пептидами, здатними зв'язуватися з ICE, блокуючи в такий спосіб утворення активної форми IL-1b і (або), в більш загальному виді, здатними зв'язуватися з ферментами сімейства ICE, блокуючи тим самим активність таких ферментів. Відповідно, даний винахід стосується пептиду, здатного зв'язуватися з ICE і (або) із ферментами сімейства ICE, при тому, що цей пептид містить амінокислотну послідовність за SEQ ID NO: 1, наведену в списку послідовностей, в якій Хаа обраний з аспарагінової кислоти і аланіну, як особливо показано в SEQ ID NO: 2 або 3, що необов'язково містить одну або декілька амінокислот на її N-кінці і (або) С-кінці. Відповідно, пептид за даним винаходом може складатися з 19-40, а краще з 19-25 амінокислот. Особливо, відповідно до одного з аспектів винаходу, пептид містить амінокислотну послідовність за SEQ ID NO: 4 або 5. Необмежений список цистеїнових протеаз сімейства ICE включає: CED-3 [17], Nedd-2/lСН-1 [18, 19], Yama/CPP-32/апопаїн [20, 21, 22], Тх/ІСН-2/ІСЕ-подібний II [23, 24, 25], ІСЕ-подібний III [25], Mch-2 [26], ICELap3/Mch-3/CMH-1 [27, 28, 29], ICE-LAP-6 [30] і FUCE/MACH [31, 32]. Іншим завданням даного винаходу є представлення пептиду в суттєво очищеному виді так, щоб він був придатним для використання в складі фармацевтичних композицій у якості активного інгредієнта при патологіях, при яких необхідно інгібування ICE і (або) інгібування ферментів із сімейства ICE. Прикладами патологій, при яких новий антагоніст, відповідно до даного винаходу, може бути ефективно використаний для вирішення профілактичних, терапевтичних або діагностичних цілей, є смертельні вірусні і бактеріальні інфекції, так само як аутоімунні і запальні захворювання. Специфічні приклади включають: ревматоїдний артрит, септичний шок, гострий мієломоноцитарний лейкоз, імунореакція відторгнення при трансплантації, синдром придбаного імунодефіциту (СНІД), виразковий коліт і розсіяний склероз. Інші завдання і переваги даного винаходу будуть зрозумілі з подальшого опису. Втілення винаходу представляє введення фармакологічно активної кількості пептиду за даним винаходом донорам у випадку ризику розвитку захворювання, при яких потрібно інгібування ICE і (або) інгібування ферменту сімейства ІСЕ, або донорам, у яких такі захворювання вже мають місце. Може бути використаний будь-який тип введення активної речовини, однак найкращим вважається парентеральне введення, оскільки воно дозволяє досягати системного ефекту в короткий час. З цієї точки зору кращим є введення у виді внутрішньовенної кульки до, в процесі або після хірургічної операції. Доза введеного пептиду залежить від медичних показань, зв'язаних із віком, вагою тіла й індивідуальною реакцією пацієнта. Дози можуть знаходитися в межах від 0,05 до 30мг на 1кг ваги тіла, а кращі дози складають 0,1-10мг/кг ваги тіла. Фармацевтичні композиції для парентерального застосування можуть бути приготовлені в ін'єкційній формі, що включає активну речовину і зручний носій. Носії для парентерального введення добре відомі в даній області техніки і включають, наприклад, воду, сольовий розчин, фізіологічний розчин і декстрозу. Носій може включати меншу кількість наповнювача з метою підтримки стабільності і ізотонічності розчину. Приготування зазначених розчинів може бути проведене у відповідності зі стандартними процедурами, а кращий вміст пептиду повинен складати 1-10мг/мол. Даний винахід описаний стосовно до спеціальних його втілень, але зміст опису включає всі модифікації і заміщення, які можуть бути зроблені фахівцем у даній області техніки без виходу за межі завдань і цілей, що охоплюються формулою винаходу. Винахід буде тепер охарактеризовано за допомогою наступних прикладів, що не повинні розглядатися як такі, що будь-яким чином обмежують даний винахід. Приклади будуть мати посилання на малюнки, описані нижче. Фіг.1: показує дані аналізу за методом Нозерн-блоттінга експресії мРНК ICE в трансфікованих клітинах COS. Загальний пул мРНК, екстрагованих клітинами COS, трансфікованих порожнім вектором або кДНК, що кодує ICE людини, аналізували за методом Нозерн-блоттінга з метою підтвердження експресії специфічної для ICE мРНК. Зокрема: лінія 1 - порожній вектор, лінія 2 - ICE. Фіг.2: показує дані Вестерн-блоттінга, plL-1b інкубували з лізатом моноцитів, виготовлені відповідно до описаного в літературі методу [4]: через 60 хвилин інкубації при 37°С реакційну суміш розганяли за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі з натрійдодецилсульфатом, а присутність попередника або зрілого IL-1b маркірували за допомогою Вестерн-блоттінга. Зокрема: лінія 1 - plL-1; лінія 2: plL-1 + лізат моноцитів. Фіг.3: показує амінокислотні послідовності досліджуваних пептидів. Пептид A (SEQ ID NO: 6) і пептид С (SEQ ID NO: 4) були визначені на базі послідовності iclL-1ralI. Пептид X (SEQ ID NO: 7) є випадково обраним пептидом. Пептид S (SEQ ID NO: 5) ідентичний пептиду С, за винятком наявності двох залишків аланіну, що заміщають два залишки аспарагінової кислоти. Пептид В (SEQ ID NO: 8) є відомим інгібітором ICE [1a]. Фіг.4: показує інгібування активності ICE низькими концентраціями досліджуваних пептидів. plL-1b (5нг) інкубували з ICE у присутності або у відсутності пептидів (0,25 або 2,5мккМ), а присутність попередника або зрілого IL-1b була підтверджена також, як це описано для фіг.2. Зокрема: лінія 1: plL-1; лінія 2: plL-1 + пептид А; лінія 3: plL-1 + пептид В; лінія 4: plL-1 + пептид С; лінія 5: plL-1 + ICE; лінія 6 plL-1 + ICE + пептид-Α (2,5мкМ); лінія 7: plL-1 + ICE + пептид-Α (0,25мкМ); лінія 8: plL-1 + ICE + пептид-В (2,5мкМ); лінія 9: plL-1 + ICE + пептид-В (0,25мкМ); лінія 10: plL-1 + ICE + пептид-С (2,5мкМ); лінія 11: plL-1 + ICE + пептид-С (0,25мкМ). Фіг.5: показує інгібування активності ICE високими концентраціями досліджуваних пептидів. plL-1b (5нг) інкубувапи з ICE у присутності або у відсутності пептидів (40 або 400мкМ), а присутність попередника або зрілого IL-1b була підтверджена також, як це описано для фіг.2. Зокрема: лінія 1: plL-1 + пептид-А; лінія 2: plL-1 + пептид-В; лінія 3: plL-1 + пептид-С; лінія 4: plL-1 + пептид-Х; лінія 5: plL-1; лінія 6: plL-1 + ICE; лінія 7: plL-1 + ICE + пептид-Α (400мкМ); лінія 8: plL-1 + ICE + пептид-В (400мкМ); лінія 9: plL-1 + ICE + пептид-С (400мкМ); лінія 10: plL-1 + ICE + пептид-Х (400мкМ); лінія 11: plL-1 + ICE + пептид-Α (40мкМ); лінія 12: plL-1 + ICE + пептид-В (40мкМ); лінія 13: plL-1 + ICE + пептид-С (40мкМ); і лінія 14: plL-1 + ICE + пептид-Х (40мкМ). Фіг.6: показує інгібування активності ICE пептидами С і S. plL-1b (5нг) інкубували з ICE у присутності або у відсутності пептидів (100, 300 або 1000мкМ), а присутність попередника або зрілого IL-1b була підтверджена також, як це описано для фіг.2. Зокрема: лінія 1: plL-1; лінія 2: plL-1 + пептид-С; лінія 3: plL-1 + пептид-S; лінія 4: plL-1 + пептид-В; лінія 5: pIL-1 + ICE; лінія 6: plL-1 + ICE + пептид-С (0,1мМ); лінія 7: plL-1 + ICE + пептид-С (0,3мМ); лінія 8: plL-1 + ICE + пептид-С (1мМ); лінія 9: plL-1 + ICE + пептид-S (0,1мМ); лінія 10: plL-1 + ICE + пептид-S (0,3мМ); лінія 11: plL-1 + ICE + пептид-S (1мМ); лінія 12: plL-1 + ICE + пептид-В (1мМ). Приклади Матеріали і методи Реагенти Наступні стандартні реагенти були використані для культивування і сепарування клітин: Ficoll (Seramed, Berlin, Германія), Percoll (Pharmacia, Uppsala, Швеція), RPMI-1640 (Seramed, Berlin, Германія), FCS (Hyclone Laboratories, Logan, Великобританія), глутамін (Seramed, Berlin, Германія) і Hepes (Merk, Darmastadt Германія). Клітини Моноядерні клітини були отримані з периферичної крові здорових донорів із використанням центрифугування в градієнті Фіколл. Очищені моноцити сепарували з моноядерних клітин за допомогою центрифугування в градієнті Перколл при 2000об/хв протягом 30 хвилин при кімнатній температурі [10]. Клітини COS-7 (узяті з колекції АТСС, Роквілл, Мериленд, США) і моноцити культивували в середовищі RPMI-1640 із додаванням 10% плідної телячої сироватки, 2мМ глутаміну, 20мМ HEPES. Рекомбінантний попередник IL-1b людини був отриманий від Cistron Biotechnology, Pinebroom, NJ (США). Поліклональне антитіло, активне по відношенню і попередника, і зрілого IL-1b, було отримано в цій же лабораторії. ПЛР кДНК ICE була отримана за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з ревертируванням із використанням опублікованих послідовностей (8а). Полімеразна ланцюгова реакція з ревертируванням була проведена відповідно до описаної процедури [16] протягом 30 циклів при 95°С протягом 1,5 хвилин, при 55°С протягом 1,5 хвилин і при 72°С протягом 1,5 хвилин. Олігонуклеотиди були отримані від Duotech (Milan, Італія). Послідовності олігонуклеотидів, що використовувалися для ампліфікації ICE, були наступними: "пряма затравка" ICE 1: 5'-AAAAGCCATGGCCGACAAGGTC-3' (SEQ ID NO: 9) "зворотна затравка" ICE 2: 5'-TCTCTTCACCCTGCCCACAGAC-3' (SEQ ID NO: 10) Результати Експресія рекомбінантного ферменту ICE у клітинах COS кДНК, що кодує ICE людини, була ампліфікована з застосуванням ПЦР. Послідовність була підтверджена, а кДНК була субклонована до складу експресуючого вектора pSG5. Клітини COS були трансфіковані порожнім вектором або вектором, що включає кДНК ICE і через 48 годин клітини аналізували за експресією мРНК, специфічною для ICE. Як показано на фіг.3, клітини COS, трансфіковані кДНК ICE, експресують високий рівень мРНК ICE. Лізат моноцитів, виготовлений відповідно до описаного раніше методу [11], також був здатний конвертувати plL-1b у зрілу форму (фіг.2). Таким чином, рекомбінантний ICE або свіжоізольовані моноцити людини були використані в якості джерела каталітичної активності ICE для подальших експериментів. Інгібування активності ICE Готували джерело активності ICE, а його здатність розщеплювати plL-1b тестували шляхом інкубації суміші при 37°С протягом 1 години. Потім суміш розганяли за допомогою электрофорезу у поліакриламідному гелі з натрійдодецилсульфатом, а присутність plL-1b або зрілої форми оцінювали за методом Вестерн-блоттінга. Були позначені чотири пептиди, що відрізняються, синтезовані і тестовані за здатністю інгібувати активність ICE. Ці пептиди зазначені на фіг.3: вони були отримані шляхом синтезу у твердій фазі на устаткуванні Applied Biosystems (Foster City, CA). Чистоту цих пептидів перевіряли за методом рідинної хроматографії під високим тиском. У якості позитивного контролю використовували тетрапептид В (Bachem, Bubendorf, Швейцарія), згаданий на фіг.3, що є відомим інгібітором ICE [1a]. Список послідовностей (1) ОСНОВНА ІНФОРМАЦІЯ (і) ЗАЯВНИК: (A) ІМ'Я: applied Research Systems ARS Holding N.V, (B) ВУЛИЦЯ: 14 J.B.Cors1raweg (C) МІСТО: Curacao (E) КРАЇНА: Нідерландскі Антільські острови (F) ПОШТОВИЙ КОД: немає (G) ТЕЛЕФОН: 599-9-639300 (Η) ФАКС: 599-9-614129 (іі) НАЗВА ВИНАХОДУ: ІСЕ-інгібуючі пептиди (ііі) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 10 (iv) ПРИДАТНА ДЛЯ КОМП'ЮТЕРА ФОРМА: (A) ФОРМА ПЕРЕДАЧІ: дискета (B) КОМП'ЮТЕР: ІВМ-РС (C) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: PS-DOS/MS-DOS (D) ПРОГРАМА: Patentin Release #1.0, версія #1.30 (ЕРО) (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО SEQ ID NO: 1: (і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА: 19 амінокислот (B) ТИП: амінокислотна (C) ЧИСЛО ЛАНЦЮГІВ: (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: пептид (іх) ПАРАМЕТРИ: (A) КЛЮЧОВЕ ПОЗНАЧЕННЯ: сайт-модифікована (B) ЛОКАЛІЗАЦІЯ: 2 (D) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: зауваження: "Хаа позначає переважно амінокислоту, що вибирається з аспарагінової кислоти і аланіна. Найкращим є Asp", (іх) ПАРАМЕТРИ: (А) КЛЮЧОВЕ ПОЗНАЧЕННЯ: сайт-модифікована (B) ЛОКАЛІЗАЦІЯ: 19 (D) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: зауваження: "Хаа позначає амінокислоту, що вибирається переважно з аспарагінової кислоти і аланіна. Найкращим є Asp" (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 1: Ala Хаа leu Туr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Glu Asp Asn Ala Xaa 1 5 10 15 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО SEQ ID NO: 2 (і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА: 19 амінокислот (B) ТИП: амінокислотна (C) ЧИСЛО ЛАНЦЮГІВ: (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: пептид (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 2: Ala Asp Leu Туr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Glu Asp Asn Ala Asp 1 5 10 15 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО SEQ ID NO: 3 (і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА: 19 амінокислот (B) ТИП: амінокислотна (C) ЧИСЛО ЛАНЦЮГІВ: (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: пептид (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 3 Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Glu Asp Asn Ala Ala 1 5 10 15 (2) ІНФОРМАЦІЯ 0 SEQ ID NO: 4 (і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА: 24 амінокислоти (B) ТИП: амінокислотна (C) ЧИСЛО ЛАНЦЮГІВ: (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: пептид (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 4 Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Glu Asp Asn Ala Asp Ser Lys 1 5 10 15 20 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО SEQ ID NO: 5 (і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА: 24 амінокислоти (B) ТИП: амінокислотна (C) ЧИСЛО ЛАНЦЮГІВ: (В) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: пептид (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 5 Met Ala Leu Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Glu Asp Asn Ala Ala Ser Lys 1 5 10 15 20 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО SEQ ID NO: 6 (і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА: 9 амінокислот (B) ТИП: амінокислотна (C) ЧИСЛО ЛАНЦЮГІВ: (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: пептид (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 6 Glu Gly Glu Asp Asn Ala Asp Ser Lys 1 5 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО SEQ ID NO: 7 (і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА: 13 амінокислот (B) ТИП: амінокислотна (C) ЧИСЛО ЛАНЦЮГІВ: (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: пептид (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 7 Phe Lys Asp Pro His Gly Leu Trp Lys Gly Leu Ser His 1 5 10 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО SEQ ID NO: 8 (і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА: 6 амінокислот (B) ТИП: амінокислотна (C) ЧИСЛО ЛАНЦЮГІВ: (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: пептид (ііі) ГІПОТЕТИЧНА: немає (iv) АНТИЗМІСТОВНА: немає (іх) ПАРАМЕТРИ: (A) КЛЮЧОВЕ ПОЗНАЧЕННЯ: сайт-модифікована (B) ЛОКАЛІЗАЦІЯ: 1 (D) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: зауваження: "Хаа є ацетилом" (іх) ПАРАМЕТРИ: (A) КЛЮЧОВЕ ПОЗНАЧЕННЯ: сайт модифікована (B) ЛОКАЛІЗАЦІЯ: 6 (D) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: зауваження: "Хаа --СНО" (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 8 Хаа Туr Val Ala Asp Хаа 1 5 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО SEQ ID NO: 9 (і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА: 22 нуклеотида (B) ТИП: нуклеїнова кислота (C) ЧИСЛО ЛАНЦЮГІВ: одноланцюгова (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: інша нуклеїнова кислота (А) ОПИС: desc = "олігонуклеотид" (ііі) ГІПОТЕТИЧНА: немає (iv) АНТИЗМІСТОВНА: немає (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 9 AAAAGCCATG GCCGACAAGG ТС 22 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО SEQ ID NO: 10 (і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (А) ДОВЖИНА: 22 нуклеотида (B) ТИП: нуклеїнова кислота (C) ЧИСЛО ЛАНЦЮГІВ: одноланцюгова (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: інша нуклеїнова кислота (А) ОПИС: desc = "олігонуклеотид" (ііі) ГІПОТЕТИЧНА, немає (iv) АНТИЗМІСТОВНА: немає (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO: 10 TСТСТТСАСС CTGCCCACAG AC 22 Список літератури: [1] [1а] Thomberry et al., A novel cysteine protease is required for interleukin-1b processing in monocytes, Nature, 356, 768-774, 1990. [1b] Ceretti et al., Molecular cloning of the interleukin-lp converting enzyme, Science, 256, 97-100, 1992. [2] Cameron et al., Amino acid sequence analysis of human IL-1. Evidence for biochemically distinct forms of IL-1, J. Exp. Med., 162, 790-801, 1985. [3] Mosley et al.. The interleukin-1 receptor binds the human interleukin-1 precursor but not the interleukin-1b precursor, J. Biol. Chem., 262, 2941-2944, 1987. [4] Kostura et al.. Identification of a monocyte specific pre-interleukin-1b convertase activity, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 5227-5231, 1989. [5] Black et al.. Activation of interleukin-1b by a co-induced protease, FEBS Lett., 427, 386-390, 1989. [6] Howard et al., IL-1 converting enzyme requires aspartic acid for processing of, the IL-1b precursor at two distinct sites and does not cleave 31 kDa IL-1a, J. Immunol., 147, 2964-2969, 1991. [7] Griffin et al., Ill Jnt. J. Mass. Spectrom. Ion. Phys., 11, 131-149, 1991. [8] Miura et al.. Induction of apoptosis in fibroblasts by interleukin-1b-converting enzyme, a mammalian homologue of the C. elegans cell death gene ced-3, Cell 75, 653-660, 1993. [9] Dimarello, Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism., Blood, 77, 1627-1652, 1991. [10] Colotta et al., Interleukin-1 type II receptor: a decoy target for IL-1 that is regulated by IL-4, Science, 261, 472475, 1993. [11] Sims et al., lnterleukin-1 signalling occurs exclu-sivery via the type I receptors, Proc. Natl. Acad. USA, 90, 6155-6159, 1993. [12] Colotta et al., Immunol. Today, 15, 562-566, 1994. [13] Hannum et al., Interleukin-1 receptor antagonist activity of a human interleukin-1 inhibitor, Nature, 343, 336340, 1990. [14] Eisenberg et al.. Primary structure and functional expression form complementary DNAof a human interleukin1 receptor antagonist, Nature, 343, 341-346, 1990. [15] Carter et al.. Purification, cloning, expression and biological characterisation of an interleukin-1 receptor antagonist protein, Nature, 344, 633-638, 1990. [16] Muzio et al.. Cloning and characterisation of a new isoform of interleukin-1 (IL-1) receptor antagonist (IL-1 1ra), J. Exp. Med., 182623,1995. [17] Yuan et al.. The С elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interieukin-lpconverting enzyme, Cell., 75, 641-652, 1993. [18] Kumar et al.. Induction of apoptosis by the mouse nedd2 gene, which encodes a protein similar to the product of the C. elegans cell death gene ced-3 and the mammalian inter-leukin-lp-converting enzyme. Genes Dev. 8, 1613-1626, 1994. [19] Wang et al., lch-1, an lce/ced-3-related gene, encodes both positive and negative regulators of programmed cell death, Cell, 78, 739-750, 1994. [20] Femandes-Alnemri et al., CPP-32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell geath protein CDE-3 and mammalian interleukin-1b-converting enzyme, J. Biol Chem., 269, 30761-30764, 1994. [21] Nicholson et al.. Identification and inhibition of ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis, Nature, 376, 37-43, 1995. [22] Tewari et al., Yama/CPP-32p, a mammalian homologue of CED-3, is a CmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polimerase, Cell 81, 801-809, 1995. [23] Faucheu et al., A novel human protease similar to the interleukin-1b-converting enzyme induced apoptosis in trans-fected cells, EMBO J., 14,1914-1922, 1995. [24] Kamens et aI. Identification and characterisation of ICH-2, a novel member of the interleukin-1-converting enzyme family of cysteine proteases, J. Biol. Chem., 270, 15250-15256, 1995. [25] Munday et al.. Molecular cloning and proapoptotic activity of ICE re1-ll and ICE re1-III, members of the ICE/CED-3 family of a cysteine proteases, J. Biol. Chem., 270, 15870-15876, 1995. [26] Fernandes-Alnemri et aI., Mch-2, a new member of the apoptotic CED-3/ICЕ cysteine protease gene family. Cancer Res., 55, 2737-2742, 1995. [27] Duan et al., ICE-LAP3, a novel mammalian homologue of the Caenorhabditis elegans call death protein CED3, is activated during Fas- and TNF-induced apoptosis, J. Biol. Chem., 2271, 35013-35035, 1996. [28] Fernandes-Alnemri et al., Mch-3, a novel human apoptosis cysteine protease highly related to CPP-32, Cancer Res., 55, 6045-6052, 1995. [29] Lippke et al., Identification and characterisation of CPP-32/Mch-2 homologue 1, a novel cysteine protease similar to CPP-32, J. Bio. Chem., 271, 1825-1828, 1996. [30] Duan et al., ICE-LAP6, a novel member of the ICE/Ced-3 gene family, is activated by the cytotoxic Τ cell protease granzyme В., J. Biol. Chem., in press 1996. [31] Muzio et al., FLICE a novel FADD-homologous ICE/CED-3-like protease, is recruited to the CD95(Fas/Apo-l) Death-Inducting Signalling Complex, Cell., 85, 817-827, 1996. [32] Boldin et al.. Involvement of MACH, a novel MORT-1/FADD-interacting protease, in Fas/Apo-1- and TNF receptor-induced cell death, Cell., 85, 803-815, 1996.