Спосіб отримання поліпептиду, що викликає інтерес, і поліпептид

1. Способ получения представляющего инте рес полипептида путем экспрессии и последующе го ферментативного расщепления слитого белка,, включающий - трансформацию хозяйской клетки рекомбинантным вектором экспрессии, содержащим фрагмент гибридной ДНК, кодирующий слитый белок с об щей формулой А-Р-В, где А - либо метионин, ли бо любая аминокислотная последовательность, В - любая аминокислотная последовательность, Р переходная область, включающая или образую щая при объединении с В сайт расщепления спе цифической протеазой, не содержащийся в полу чаемом полипептиде, - культивирование трансформантов в среде, обес печивающей экспрессию рекомбинантного продук та, - обработку его протеазой, сайт расщепления ко торой встроен в аминокислотную последователь ность слитого белка, и - изолирование части, отвечающей представляю щему интерес полипептиду, отличающийся тем, что сайт расщепления специфической протеазой в слитом белке представлен аминокислотной по следовательностью, выбранной из группы, кото рая включает Pro - Ala - Pro - Ser - Pro, Pro - Pro' Ser - Pro, Pro - Arg - Pro - Pro.'. Ala - Pro, Pro - Pro.', - Thr - Pro, Ala - Pro - Arg - Pro - Pro.', Thr - Pro, - Pro - Ala - Pro - Arg - Pro - Pro', Thr - Pro, а для обработки экспрессированного слитого белка используют ІдА-протеазу при весовом соотношении фермента к субстрату от 1:1 до 100:1 и рН от 6,5 до 8,5 2. Способ по п 1, отличающийся тем, что область кодируемого слитого белка представлена полипептидом с высоким сродством к специфиче ским веществам, применяемым при очистке. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что область А кодируемого слитого белка представ лена частью последовательности ргалактозидэзы, а хозяйской клеткой является E.coli. 4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающий ся тем, что для расщеплений слитого белка при меняют ІдА-протеазу из патогенных видов бакте рий рода Neissena, предпочтительно N.gonorrbdae и N. meningitis 5. Способ по любому из пп. 1-3, отличающий ся тем, что для расщепления слитого белка при меняют ІдА-протеазу из представителей рода Haemophilus, предпочтительно H.tnfluencae и Н. Aigypticus. 6. Способ по любому из лп. 1-3, отличающийся тем, что для расщепления слитого белка применяют ІдА-протеазу из непатогенного рекомбинантного штамма-продуцента. 7 Способ по любому из лп. 4-6, отличающийся тем, что для расщепления слитого белка применяют ІдА-протеазу в иммобилизованной форме. 8. Способ по любому из лп. 4-6, отличающийся тем, что расщепляют слитый белок, находящийся как в растворимой, так и в нерастворимой форме 9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что рас щепляют слитый белок, находящийся в виде не растворимых тел включения 10. Полипептид, отличающийся тем, что он по лучен по способу, описанному в л 1 и представ ляет собой G-CSF свободный от N-концевого ос татка МЄТИОНЧІ-d. о ю со СО СМ 27365 Изобретение относится к способу для последовательно специфического расщепления полученных биотехнологией протеинов с применением ІдА-протеаз (называемых также игазами) и особенно к способу для получения рекомбинантных протеинов или пептидов в прокариотах и к последующему удалению N-концевой последовательности. Получение протеинов методом биотехнологии осуществляют с применением микроорганизмов, которые легко культивируются и позволяют простым путем получать протеин. Подходящими микроорганизмами являются для этого например грамотрицательиая бактерия Eschenchia colt, грамположительная бактерия Streptococcus carnocus и хлебопекарные дрожжи Sacharomyces cerevisiae. Однако экспрессия аутентичных чужеродных генов в таких микроорганизмах часто имеет недостатки. Например в Е. co!i обусловленный трансляцией аминоконцевой остаток метионина природных протеинов протеаз в большинстве случаев эффективно отщепляется. Однако при чужеродных белках это отщепление первого остатка метионина происходит в большинстве случаев только параллельно. Поэтому подходящим методом является получение таких протеинов с определенным аминоконцом, их образование сначала в форме слившихся протеинов и затем их отщепление посредством определенной последовательноспецифической протеазы Кроме того, в противоположность аутентичным протеинам такие слившиеся протеины имеют то преимущество, что они укрупняются в клетке микроорганизма и образуют плотные осажденные тела ("Inclusion Bodies"), которые с небольшим усилием можно отделять от других частей клетки и тем самым облегчать выделение и очистку желаемого протеина. С другой стороны, протеиныносители, которые при помощи способов генной инженерии прежде всего спиваются с собственно желательным протеином, придают слившемуся партнеру особую устойчивость против неспецифического протеолитического расщепления; проблема расщепления полипептидов, которые считаются чужеродными, относится особенно к биотехнологическому получению меньших пептидов. Другие протеины-носители снова позволяют распределять желательные протеины в определенных отделениях клеток, из которых их можно особенно легко очищать, где они особенно стабильны и/или где они доступны для испытательных целей. Наконец, протеины-носители могут иметь также специальные свойства, которые позволяют проводить эффективную очистку, например хроматографией сродства. Для многих целей применения предпочитают слившиеся протеины, которые несут протеин-носитель на аминоконце и желательный протеин на карбоксильном конце. Но в определенных случаях может быть также желательным обратный вариант или связывание желательного протеина с двумя партнерами слияния. Далее, может быть выгодным обратное повторение желательного протеина в пределах слияния. Для получения желательного протеина в свободной форме из подобного слияния необходимо отщепление ковалентно связанных партне ров слияния друг от друга. В принципе, этого можно достигнуть при помощи химических или биохимических (ферментативных) способов. Однако при этом в большинстве случаев имеет место ограниченная специфичность имеющихся до сих пор способов; так как для получения желательного протеина важно, чтобы подобное расщепление происходило в последовательности между партнерами слияния, т.е. в переходной области, но ни в коем случае дополнительно внутри самого желательного протеина. Поэтому расщепление партнеров слияния должно быть высокоспецифичным. Применяемыми до сих пор химическими способами для последовательно специфического разделения спившихся протеинов являются, например, расщепление бромцианом на аминокислоте метионина внутри протеина и расщепление между аминокислотами Asp : Pro в кислой среде с применением муравьиной кислоты. Но эти способы пригодны только в том случае, если специфическое место расщепления в желательном протеине, независимо от переходной области к партнеру слияния, не повторяется второй раз. Однако, в общем, биохимические способы расщепления следует предпочитать химическим способам, так как первые в большинстве случаев возможно осуществлять при физиологических или по крайней мере при химически мягких условиях реакции, которые не причиняют ущерба желательному протеину. Биохимические способы для расщепления слившихся протеинов основываются на применении по возможности специфических протеаз. Например, трипсин расщепляют следующие за аминокислотами аргинин или лизин пептидные связи внутри протеинов. Повышение специфичности может быть достигнуто предшествующей химической модификацией аминокислоты LYS, в результате чего специфическое распознавание можно ограничить аминокислотой аргинин. Другой примененной в биотехнологии протеазой является Клострипаин; этот фермент расщепляет пептидные связи между аминокислотой аргинин и любой следующий за ним аминокислотой . Обзор о применяемых до сих пор ферментативных способах для расщепления слившихся протеинов был составлен Г.А.О.Ма (В [D.M. clover, Е]: DNA cloning III, 1RL PRESS Оксфорд и Вашингтон С, 1987). Ферментативные способы расщепления ограничивают также в результате того, что специфическая для точки расщеппения аминокислота (аминокислоту) могут встречаться одновременно также в самом желательном протеине. Для этого для биохимического расщепления слияний протеинов пригодны особенно ферменты, которые для расщепления распознают не только аминокислоту, но и последовательность аминокислот; так как вероятность того, что определенная последовательность аминокислот кроме в точке расщепления между партнерами слияния встречается еще раз в самом желательном протеине, тем незначительнее, чем больше число аминокислот, необходимых для распознавания и расщеплений последовательности расщепления. Протеаэы, которые очень специфически перерезают определенный протеин, известны. Хотя большинство таких селективных протеаз (которые встречаются например в комплементарной систе 27365 ме и в системе свертывания крови человека) расщепляет в определенной точке субстрата; однако при переносе соответствующей области расщепления в другой протеин (например, слившийся протеин) подобные протеаэы, как правило, больше не способны расщеплять. Причины для этого разнообразные и заключаются, например, в распознавании определенной вторичной или третичной структуры в субстрате протеазой или в недоступности точки расщепления в слившихся протеинах. Список последовательноспецифических протеаз, которые применяются до сих пор для расщепления слившихся протеинов, содержит в настоящее время фактор Ха. Эта протеаза перерезает специфически последовательность расщепления Не Glu -Gly - Arg X, причем, показывает точку расщепления и X показывает любую аминокислоту. Однако оказывается, что и эту протеазу нельзя перименять универсально для расщепления слившихся протеинов, которые несут соответствующую последовательность расщепления в своей переходной области; часто такие субстраты (т.е. слившиеся протеины, которые содержат желательный протеин, ковалентно связанный с протеином-носителем) вообще не расщепляют, расщепляют только в очень небольшой степени или только в растворимой форме. Особенно значительным является эффективное расщепление слившихся протеинов при получении рекомбинантных протеинов в прокарионтных организмах. А именно, там требуется клонирование ДНК-последовательности, которая содержит AUG в качестве начального кодона перед начало собственной ДНК-последовательное-, ти. Как результат этого в прокарионтах, как например Е соїї, экспримируют рекомбинантный протеин, который содержит остаток метионина в положении -1 аминокислоты. Однако во многих случаях требуется получение не содержащих метионина в положении I рекомбинантных протеинов. Получение таких протеинов их прокарионтое можно осуществлять например через метионин-слецифическую пептидазу, которая отщепляет N-концевой метионин. Однако этот способ связан с очень большими затратами, так как отщепление можно проверив только через последовательность протеинов. Кроме того, разделение содержащего метионин в положении -1 и не содержащего метирнин протеина по причине почти идентичного молекулярного веса является очень трудным и тем самым может быть достигнуто только неполностью. РСТ - заявка W 084/02351 раскрывает отщепление N-концевых аминокислот от слившегося протеина. При этом многие аминокислоты протеина от N-конца благодаря постепенному отщеплению экаопептидазой, предпочтительно лейцинпептидазой, могут быть удалены до последовательности X - Pro. Последовательность X - Pro отщепляют из этого продукта или в две стадии или в 1 стадию реакции с применением постпролин-дилептидил-аминопептидазы ( ЕС 3.4.14). Однако этот способ имеет тот недостаток, что, обусловленный постепенным отщеплением аминокислот от N-конца протеина, должен образовываться не единый продукт, а всегда смесь продуктов, которая наряду с желательным продуктом содержит как неполностью так и в значительном количестве отщепленные протеины. Другой способ для ферментативного расщепления слившегося протеина известен из европейского патента 0020290. При этом способе фермент Коллагеназы применяют для отщепления слившейся части протеина с определенной последовательностью распознавания. После этого можно удалять затем другие аминокислоты слившейся части в результате дальнейшей ферментативной обработки. Однако было установлено, что Коллагеназа и так же другие эндопептидазы имеют лишь небольшую специфичность, (см. Biochtm Biophys Acta 271 (1972), 133-144) Кроме того, Коплагеназы активны только при протеинах, которые имеют специфическую пространственную структуРУ-Применение уже упомянутого фактора Ха для отщепления N-концевой части слияния протеинов известно. Однако и этот способ наряду с уже упомянутыми проблемами эффективности расщепления имеет другие недостатки, а именно такого типа, что, по всей возможности, распознаются и расщепляются также внутренние последовательности протеина. Кроме того, следует выделять фактор Ха из сыворотки крови крупного рогатого скота, вследствие чего при отщеплении применяемых в терапии протеинов требуется связанная с затратами очистка и аналитика, чтобы обнаруживать возможные имеющиеся факторы патогенности или вирусы Различные виды патогенных бактерий (например, рода Neisseria, как Neisseria gonorrhoea и Neisseria meningititis или рода Haernophilus, как Haemophtlus influenzae и Haemophilias aegypticus, которые развиваются на слизистой оболочке человека, выделяются между собой своей последовательностью, близкой к родственным протеазам, которые специфичны для IgAI человека и поэтому, резюмируя, обозначаются как lgA-протеазы или игазы. Иммуноглобулин IgAI является важной компонентой секреторного иммунного ответа, который должен защищать против инфекций таких патогенных организмов (Обзор: Komfeld и Plant, Rev, Infect Dis 3 (1981), 521-534). Наряду с этим igAпротеаза расщепляет также свой собственный протеин-предвестник в результате аутопротеолиза. Образование lgA-протеазы из Neissena gonorrhoeal MS1I в аутентичном штамме бактерий и в грамотрицатепьных клетках хозяина уже было подробно описано (патент ФРГ 3622221.6). ІдА-протеаза расщепляет следующие последовательности распознавания, как например, описано у Pohlner (Nature 325) (1987), 458-462): 1. Pro - Ala - Pro1 Ser - Pro „ 2. Pro - Pro1. . Se - Pro 3. Pro - Pro'. . Ala - Pro 4. Pro - Pro'. Thr Pro При этом символ. . обозначает соответственно точку разреза ІдА-протеазой. Клонирование lgA-протеазы описано выше например у Pohlner и ДР-, 1987. Поэтому задачей настоящего изобретения была разработка усовершенствованного способа для биохимического (ферментативного) расщепления слившихся протеинов, чтобы полученные методом генной технологии слившиеся протеины, 27365 состоящие из любых партнеров слияния и специфической последовательности расщепления в переходной области, можно было применять как субстрат для получения желательных протеинов по возможности с высоким выходом и со способностью к воспроизведению. Эту задачу решали методом генной технологии путем введения точки распознавания или последовательности расщепления Pro' X - Pro в переходную область слившихся протеинов и путем специфического расщепления этой последовательности расщепления lgA-протеазой на обозначенной символом .1. точке расщепления, причем X обозначает преимущественно аминокислоты Ser, Thr Ala и особенно предпочтительно Ser ипи Thr, но может обозначать также другие аминокислоты. Поэтому предметом настоящего изобретения является способ для ферментативного расщепления слившихся протеинов и для получения желательных частей этих слившихся протеинов, который отличается тем, что (1) переходную область, в которой связаны друг с другом две части слившегося протеина, модифицируют при помощи геннотехнических средств таким образом, что в этой переходной области образуется по меньшей мере одна точка распознавания lgA-протеазы с последовательностью аминокислот Y - Pro*. .X - Pro, причем X может быть любой аминокислотой и Y - одной или несколькими любыми аминокислотами, (2) получающийся из стадии (I) слившийся протеин расщепляют lgA-протеазой на обозначенном символом.', положении точки распознавания и (3) после расщепления получают одну часть или несколько желательных частей слившегося протеина. Под понятием "lgA-протеазы" по настоящему изобретению подпадают протеазы, которые специфически расщепляют fgA, которые описаны, например, в Rev. Infekr. Dis 3 (1981 521-534). Но пригодны так же и рекомбинантные lgA-протеазы, которые описаны например, в заявке на патент ФРГ № 3622221, Ргос. Nat». Acad Sci США 79 (1982) 7881 - 7885, Ргос. Natl. Acad Sci США ВО (1983) 2681 - 2685, Nature 325 (1987) 458 - 462 и EMBO Jour 3 (1984) 1595 -1601. При способе по изобретению происходит модификация переходной области слившихся протеинов преимущественно таким образом, что в переходную область слившегося протеина встраивают последовательности нуклеотидов, которые кодируют точку распознавания lgA-протеазы или часть ее, причем эти последовательности нуклеотидов встраивают впереди или/и позади одного или нескольких кодирующих желательные части слияния протеинов ДНК-отрезков. Для этой цели применяют преимущественно последовательности нуклеотидов, которые были синтезированы химическим путем. Неожиданно было установлено, что способ по изобретению особенно пригоден так же ДЛИ расщепления слившихся протеинов, которые первоначально (т.е. перед модификацией переходной области) не имеют никакой природной точки распознавания lgA-протеазы. Точка распознавания lgA-протеаэы для способа изобретения имеет согласованную последовательность аминокислоты Y - Pro1. X - Pro. При этом X может обозначать любую аминокислоту и Y может обозначать одну или несколько любых аминокислот Преимущественно X обозначает серии, треонин или аланин, особенно преимущественно серии или треонин. Y обозначает преимущественно многие аминокислоты, которые оканчиваются последовательностью Pro, Pro - Ala, Arg Pro, Pro - Arg - Pro, Ala - Pro - Arg - Pro или Pro Ala - Pro - Arg - Pro Поэтому способ по изобретению раскрывает, что точку распознавания lgA-протеазы по меньшей мере с согласованной последовательностью расщепления Pro.' X - Pro можно вводить в переходную область любого слившегося протеина, например, между протеином-носителем и желательным протеином и использовать для отщепления и получения желательного протеина благодаря ІдА-протеазе. При этом в последовательности расщепления Рго.'.Х - Pro применяют преимущественно аминокислоты Ser, Ala или Thr в положении X. Для дальнейшей оптимизации расщепления в указанной точке можно предвключать к последовательности расщепления другие специальные аминокислоты, особенно аминокислоту Pro. Особенно предпочитают последовательность аминокислот a) Pro - Ala - Pro Л Ser - Pro, b) Pro - Pro .'. Ser - Pro, c) Pro - Arg - Pro - Pro Л Ala - Pro, d) Pro- Pro .'.Thr-Pro, e) AIA - Pro - Arg - Pro - Pro .'. Thr - Pro или f) Pro - AIA - Pro - Arg - Pro - Pro .'. Thr - Pro. При применении способа по изобретению к расщеплению слившихся протеинов, в которых желательный протеин включен после протеинаносителя, образуется после расщепления igA-npoтеазой протеин, зминоконец которого охарактеризован последовательностью X - Pro. Эта последовательность-как часть желательного протеина может быть выгодной, невыгодной или же незначительной. Выгодна эта последовательность, в общем, тогда, когда полученный методом генной технологии желательный протеин и в своей природной форме содержит на своем аминоконце обе соответствующие аминокислоты X - Pro. Охарактеризованные аминоконцевым X - Pro протеины, которые имеют важное значение в биотехнологии, встречаются в природе. Способ по изобретению, в противоположность всем другим известным способам для расщепления слияний протеинов, имеет те преимущества, что его неожиданно можно применять универсально к слившимся протеинам, которые в своей переходной области несут указанную последовательность расщепления и что его можно применять также к нерастворимым, растворимым, соединенным мембраной и связанным клеткой слияниям протеинов. Кроме того, в качестве особого преимущества способ дает возможность расщеплять слившиеся протеины или слияния протеинов в Аорме осажденных, теп такого рода, как они получаются в микроорганизмах и где их как таковые легко обогащать. Другое преимущество способа состоит а том, что примененный расщеп 27365 ляющий фермент, игазу, можно получать с небольшими затратами из питательных сред нелатогенных бактерий Встраивание последовательности расщепления для !gas в переходную область слияния протеинов осуществляют средствами генной технологии Так, например, последовательность нуклеотидов или нуклеогидную последовательность, которая кодирует последовательность расщепления или часть его. можно синтезировать химическим путем и встраивать при помощи известных средств генной технологии между ДНК-отрезками для протеина - носителя и желательного протеина Соответственно можно встраивать также природную последовательность нуклеотидов, которая кодирует подходящую последовательность расщепления или часть ее Кодирующий слияние протеинов ген ставится преимущественно под контроль надлежащих (преимущественно индуцируемых) сигналов экспрессии, так что становится возможным соответствующее требованиям производство слившихся протеинов В качестве клеток-хозяев для производства слияний протеинов можно применять прокарионтные или эукарионтные (как растительные, так и животные) клетки, но возможны также не содержащие клеток системы Примененные при этом протеины-носители могут иметь любые функции, в зависимости от того, какие свойства они должны придавать слиянию протеинов, как определенные функции переноса, функции, которые улучшают очистку слияния протеинов или их устойчивость и многое другое Предпочтительные протеины-носители объяснены ниже Соответствующее способу по изобретению расщепление слияний протеинов происходит преимущественно при помощи [gas, которую образуют из сверхпродуцирующего непатогенного штамма бактерий и получают очисткой из надосадочных жидкостей культуры (см. например патент ФРГ N8 3622221) Способ по изобретению можно использовать как для получения, так и для аналитических целей Способ служит для получений методом биотехнологии важных протеинов, которые могут находить применение например в медицине, при научном исследовании, при защите окружающей среды или при промышленных процессах или продуктах При аналитическом применении способ в сочетании с подходящими системами экспрессии может служить, например, для стандартного исследования слияний генов. Предпочтительный вариант осуществления способа по изобретению для ферментативного расщепления слившихся протеинов и для получения желательных частей этих слившихся протеинов, отличается тем, что (1) трансформируют клетку с рекомбинантной ДНК или с рекомбинантным носителем, при чем ДНК или носитель содержит по меньшей мере копию гена, кодирующего слившийся протеин, ко торый содержит по меньшей мере точку распозна вания lgA-протеазы в переходной области, (2) культивируют трансформированную клетку в подходящей среде, (3) доводят до экспрессии кодирующий слившийся протеин ген в трансформированной клетке, (4) расщепляют слившийся протеин при по мощи lgA-протеазы и (5) выделяют одну или несколько желатель ных частей слившегося протеина При этом обработку слившегося протеина lgA-протеазой в среде (питательном бульоне) можно проводить после растворения клеток или/и после частичного или полного отделения клеточных протеинов Далее, предпочтительно для обработки спившегося протеина, преимущественно прокарионтного продукта экспрессии, иммобипизировать ІдА-протеазу известным специалисту методом, например, как описано в европейском патенте В 0141223 или в европейском патенте В 0141224 Особенно предпочтительным применением способа по изобретению является получение рекомбинатных протеинов или пептидов без N-KOHцевого остатка метионина из слившихся протеинов или пептидов с последовательностью аминокислот Met - Y - Pro ' X - Pro - А, где X обозначает любую аминокислоту, преимущественно Thr, Ala или Ser, Y обозначает одну или несколько любых аминокислот, которая преимущественно, если X обозначает Thr или Afa, оканчивается Pro, или если X обозначает Ser, оканчивается последовательностью Pro - Ala или Pro - Pro. и А обозначает любую последовательность аминокислот При этом расщепляют слившийся протеин или пептид при помощи Iga протеазы и получают продукт расщепления с последовательностью аминокислот X - Pro - А Например, этот способ для получения рекомбинантных протеинов из прокарионтных клеток без N-концевого остатка метионина включает следующие стадии (1) трансформация прокарионтной клетки с геном, который кодирует протеин или пептид с последовательностью аминокислот Met - Y - Pro ' X - Pro - А, где X, Y и А имеют вышеназванные значения, (2) культивирование трансформированной клетки в подходящей среде и экспимирование трансформированного гена, (3) расщепление продукта экспрессии из трансформированной клетки с последователь ностью аминокислот Met - Y - Pro'. X - Pro - А igA-протеэзой и (4) выделение получающегося продукта расщепления с последовательностью аминокис лот X - Pro - А без N-концевого остатка метионина Благодаря способу по изобретению неожиданно можно получать с высоким выходом и хорошей специфичностью в одной стадии протеины без N-концевого остатка метионина, которые имеют N-концевую последовательность X - Pro, причем X обозначает преимущественно Thr. Ala или Ser Часть носителя Y слившегося протеина обозначает последовательность аминокислот по меньшей мере 1, преимущественно до 100, особенно преимущественно от 1 до 50 аминокислот, которая оканчивается распознанной ІдА-протеазой последовательностью расщепления Если X обозначает аминокислоту серии, то Y оканчивается преимущественно последовательностью Pro Ala или Pro Если X обозначает Thr или Ala, то Y 27365 оканчивается преимущественно Pro, особенно преимущественно Arg - Аго, Pro - Arg - Pro или Ala - Pro - Arg - Pro. В особенности предпочтительном варианте осуществления Y обозначает по меньшей мере 5 аминокислот, которые оканчиваются последовательностью Pro - Ala - Pro - Arg - Pro. Однако для способа по изобретению применяются все распознанные (д А -протеазой точки расщепления. Часть носителя Y может содержать еще другие любые аминокислоты, преимущественно до 100, особенно преимущественно до 50 аминокислот. Однако для этого применяют преимущественно такие последовательности аминокислот, которые на уровне ДНК улучшают экспрессию протеина Met - Y - Pro .'. X - Pro - А или/и на уровне аминокислоты облегчают ее очистку из клетки. Экспрессию протеина Met - Y - Pro .'. X - Pro - А на уровне ДНК можно улучшать, например, слиянием с фрагментами гена р-галахтоэидазы, т.е. часть носителя Y включает часть р-галактозидазы-протеина. Известны специалисту и другие возможности, чтобы повышать экспрессию про теина Met - Y - Pro4. . X - Pro - А. Слиянием с дру гими полипептидами, особенно с высокозаряжен ными (например поли (Lys, Arg)) или со связываю щими определенные вещества с высоким сродст вом (например, стрептавидин) полипептидами или протеинами можно облегчать очистку и отделение продукта экспрессии (см. например европейский патент А 0039626, европейский патент А 0306610). Далее, предметом настоящего изобретения является слившийся протеин, который содержит много частей полипептида и который, встроенный по меньшей мере в переходной области между различными частями полипептида, имеет одну или несколько точек распознавания lgA-протеазы с последовательностью аминокислот Pro .'. X Pro, причем X обозначает любую аминокислоту, однако преимущественно Ser, Thr или Ala. Особенно предпочтительно точка распознавания имеет последовательность аминокислот (a) Pro - Ala - Pro .'. Ser - Pro, (fa) Pro - Pro Л Ser - Pro, (c) Pro - Arg - Pro - Pro Л Aia - Pro, (d) Pro -Pro Л The - Pro, (e) Ala - Pro - Arg - Pro - Pro'. . Thr - Pro или (f) Pro - Ala - Pro - Arg - Pro - Pro .'.The - Pro, причем Л показывает точку расщепления. Настоящее изобретения включает также, в частности, протеин или пептид с последовательностью аминокислот Met - Y - Pro'. . X - Pro - А, где X обозначает преимущественно The, Ala или Ser, Y обозначает одну или несколько любых аминокислот, и преимущественно, если X обозначает The или Ala, оканчивается Pro, или, если X обозначает Ser, оканчивается последовательностью Pro - Ala или Pro, и А обозначает любую последовательность аминокислот. Подобный протеин или пептид зкспримируют по способу изобретения трансформацией прокарионтной клетки с рекомбинантным носителем, который содержит по меньшей мере копию гена, который кодирует подобный протеин или пептид. Последовательность А может обозначать любую последовательность аминокислот. Однако целесообразно, чтобы внутри этой последова тельности аминокислот не было другой точки расщепления для igA-протеазы. Далее, предметом настоящего изобретения является рекомбинантная ДНК> которая кодирует протеин или пептид по изобретению и где по меньшей мере в переходной области слившегося протеина встроены одна или несколько точек распознавания lga-протеаэы или последовательностей расщепления. Рекомбинантную ДНК по изобретению можно получать известным специалисту в области молекулярной биологии способом. Обычно для этого носитель, который содержит кодирующую последовательность аминокислот А ДНК-последовательность, расщепляют ограничительными эндонуклеазами в области 5' - конца этого гена и повторно перевязывают олигонуклеотидами, которые содержат желательную последовательность. При этом опигонуклеотид должен содержать последовательность, которая кодирует точку расщепления IgA-протеазы или часть ее. Далее, предметом изобретения является также рекомбинантный носитель, который содержит по меньшей мере копию рекомбинантной ДНК по изобретению. Подходящие для экспрессии протеина в прокарионтных организмах основные носители известны специалисту- Целесообразным носителем является такой носитель, который обеспечивает высокую экспрессию рекомбинантной ДНК по изобретению. Рекомбинантная ДНК находится преимущественно под контролем индуцируемого сигнала экспрессии {напр. X, tac, lac, или trp просмотр). Носитель по изобретению может быть как внехромосомным (напр, плазмид), так и интегрированным (напр, бактериофак ламбда) в геноме организма-хозяина. Преимущественно носитель по изобретению представляет плазмид. Носители, которые пригодны соответственно для экспрессии гена в определенном организме-хозяине, известны специалисту в области молекулярной биологии. Речь может идти об эукарионтном, но преимущественно о прокарионтном носителе. Примерами носителей, пригодных для экспрессии ДНК по изобретению в прокарионтах, являются имеющиеся в продаже риС и PuR-носйтели. Другим предметом изобретения является клетка, преимущественно прокарионтная клетка, особенно преимущественно E.coii клетка, которая трансформирована с рекомбинантной ДНК по изобретению или/и с рекомбинантным носителем по изобретению. Примерами для протеинов, которые имеютN-концевую последовательность X - Pro, причем X обозначает Thr, Ala или Ser, и которые можно получать по способу изобретения в одной стадии, являются эритропоэтин человека, ( р- цепь Т-клеточного рецептора человека и особенно стимулирующий гранулоциты фактор человека (G - CSF). G - CSF синтезируют как ламфокин активированных моноцитов, макрофагов, а также ряда других клеточных линий. Лимфокины участвуют в созревании клеток иммунной системы или системы клеток крови. Они стимулируют созревание основных клеток костного мозга до раздифференцированных 27365 клеток Так, например, G - CSF индуцирует образование нейтрофилена и гранулоцитов. Так как G - CSF может значительно повышать популяцию неитрофильных клеток в течение короткого срока, для G - CSF получаются широкие возможности применения в области терапии Так, G - CSF можно было бы применять например после химиотерапии при раке, при которой разрушаются клетки иммунной системы Далее, G - CSF можно было бы применять при пересадках костного мозга, при тяжелых ожоговых ранах, при обусловленных слабым иммунитетом враждебных инфекциях и при лейкемии G - CSF представляет секреторную молекулу протеина. Поэтому первичный продукт трансплантации содержит N-концевую последовательность сигналов, которая при секреции отщепляется, так что последовательность зрелого G - CSF начинается с аминокислот Thr (+1) - Pro (+2) (положения аминокислот +1 и +2). Про продуцировании G - CSF в прокарионтах этот сигнальный пептид расщепляется только плохо или совсем не расщепляется, так что для получения G - CSF без сигнальной последовательности из прокарионтов необходимо клонировать AUC (Met) в качестве инициирующего кодона перед началом кодирующей зрелый G - CSF последовательности ДНК, которая начинается на уровне протеина с Т (+1) Pro (+2). В результате этого в прокарионтах, как E.coli, экспримируют G - CSF, который содержит метионин в I - положении аминокислоты. По способу изобретения можно простым путем получать не содержащий метионина в I - положении аминокислоты G - CSF из прокарионтов, который начинается с аминокислот Thr (+1) - Pro (+2). Это происходит в результате того, что получают производное G - CSFne прокарионтов, которое в положении +1 и +2 последовательности аминокислот содержит аминокислоты Thr (+1) Pro (+2) и перед этим, начиная с положения - I последовательности аминокислот, содержит такую последовательность аминокислот, которая распознается ІдА-протеазой и может отщепляться от последовательности аминокислот С - С Г, которая начинается с Thr (+1) - Pro (+2). В гредпочтительном варианте осуществления производное содержит в положении -1 и -2 по Pro, в положении -3 до положения I - последовательность аминокислот Агр - Pro - Pro, в положении 4 - до -1 последовательность аминокислот Pro - Aig - Pro - Pro или в положении -5 до положения -1 последовательность аминокислот Ala Pro -Arg- Pro -Pro. В особенно предпочтительном варианте осущестсвления производное содержит в положении -6 до положения -1 последовательность аминокислот -6 -5 -4 -3 -2 -1 Pro - Ala Pro - Arg - Pro - Pro Под G - CSF в смысле изобретения понимают, конечно, существующий С - GSF, последовательность которого раскрыта, например, в Science 232 (1986) 61, а также образованные от него производные со стимулирующей гранулоциты активностью, у которых последовательности аминокислот начинаются с X (+1) - Pro (+2). X обозна чает Thr, Ser или Ala, особенно предпочтительно The G - CSF производное по изобретению после экспрессии в прокарионтах можно расщеплять обработкой lgA-лротеаэой между положением +1 и -1 (между Thr (+1) и Pro (-1). Тем самым в результате единственной стадии гидролиза 'получают не содержащий метионина в положении -1 G - CSF, последовательность аминокислот которого на Nконце начинается с аминокислот Thr (+T) - Pro (-2) встречающегося в природе G - CSF. При экспрессии G - CSF в прокарионтах образуются труднорастворимые агрегаты (refractie bodies), которые неактивны. Прежде чем применять протеи, например для терапевтических целей, его следует перевести в его активную форму При известных специалисту способах (ср. например европейский патент А 0219874, европейский патент А 0114506, WO 84/03711 сначала осуществляют растворение добавкой денатурирующих средств, к которому присоединяются ренатурирование и в случае необходимости дальнейшие стадии очистки. Обработку протеина по изобретению ІдА-протеазой можно проводить перед растворением, после растворения или лишь после ренатурирования В случае, если обработка igA-npoтеаэой должна проаодиться непосредственно после растворения, следует перед добавкой IgA-npoтеазы отделять растворитель (например гидрохлорид гуанидина или мочевину) диапизом. Однако обработку lgA-протеаэой проводят преимущественно после ренатурирования, так как в этом случае выходы G - CSF особенно высокие. Условия для обработки G - CSF ипи другого отщепляемого протеина ІдА-протеазой сами по себе не являются критическими. Однако предпочтительно применять при этом G - CSF (или другой протеин) относительно, lgA-протеэзы в весовом отношении 1:1 до 100.1. Превращение происходит предпочтительно в буферном водном растворе с рН от 6,5 до 8,5. Концентрация буферного раствора пежит преимущественно в области между 50 и 300 ммол/л, в случае необходимости при добавке 20-100 ммоп/л хлористого натрия. Преимущественно расщепление происходит при комнатной температуре свыше 20-60 минут. После растворения, ренатурирования и расщепления lgA-протеаэой полученный таким путем продукт расщепления очищают преимущественно через ионообменник и крупное фракционирование. Загрязнение полученного таким путем и не содержащего метионина в положении -t G - CSF другими протеинами составляет ниже 0,1%, преимущественно ниже 10 3%. Следовательно, не содержащий метионина в положении -1 G - CSF расщеплением ІдА-протеазой можно отделять или очищать практически количественно от содержащего метионин слитого протеина. По способу изобретения можно получать рекомбинантный G - CSF из прокарионтов, который менее чем на 0,1%, преимущественно менее чем на 10"3% загрязнен другими протеинами и количественно не содержит G - CSF из прокарионтов, который в положении -I содержит метионин. Предметом изобретения является также лекарственное средство на основе полученного по 27365 способу изобретения G - CSF из прокарионтов в качестве активного вещества, в случае необходимости вместе с обычными фармацевтическими веществами-носителями, наполнителями и вспомогательными веществами. Такое лекарственное средство особенно пригодно для лечений, при которых следует стимулировать образование гранулоцитов, особенно нейтрофилов Фармацевтические препараты по изобретению применяются преимущественно как растворы для инъекций и вливаний. Это можно осуществлять в результате того, что имеется в распоряжении уже готовый для впрыскивания раствор, который содержит состав по изобретению. Однако возможно также использование фармацевтических препаратов в форме лиофилизатов. Последние образуются при помощи известных, подходящих для целей инъекции средств или растворов. В качестве среды для инъекции применяют преимущественно воду, которая содержит обычные в растворах для инъекций добавки, как стабилизаторы, агенты растворения.буферные растворы и изотонические добавки, например, физиологический раствор хлористого натрия. Подобными добавками являются, например, маннит, буферный раствор тартрата или цитрата, этанол, комплексообразователь, как например этилендиаминтетрауксусная кислота и ее нетоксичные соли, а также высокомолекулярные полимеры, как жидкая окись полиэтилена для регулирования вязкости. Жидкие вещества-носители для инъекционных растворов должны быть стерильными и разливаются преимущественно в ампулы. Наконец, настоящее изобретение включает также применение не содержащего метионина в положении -I, G - CSF из прокарионтов для получения фармацевтических препаратов по изобретению. Для того случая, когда при расщеплении любого слитого протеина способом по изобретению в качестве образующегося продукта получают протеин X - Pro - А (причем X обозначает любую аминокислоту и А обозначает любую последовательность аминокислот), который однако на своем аминоконце несет нежелательный дипептид X Pro, тогда можно отделять этот нежелательный дипептид как часть способа по изобретению дальнейшей обрабтокой дипептидиламинопептидазами (ДРАР). Дипептидиламинопептидазы находили до сих пор у ряда микроорганизмов, насекомых, амфибий и в различных тканях человека. Они служат например для постепенной химизированной переработки протеинов-предвестников и имеют частично ярко выраженную специфичность для аминоконцевого расщепления дипептида X - Pro (X Pro - ДРАРазы; G. Kreil, Trendsin Biochemical Sciences 15, 23 - 26, 1990) Поэтому комбинацией способа по изобретению игазы и X - Pro - ДРАР можно получать желательные протеины с любыми аминоконцевыми кислотами Теперь при помощи вышеописанной комбинации игазы и X - Pro - ДРАР удается получать также протеины с другой N-концевай последовательностью аминокислот из прокарионтов в положении -I без метионина. Для этого сначала получают слитый протеин, который имеет последовательность аминокислот Met - Y - Pro .'. X - Pro - А, причем теперь в этом случае последовательность аминокислот А без обоих N-концевых аминокислот X - Pro представляет желательную часть экспримируемого протеина. Продукт экспрессии прокарионтной клетки с аминопоследовательностью Met - Y - Pro .' X - Pro - А сначала расщепляют ІдА-протеазой, так что образуется первый продукт расщепления с аминопоследовательностью X - Pro - А. Теперь этот протеин, как описано выше, можно обрабатывать дипептидиламино-лептидазой, которая специфически распознает последовательность X - Pro и расщепляет после Pro. Таким образом, образуется второй продукт расщепления с любой последовательностью аминокислоты А. Способ по изобретению оказывается, следовательно, исключительно полезным для получения самых различных протеинов без N-концевого остатка метионина и не ограничивается только получением протеинов с N-концевой последовательностью X - Pro, причем X обозначает преимущественно Ser, Thr или Ala. Наконец, изобретение включает также рекомбинантную ДНК, которая содержит кодированную для (определенной выше) точки распознавания lgA-протеазы область и пригодна для встраивания в переходную точку слившихся протеинов. При этом речь идет преимущественно о химически синтезированном ДНК-фрагменте, на концах которого находятся обычно одна или несколько подходящих ограничительных точек пересечения. Определения понятия: Способ по изобретению включает биотехнологическое получение желательных протеинов. Под биотехнологией подразумевают в этой связи, что желательный протеин или его промежуточный продукт получают с применением геннотехнологических средств и других биотехнологических способов (например ферментация микроорганизмов). Желательный протеин представляет промежуточный продукт или конечный продукт, который может найти применение например в области медицины, исследования, в защите окружающей среды или в промышленных процессах или продуктах. Способ по изобретению включает, что желательный протеин образуется из слитого протеина (обозначаемого также как слияние протеинов), причем слитый протеин или слияние протеинов составляется из нескольких ковалентно связанных друг с другом партнеров слияния. При этом по меньшей мере один из партнеров слияния представляет желательный протеин. Последовательность партнеров слияния и степень их повторения в слитом протеине любая; однако преимущественно она состоит из аминоконцевого протеина-носителя и карбоксиконцевого желательного протеина. Протеин-носитель или часть носителя служит для того, чтобы придавать желательному протеину в форме слитого протеина особенные свойства. Подобные свойства могут выражаться, например, в повышенной устойчивости слитых протеинов, которая основывается на структурных особенностях и тем самым в значительной степени на более высокой регистентности в противоположность клеточным протеазам или же на переносе спитых протеинов в окружающую среду с неболь 27365 шой протеолитической активностью. Кроме того, в протеине-носителе могут содержаться свойства, которые обеспечивают эффективную очистку слитых протеинов. Сюда относятся например связывание определенных лиганд в связи с методами хроматографии сродства, отложение слитых протеинов в отделяемых с небольшими затратами осажденных телах и перенос протеинов на легко доступные места. Области' внутри слитого протеина, в которых компоненты (протеины-носители и желательные протеины) слитого протеина соединяются друг с другом, называют переходными областями. Каждая переходная область может быть определена одной или несколькими последовательностями аминокислот. Последовательности аминокислот (как и все прочие последовательности аминокислот и протеинов) подразумевают и изображают от аминоконцевой (слева) в направлении к карбоксиконцевой (справа). В пределах способа изобретения все те последовательности аминокислот в переходных областях, которые должны быть расщеплены IgAпротеазами, содержат последовательность расщепления или последовательность распознавания по способу изобретения. То место между двумя аминокислотами последовательности аминокислот, в котором происходит расщепление слитых протеинов или слияний протеинов, называют точкой расщепления. Способ по изобретению включает ферментативное расщепление слитых протеинов в переходных областях ІдА-протеазой. Под ІдА-протеазой или игазой в пределах способа изобретения понимают lgA-протеазу штамма Neisseria gonorrhoeae MSII и все другие ферменты, родственные с этой протеазой на уровне нуклеотида и по процессу ее образования. Сюда причисляют также особенно lgA-протеазы рода Neisseria и Haemophilus. Микроорганизм Е. coti ЕД 8654 был депонирован под номером DSM 2102 в Немецком Центре микроорганизмов. Гризебахштрассе 8, 3400 Геттинген. Изобретение поясняется следующими примерами в сочетании с чертежами. Чертежи показывают: Фиг. 1 показывает схематически слияние протеинов между протеином-носителем МЭг-полимеразой (99 аминокислот) и р-областью (положение аминокислот 1195-1505) предвестника lgA-протеазы из Nyonorrhoeae MSII. Переходная область между этими двумя частями состоит из 12 аминокислот и содержит последовательность расщепления - Pro - Pro .'. Thr - Pro - для игазы Для конструирования места расщепления встраивали четыре олигонуклеотида от (1) до (4) между ограничительными точками пересечения Eco RI и Hindlll. Получение полипегггида и расщепление с очищенной игазой пояснены подробно в примере 5 Фиг. 2 показывает слияние протеинов, состоящее из протеина-носителя {99 аминокислот М52-полимераэы и 6 кодированных ллазмидом аминокислот) и 206 аминокислот от СО8-протеина Т-лимфоцитов человека. В последовательности аминокислот СО8-лротеина находится природная последовательность расщепления, которая расщепляется игазой (см. пример 6). Фиг. 3 показывает слияние протеинов В63, которое было продуцировано при помощи секреторной системы экспрессии от Е colt - клеток Оно состоит на аминоконце из холерного токсина В нижняя часть (103 аминокислоты), сопровождаемая соединительной областью (11 аминокислот) с точкой расщепления игазы и на карбоксилконце из части (положение аминокислоты 1097-1160) В-области лредаестника JgA-лротеазы. Точку пересечения игаэы встраивали при помощи обоих олигонуклеотидов Тк 006 и Тк007 между обоими областями протеинов. Фиг 4 схематически показывает слияния протеинов В49 и В59. Они состоят из холерного токсина В нижней части и В-области предвестника lgA-протеазы Между этими частями они содержат две различные переходные области с двумя различными последовательностями расщепления игазы (-Pro - Pro - Ala - Pro и Pro - Pro - Thr - Pro -). Последовательность расщепления конструировали с синтетическими олигануклеотидами (см. фиг. 3) Пример 1. Конструирование ппазмиды для экспрессии не содержащего метионина G-CSF. Конструирование производят при применении носителя экспрессии pPzO7 - mg11 ас (WO. 86/09373) Для этого носитель экспрессии pPzO7 mg11 ас расщепляют с Nco 1 и удаляют выступающие концы с Mung bea п-нуклеазой. Затем расщепляют носитель с Bam HI Последовательность распознавания fgA на уровне ДНК получают через следующие олигонуклеотиды. Олигонуклеотид А: 5' ATT, TCG, GAG, GAA, ААА. ТТА, ATG. АСА. CCA, CTG, CGA, ССТ. ССТ, АСА. CCA. CTG. GGC, ССТ, G, 3' Олигонуклеотид В: 51 GAT СС AGG GCC CAG TGG TGT AGG AGG TCG CAG TGG TGT CAT ТАА ТТТ ТТС СТС CGA АТТ 3' Обе-олигонуклеотиды добавляют в эквимолярных количествах и вводят приблизительно в 100-кратном избытке в расщепленный, как описано выше, носитель pPzO7 - mg11 ас. После повторного перевязывания трансформируют обычным образом сделанные прочными клетки E.coli К12. Известными методами выделяют ДНК из клеток и расщепляют с Ара! и Ва Н1. Фрагмент G CSF длиной приблизительно 520 бп выделяют при применении ограничительных эндокуклеаэ Apal и Bam HI из G - CSF - последовательности (Science 232 (1986), 61-65). Этот фрагмент вводят в расщепленный так же с Apal и Bam HI носитель. Пример 2. Дополнительно к последовательности распознавания lgAi слившийся протеин может содержать еще также пептиды в качестве помощи для очистки. Последние могут состоять из ДНК, которая кодирует стрептавидин. Для этого стрептавидин - ген (W0 89/03422) клонируют в правильную трансляционную решетку перед последовательностью распознавания lgA-протеазы. Пример 3. При помощи описанной в примере 1 плазмиды трансформируют Е соІІ К12 - клетки (ED 8654, DSM 2102), селекционируют на маркер антибиотик (ампициллин) и характеризуют плазмид ограничительным анализом. Такой клон применяют для культивирования и экспрессии G 27365 CSF. Клетки культивируются полной средой. Эта среда содержит на 1 литр 16 г бактотриптона (Дифко), 10 г дрожжевого экстракта (Дифко) и 5 г хлористого натрия. Клетки оставляют для роста до ОД (поверхностной дозы) 546 2,3 и затем индуцируют с 10 мол/п iPTG. Еще через 4 часа клетки собирают центрифугированием, растворяют при помощи лиэозима /ЕДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) и выделяют G - CSF как включенные тела (IB'S, ср. европейский патент А 0219874). Денатурирование или ренатурирование выделенных нерастворимых частиц слияния G - CSF осуществляют, как описано в европейском патенте А 0219874 Денатурирование производят диализом относительно 6 мол/л гуанидингидрохлорида. Здесь можно отбирать уже делящуюся без остатка часть и после диализа относительно 5 ммол/л буферного раствора фосфата калия с рН 7 применять для расщепления с ІдА-протеазой (пример 4). В качестве альтернативы осуществляют после денатурирования в гуанидингидрохлориде диализ относительно 5 ммол/л буферного раствора фосфата калия с рН 7, который содержит 1 ммол/л GSH и 3 ммол/л GSS G. После ренатурирования здесь также происходит диализ относительно 5 ммол/л буферного раствора фосфата калия с рН 7. Пример 4. Расщепление слитого протеина lgAiпротеазой для получения нативного G-CSF без метионина в положении -I tgAI-протеазу выделяют как описано в ЕМВО Jour. 3. (1984), 1595-1601. К 10 цг ренатурированного или денатурированного по примеру 3 G - CSF добавляют 2 - 5 рг (gA-лротеазы и инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Часть различные ионоробменные колонки, как Моно-Q или Моно-S, можно выделять не содержащий метионина G - CSF. Последовательность протеинов аминоконца показывает, что очищенный G - CSF начинается с правильной последовательности аминокислот Thr (+1) - Pro (+2). Пример 5. Получение слияния протеинов и расщепление нерастворимых протоеиновых агрегатов из "включенных тел" на специфической точке пересечения игазы Прокариотный носитель экспрессии рЕХ31С (К. Strebel, Journal of Virology 57, 983-991, 1986) был модифицирован таким образом, что сверхпродуцированное с этой системой в E.coliклетках слияние протеинов можно было расщеплять игазой на протеин-носитель и желательный протеин. Для этого был составлен из полученных синтетическим путем олигонуклеотидов двунитевой ДНК - фрагмент, который кодирует последовательность аминокислот Тпг - Pro - Ala - Pro - Arg Pro - Pro .'. Thr - Pro. Этот ДНК - фрагмент при помощи методов генной технологии вводили в точку пересечения EcoPl носителя экспрессии рЕХ31С. Кроме того, непосредственно на границе в точке пересечения Hind III вставляли два других синтетических ДНК - фрагмента, которые содержали ряд подходящих точек пересечения для ограничительных эндонуклеаз и концевых сигналов для участвующих в экспрессии гена ферментов бактерий. В полученный таким путем плазмид экспрессии pEV37, используя точки пересечения для Smal и Н Ml, вводили ДНК - фрагмент, который кодирует р-область IgA - протеазы-протеина-пред вестника из Neisseria gonorrhoeae MStf. В результате этого получался гибридный ген, при выражении которого в E.coli образовывался слитый протеин. Последний содержал на аминоконце в качестве протеина-носителя 99 аминокислот MS2 полимераэы, сопровождаемые центральной переходной областью 12 аминокислот с последовательностью расщепления игазы и с желательной Р-областью на карбоксильном конце (см. фиг. 1). При помощи очищенной игазы можно было отщеплять р-область от карбоксильного конца слияния протеинов в точке пересечения Pro .'. Thr внутри переходной области. Поазмидус гибридным геном вводили трансформацией в E.coli - клетки, которые для регулируемого перепроизводства слияния протеинов содержали фактор регуляции CI057 из бектериофага лямбда (Е. Remaut, Gene 22, 103-113, 1983). Повышением температуры с 28°С до 42°С инактивировали CI857 - репрессор и вследствие этого активировали производство протеина s рекомбинантных E.coli - клетках. Для этого 50 мл выросшей в течение 12 часов при 28°С Е. coll - культуры переводили в 200 мл предварительно подогретой до 45°С среды и культивировали дальше 2 часа при 42°С. В этой стадии накапливали слияние протеинов в цитоплазме бактерий в больших количествах в форме "включенных тел". Затем собирали бактерии центрифугированием, суспендировали в 20 мл буферного раствора лизиса (10% сахарозы, 50 ммол трис/НСІ рН 8,0, 1 ммол ЕДТА) и после добавки 400 цл раствора лизозима (5 мг/мл) инкубировали в течение 30 минут при 22°С. Добавляли детергент тритон-Х-100 до конечной концентрации 0,1% и инкубировали раствор снова в течение 30 минут. Высвобожденную при лизисе клеток ДНК измельчали обработкой ультразвуком, нерастворимые составные части, в том числе находящееся в осажденных телах слияние протеинов, центрифугировали и затем промывали в 5 мл HINTE - буферного раствора (1 мол мочевины, 50 ммол NaCl, 50 ммол трис/НСІ рН 8,0, 1 ммоп ЕДТА). После повторного центрифугирования осадок суспендировали облучением ультразвуком в 5 мл PBS -буферного раствора (20 ммол фосфата калия, Н 7,5, 140 ммол NaCl) и промывали. Этот процесс повторяли несколько раз, чтобы удалять полностью остатки мочевины Наконец, нерастворимую фракцию, которая содержала слитый протеин, суспендировали облучением ультразвуком в 5 мл PBS - буферного раствора Количество и качество суспендированного слияния протеинов определяли при помощи электрофореза на SDS-полиакриламид-геле (12,5%) и последующего окрашивания при помощи Coomassie голубого Для расщепления инкубировали суспензию протеинов в отношении фермент/субстрат 1/100 (вес/вес) в течение 3 часов при 37°С. Последующее расщепление неочищенного и нерастворимого слияния протеинов исследовали аналитичвески при помощи электрофореза на SDS-полиакриламид-геле, причем оказалось, что образовался полипептид ожидаемого для р-протеина" размера. Этот протеин был перенесен на мембрану из нитроцеллюлозы и подвергнут автоматизированному анализу последова 10 27365 тельностей Последовательность концевых аминокислот подтвердила его образование из слияния протеинов точным расщеплением на имеющейся точке расщепления игазы Однако при расщеплении превращали только приблизительно до 50% всего количества введенного субстрата. Добавкой больших количеств игазы и более продолжительными временами реакции не могли достигать никакого повышений Это указывает на то, что в непересеченной части слитого протеина точка пересечения для игазы недоступна. Гибридный протеин и продукты расщепления и после инкубирования игазой находятся в форме нерастворимых агрегатов и поэтому не могут быть седиментированы из суспензии центрифугированием. Выходы расщепления до 90% достигали в том случае, когда вместо загрязненной фракции "включенных тел" применяли слияние протеинов, которое предварительно было подвергнуто дополнительной стадии очистки Для этого нерастворимый осадок после промывки в HlNTE-буферном растворе (см. выше) поглощали в 5 мл H7NTE-6yферного раствора (7 мол мочевины, 50 мл NaCI, 50 ммол трис/НС1 рН 8. 1, 1 ммол ЕДТА) Нерастворимые части отделяли центрифугированием, а растворимую фракцию подвергали диализу относительно 5 литров PBS-буферного раствора при 4°С. При получении мочевины диализом слитый протеин осаждался из раствора в форме нерастворимых агрегатов. Осажденные агрегаты в результате обработки облучением ультразвуком переводили в тонкую суспензию и, как описано выше, расщепляли игазой и анализировали. Пример в. Специфичвеское расщепление ренатурироваиного, растворимого слияния протеинов игазой При применении рЕХ-системы экспрессии получали гидридный протеин (см. пример), который состоит из М52-полимеразы и части CD8-npoтеина цитотоксических Т-лимфоцитов человека (см. фиг 2). После предварительной очистки и растворений протеина из "включенных тел" в Н7ЫТЕ-буферном растворе в качестве следующей стадии очистки применяли приготовленный 12,5%ный SDS-полиакриламидный гель. Слияние протеинов как отдельную полосу после окрашивания Coomassie - голубым вырезали из геля и затем по методу Hunkapiller (Methodsin Enrymology 91, 227235, 1983) отделяли от материала геля. При этом электроэлюцию производили в ТАЕ - буферном растворе (40 ммол трис/ацетат, рН 7,9), к которому был добавлен 0,1%-ый SDS (лаурилсульфат натрия). SDS позднее удаляли диализом относительно 5 литров ТАЕ - буферного раствора при 22°С. При дальнейшем диализе протеин переводили в буферный раствор для хранения (20 ммол фосфата калия, рН 7,5, 140 ммол NaCI, 50% глицерина). Полученный таким путем растворимый слитый протеин инкубировали очищенной игазой (см. пример 5) и при этом полностью расщепляли на содержащейся в CD8 - молекуле точке расщепления (-Pro - Pro .'. Thr - Pro - Ala -, см. фиг. 2) на два полипептидных фрагмента. Специфичность расщепления проверяли анализом последовательности аминокислот на аминоконце меньшего продукта расщепления. При этом получалась, как ожидали, последовательность Thr - Pro - Ala - Pro Thr - lie. Пример 7 Специфическое расщепление растворимого, полученного из надосадочных жидкостей культуры слияния протеинов при помощи игазы. Слияние протеинов, состоящее из холератоксина В нижняя часть и части р-облэсти (позиции 1097-1160, J Pohlner, Nature 325, 458-462, 1987) пр едв ест ника Ig A - про т еа зы и з N gonorrhoeae MSH получали в растворимой форме из надосадочных жидкостей культуры рекомбинантных Е colt -клеток Чтобы можно было отделять друг от друга обе части протеинов, в переходную область между холератоксином В - нижней частью и р-сбластью при помощи методов генной технологии была введена искусственная последовательность расщепления для игазы (Pro - Pro .'. Thr - Pro -) Для этого олигонуклеотиды ТкООб и Тк007 были введены между ограничительными точками пересечения EcoRI и SacH в переходной области (см фиг. 3) Протеин слияния собрали из 2 литров надосадочной жидкости выращенной в течение 12 часов при 37°С бактериальной культуры осаждением при помощи сульфата аммония и затем диализом относительно 5 литров PBS - буферного раствора Для расщепления его при концентрации 50 г/мл в PBS - буферном растворе при отношении фермент/субстрат 1/50 вес/вес) инкубировали с очищенной игазой в течение 2 часов при 37°С. Иммунный анализ показал, что появляющийся при полном расщеплении более крупный фрагмент расщепления по своему молекулярному весу и по своей реакции с антисывороткой соответствовал природному холератоксину В - нижней части. Пример 8. Специфическое расщепление слияний протеинов на поверхности грамотрицательных бактерий при помощи игазы Секреторную систему экспрессии использовали для того, чтобы слияния протеинов ТКВ49 и ТКВ59, состоящие из холератоксина в нижней части и IgA - протеазы р-области на поверхности рекомбинантных салмонелл, экспонировать наружу Кодирующий ТКВ 49 гибридный ген содержал в переходной области между областью токсина и Вобластью оригинальную последовательность расщепления (с) (-Pro - Pro .', Ala - Pro -) для игаэы. Напротив, в ген для ТкВ59 вводили искусственный ДНК - фрагмент, состоящий из олигонуклеотидов ТкООб и ТкОО7 между ограничительными точками пересечения EcoRI и SacH, который кодировал последовательность расщепления (-Pro - Pro .'. Thr - Pro -) (см фиг. 3). Если неповрежденные бактерии, которые несли такие сцепленные с их поверхностью слияния протеинов, инкубировали с очищенной игаэой, том можно было наблюдать специфическое расщепление на точках пересечения игазы В иммунных анализах было показано, что появляющиеся при расщеплении небольшие фрагменты расщепления по своему размеру и по реакции с а нти сывороткой соответстсвовали природному холератоксину В нижней части. Пример 9. Очищение активной игазы из надосадочных жидкостей культуры рекомбинантных E.coli - клеток 27365 Рекомбинантные Е. coir C600 - клетки, которые содержат плазмиду рЕХ107О (патент ФРГ 3622221.6) с модифицированным геном IgA - протеазы, выделяют активную игаэу в надосадочную жидкость культуры. Фильтрованием через мембрану можно было накапливать фермент в надосадочной жидкости культуры и затем осаждать из раствора сульфатом аммония (0,42 г/мл). После центрифугирования осадок растсворяли в Биорекс-буферном растворе (50 ммол фосфата калия, рН 7,0, 8,6% глицерина) (1 мп буферного раствора на 1 литр надосадочной жидкости культуры), уравновешивали диализом относительно 2 литров буферного раствора и затем подвергали катионообменной хроматографии (Биорекс 70). Связанную IgA - протеазу в одной стадии элюировали отмывающим буферным раствором (500 ммол фосфата калия, рН 7,0, 8,6% глицерина) с колонки и фракционировали. Затем содержащие IgA - протеазу фракции анализировали электрофорезом на SDS-полиакриламид-геле (12,5%). В этой точке очистки получали среднюю степень чистоты > 90%. Для получения игазы в чистой форме осуществляли гельфильтрацию с Сефзкрилом HR300 в Биорекс-буферном растворе, сопровождаемую последующей катионообменной хроматографией (см. выше). Активность игазы проверяли инкубированием с IgA - актителэми и разделением образующихся продуктов расщепления в - попиакриламидгеле. Пример 10. Конструирование плазмиды для экспрессии не содержащего метионина интерпейкина 3: Конструирование осуществляют с применением носителя экспрессии pPzO7 - mglac (WO 88/09373). Для этого носитель экспрессии pPzO7 mgllac расщепляют при помощи NC01 и выступающие концы удаляют с Mung benn - нуклеазой. Затем дополнительно расщепляют носитель с BamHi. Оптимированную амииоконцевую область слитого протеина получают на уровне ДНК через следующие олигонуклеотиды: Первичный IA: 5'AATTCGGAGGAAAAATTAATGAAAGCCAA ACGTTTTAAAAAACATGTCGACCATGGAG 3і Первичный IB: Первичный 2А: 5'AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCC CATGACCCAGACAACGCCC 3' Первичный 2В: 5TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCGAGGC TCAAAGT 3' Получающийся PCR - фрагмент дополнительно перерезают ферментами Sal I и BamHI и его можно вставлять непосредственно в вышеописанный носитель ДНК и связывать ковалентно при помощи лигазы. После трансформации ДНК в соответствующего хозяина, например Е. coli. K12 С600, можно синтезировать 11 3 в Е. соІІ в форме Rb'S и затем выделять. Как описано для G - CSF, осуществляют денатурирование и ренатурирование протеина и расщепляют ренатурированный протеин при помощи IgA - протеазы. Полученный таким путем не содержащий метионина 113 после дальнейших стадий очистки можно применять для терапии. Пример 11. Конструирование плазмида для экспрессии не содержащего метионина интерлейкина 2 Конструирование можно осуществлять с применением носителя экспрессии pPzO7 - mgllac (WO 88/09373), который после включения первичных (А и IB, как описано в примере 10, расщепляли с Sall/BamHI. Получение кодирующей области интерпейкина 2 с областью распознавания IgA протеаэы на уровне ДНК осуществляют методом PCR, причем проводят PCR - реакцию с с-ДНК интерлейкина 2 в качестве шаблона и первичными ЗА и ЗВ, которые так же кодируют область распознавания для IgA - протеазы. Первичный ЗА: S'AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCAC CTACTTCAAGTTCTACAAAG 3' Первичный ЗВ: 5TTCGTTGGATCCTCAAGTTAGTGTTGAGA TGATGCTTT З1 Полученный таким путем PCR - фрагмент дополнительно перерезают ферментами Sail и BamHI и его можно непосредственно вставлять в вышеописанный носитель ДНК. Дальнейшее происходит, как описано при 11 3. В предыдущем примере было описано, как соответствующим применением точки распознавания igA - протеазы и последующим способом можно получать не содержащие метионина терапевтические протеины, которые начинаются с последовательности кислот АІа - Pro. Другие протеины, которые аналогично вышеописанным примерам можно получать без метионина, а именно при применении олигонуклеотидов, которые содержат область распознавания для IgA - протеазы и область, которая по аналогии соответствует 5' или З1 концу опубликованной последовательности и может быть получена через PCR - увеличение. Ниже приведены другие соответствующие терапевтические протеины, которые в зрелой встречающейся в природе форме начинаются с Ala - Pro и поэтому могут быть получены аналогичным образом по способу изобретения. Cathepsin L (ЕС 3.4.22.15). MaSoh, R.W. et a), Biochem. J. 240 373-377,1986. Эритропойетин, Lai, P.H. et at. J. Biol. Chem. 261,3116-3121,1986. , S'GGATCCTCCATGGTCGACATGt ПІ І І АА AACGTTTGGCTTTCATTAAI I I I ICCTCCGAATT 31 Оба опигонушлеотида добавляют вместе в эквимолярных количествах и вводят приблизительно в 100-кратном избытке в расщепленный, как описано выше, носитель PpzO7 - mgllac. После перевязывания сделанные обычным путем компетентными клетки Е. Coli K12 трансформируют. Известными методами выделяют из клеток ДНК, расщепляют при помощи Sall/BamHI и перевязывают с ДНК - фрагментом, который содержит кодирующую область интерлейкина 3 без сигнальной последовательности (описано ниже). Получение кодирующей области интерлейкина 3 с областью распознавания для IgA - протеаэы на уровне ДНК осуществляют через известную технику PCR, причем проводят PCR - реакцию с с - ДНК интерлейкина 3 а качестве шаблона и с нижеописанными первичными: 12 УКРАЇНА (19) UA (ID 27365 (із, С2 (51) 6C12N15/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ ПОЛІПЕПТИДУ, ЩО ВИКЛИКАЄ (НТЄРЄС, t ПОЛІПЕПТИД (21)93004452 (22)01.02 1991 Pro - Arg - Pro - Pro .'. Ala - Pro, (d) Pro -Pro .". The - Pro, (e) Ala - Pro - Arg - Pro - Pro'. . Thr - Pro или (f) Pro - Ala - Pro - Arg - Pro - Pro .'. The - Pro, причем .', показывает точку расщепления. Настоящее изобретения включает также, а частности, протеин или пептид с последовательностью аминокислот Met - Y - Pro'. . X - Pro - А, где X обозначает преимущественно The, Ala или Ser, Y обозначает одну или несколько любых ами юкислот, и преимущественно, если X обозначает The или Ala, оканчивается Pro, или, если X обоэ^чает Ser, оканчивается последовательностью э го - Ala или Pro, и А обозначает любую последозательность аминокислот. Подобный протеин или іептид экспримируют по способу изобретения рансформацией прокарионтной клетки с рекомїинантньїм носителем, который содержит по меньией мере копию гена, который кодирует подобный іротеин или пептид. Последовательность А может обозначать іюбую последовательность аминокислот. Однако іелесообразно, чтобы внутри этой последова тельности аминокислот не было другой точки расщепления для lgA-протеазы. Далее, предметом настоящего изобретения является рекомбинантнэя ДНК, которая кодирует протеин или пептид по изобретению и где по меньшей мере в переходной области слившегося протеина встроены одна или несколько точек распознавания lga-протеазы или последовательностей расщепления. Рекомбинантную ДНК по изобретению можно получать известным специалисту в области молекулярной биологии способом. Обычно для этого носитель, который содержит кодирующую последовательность аминокислот А ДНК-последовательность, расщепляют ограничительными эндонуклеазами в области 5' - конца этого гена и повторно перевязывают олигонуклеотидами, которые содержат желательную последовательность. При этом олигонуклеотид должен содержать последовательность, которая кодирует точку расщепления lgA-протеазы или часть ее. Далее, предметом изобретения является также рекомбинантный носитель, который содержит по меньшей мере копию рекомбинантной ДНК по изобретению. Подходящие для экспрессии протеина в прокарионтных организмах основные носители известны специалисту. Целесообразным носителем является такой носитель, который обеспечивает высокую экспрессию рекомбинантной ДНК по изобретению. Рекомбинантная ДНК находится преимущественно под контролем индуцируемого сигнала экспрессии (напр. X, tac, lac, или trp просмотр). Носитель по изобретению может быть как внехромосомным (напр, плазмид), так и интегрированным (напр, бактериофак ламбда) в геноме организма-хозяина. Преимущественно носитель по изобретению представляет плазмид. Носители, которые пригодны соответственно для экспрессии гена в определенном организме-хозяине, известны специалисту в области молекулярной биологии. Речь может идти об эукарионтном, но преимущественно о прокарионтном носителе. Примерами носителей, пригодных для экспрессии ДНК по изобретению в прокарионтах, являются имеющиеся в продаже риС и PuR-HOctrrenH. Другим предметом изобретения является клетка, преимущественно прокарионтная клетка, особенно преимущественно E.coli клетка, которая трансформирована с рекомбинантной ДНК по изобретению или/и с рекомбинантным носителем по изобретению. Примерами для протеинов, которые имеютN-концевую последовательность X - Pro, причем X обозначает Thr, Ala или Ser, и которые можно получать по способу изобретения в одной стадии, являются эритропоэтин человека, ( (Ї- цепь Т-клеточного рецептора человека и особенно стимули-, рующий гранулоциты фактор человека (G - CSF). G - CSF синтезируют как ламфокин активированных моноцитов, макрофагов, а также ряда других клеточных линий. Лимфокины участвуют в созревании клеток иммунной системы или системы клеток крови. Они стимулируют созревание основных клеток костного мозга до раэдифференцированных 27365 клеток. Так, например, G - CSF индуцирует образование нейтрофилена и гранулоцитов. Так как G - CSF может значительно повышать популяцию нейтрофильных клеток в течение короткого срока, для G - CSF получаются широкие возможности применения в области терапии. Так, G - CSF можно было бы применять например после химиотерапии при раке, при которой разрушаются клетки иммунной системы Далее, G - CSF можно было бы применять при пересадках костного мозга, при тяжелых ожоговых ранах, при обусловленных слабым иммунитетом враждебных инфекциях и при лейкемии. G - CSF представляет секреторную молекулу протеина. Поэтому первичный продукт трансплантации содержит N-концевую последовательность сигналов, которая при секреции отщепляется, так что последовательность зрелого G - CSF начинается с аминокислот Thr (+1) - Pro (+2) (положения аминокислот +1 и +2) Про продуцировании G - CSF в прокарионтах этот сигнальный пептид расщепляется только плохо или совсем не расщепляется, так что для получения G - CSF без сигнальной последовательности из прокарионтов необходимо клонировать AUC (Met) в качестве инициирующего кодона перед началом кодирующей зрелый G - CSF последовательности ДНК, которая начинается на уровне протеина с Т (+1) Pro (+2). В результате этого в прокарионтах, как E.coli, экспримируют G - CSF, который содержит метионин в і - положении аминокислоты По способу изобретения можно простым путем получать не содержащий метионина в I - положении аминокислоты G - CSF из прокарионтов, который начинается с аминокислот Thr (+1) - Pro (+2). Это происходит в результате того, что получают производное G - CSFHe прокарионтов, которое в положении +1 и +2 последовательности аминокислот содержит аминокислоты Thr (+1) Pro (+2) и перед этим, начиная с положения - I последовательности аминокислот, содержит такую последовательность аминокислот, которая распознается ІдА-протеазой и может отщепляться от последовательности аминокислот С - С Г, которая начинается cThr(+1)- Pro (+2). 8 предпочтительном варианте осуществления производное содержит в положении -1 и -2 по Pro, в положении -3 до положения I - последовательность аминокислот Аф - Pro - Pro, в положении 4 - до -1 последовательность аминокислот Pro - Arg - Pro - Pro или в положении -5 до положения -1 последовательность аминокислот Ala Pro-Arg-Pro-Pro. В особенно предпочтительном варианте осуществления производное содержит а положении -6 до положения -1 последовательность аминокислот -6 - 5 - 4 - 3 -2 -1Pro - Ala Pro - Arg - Pro - Pro Под G - CSF в смысле изобретения понимают, конечно, существующий С - GSF, последовательность которого раскрыта, например, в Science 232 (1986) 61, а также образованные от него производные со стимулирующей гранулоциты активностью, у которых последовательности аминокислот начинаются с X (+1) - Pro (+2). X обозна чает Thr, Ser или Ala, особенно предпочтительно The. G - CSF производное по изобретению после экспрессии в прокарионтах можно расщеплять обработкой ІдА-протеазой между положением +1 и -1 (между Thr (+1) и Pro (-1) Тем самым в результате единственной стадии гидролиза получают не содержащий метионина в положении -1 G - CSF, последовательность аминокислот которого на Nконце начинается с аминокислот Thr (+1) - Pro (-2) встречающегося в природе G - CSF. При экспрессии G - CSF в лрокарионтзх образуются труднорастворимые агрегаты (refractie bodies), которые неактивны. Прежде чем применять протеи, например для терапевтических целей, его следует перевести в efo активную форму. При известных специалисту способах (ср. например европейский патент А 0219874, европейский патент А 0114506, WO 84/03711 сначала осуществляют растворение добавкой денатурирующих средств, к которому присоединяются ренатурироеание и в случае необходимости дальнейшие стадии очистки Обработку протеина по изобретению ІдА-протеазой можно проводить перед растворением, после растворения или лишь после ренатурирования. В случае, если обработка ІдА-протеазой должна проводиться непосредственно после растворения, следует перед добавкой IgA-npoтеазы отделять растворитель (например гидрохлорид гуанидина или мочевину) диализом. Однако обработку ІдА-протеазой проводят преимущественно после ренатурирования, так как в этом случае выходы G - CSF особенно высокие. Условия для обработки G - CSF или другого отщепляемого протеина lgA-лротеазой сами по себе не являются критическими. Однако предпочтительно применять при этом G - CSF (или другой протеин) относительно, tgA-протеазы в весовом отношении 1:1 до 100:1. Превращение происходит предпочтительно в буферном водном растворе с рН от 6,5 до 8.5. Концентрация буферного раствора лежит преимущественно в области между 50 и 300 ммоп/л, в случае необходимости при добавке 20-100 ммоп/п хлористого натрия. Преимущественно расщепление происходит при комнатной температуре свыше 20-60 минут. После растворения, ренатурирования и расщепления ІдА-протеазой полученный таким путем продукт расщепления очищают преимущественно через ионообменник и крупное фракционирование. Загрязнение полученного таким путем и не содержащего метионина в положении -I G - CSF другими протеинами составляет ниже 0,1%, преимущественно ниже 10'3 %. Следовательно, не содержащий метионина в положении -I G - CSF расщеплением ІдА-протеазой можно отделять или очищать практически количественно от содержащего метионин спитого протеина. По способу изобретения можно получать рекомбинантный G - CSF из прокарионтов, который менее чем на 0,1%, преимущественно менее чем на 10'3% загрязнен другими протеинами и количественно не содержит G - CSF из прокарионтов, КОТОРЫЙ б ПОЛОЖеНИИ -I СОДерЖИТ МЄТИОМЙН. Предметом изобретения является также лекарственное средство на основе полученного по 27365 способу изобретения G - CSF из прокарионтов в качестве активного вещества, в случае необходимости вместе с обычными фармацевтическими веществами-носителями, наполнителями и вспомогательными веществами. Такое лекарственное средство особенно пригодно для лечений, при которых следует стимулировать образование гранулоцитов, особенно нейтрофилов. Фармацевтические препараты по изобретению применяются преимущественно как растворы для инъекций и вливаний. Это можно осуществлять в результате того, что имеется в распоряжении уже готовый для впрыскивания раствор, который содержит состав по изобретению Однако возможно также использование фармацевтических препаратов в форме лиофилизатов. Последние образуются при помощи известных, подходящих для целей инъекции средств или растворов. В качестве среды для инъекции применяют преимущественно воду, которая содержит обычные в растворах для инъекций добавки, как стабилизаторы, агенты растворения,буферные растворы и изотонические добавки, например, физиологический раствор хлористого натрия. Подобными добавками являются, например, маннит, буферный раствор тартрата или цитрата, этанол, комплексообразователь, как например этилендиаминтетрауксусная кислота и ее нетоксичные соли, а также высокомолекулярные полимеры, как жидкая окись полиэтилена для регулирования вязкости. Жидкие вещества-носители для инъекционных растворов должны быть стерильными и разливаются преимущественно в ампулы. Наконец, настоящее изобретение включает также применение не содержащего метионина в положении -I, G - CSF из прокарионтов для получения фармацевтических препаратов по изобретению. Для того случая, когда при расщеплении любого слитого протеина способом по изобретению в качестве образующегося продукта получают протеин X - Pro - А (причем X обозначает любую аминокислоту и А обозначает любую последовательность аминокислот), который однако на своем аминоконце несет нежелательный дипептид X Pro, тогда можно отделять этот нежелательный дипептид как часть способа по изобретению дальнейшей обрабтокой дипептидиламинопептидазами (ДРАР), Дипептиди л аминопептидазы находили до сих пор у ряда микроорганизмов, насекомых, амфибий и в различных тканях человека. Они служат например для постепенной химизированной переработки проте и нов-предвестии ко в и имеют частично ярко выраженную специфичность для аминоконцевого расщепления дипептида X - Pro (X Pro - ДРАРазы; G. Kreil, Trendsin Biochemical Sciences 15. 23 - 26, 1990). Поэтому комбинацией способа по изобретению игазы и X - Pro - ДРАР можно получать желательные протеины с любыми зминоконцевыми кислотами Теперь при помощи вышеописанной комбинации игазы и X - Pro - ДРАР удается получать также протеины с другой N-концевой последовательностью аминокислот из прокарионтов в положении -I без метионина. Для этого сначала получают слитый протеин, который имеет последовательность аминокислот Met - Y - Pro .'. X - Pro - А, причем теперь в этом случае последовательность аминокислот А без обоих N-концевых аминокислот X - Pro представляет желательную часть зкспримируемого протеина. Продукт экспрессии прокарионтной клетки с аминопоследовательностью Met - Y - Pro .'. X - Pro - А сначала расщепляют lgA-протеаэой, так что образуется первый продукт расщепления с аминопоследовательностью X - Pro - А. Теперь этот протеин, как описано выше, можно обрабатывать дипептидиламино-пептидазой, которая специфически распознает последовательность X - Pro и расщепляет после Pro. Таким образом, образуется второй продукт расщепления с любой последовательностью аминокислоты А. Способ по изобретению оказывается, следовательно, исключительно полезным для получения самых различных протеинов без N-концевого остатка метионииа и не ограничивается только получением протеинов с N-концевой последовательностью X - Pro, причем X обозначает преимущественно Ser, Thr или Ala. Наконец, изобретение включает также рекомбинантную ДНК, которая содержит кодированную для (определенной выше) точки распознавания lgA-протеаэы область и пригодна для встраивания в переходную точку слившихся протеинов. При этом речь идет преимущественно о химически синтезированном ДНК-фрагменте, на концах которого находятся обычно одна или несколько подходящих ограничительных точек пересечения. Определения понятия: Способ по изобретению включает биотехнопогическое получение желательных протеинов. Под биотехнологией подразумевают в этой связи, что желательный протеин или его промежуточный продукт получают с применением геннотехнологических средств и других биотехнологических способов (например ферментация микроорганизмов). Желательный протеин представляет промежуточный продукт или конечный продукт, который может найти применение например в области медицины, исследования, в защите окружающей среды или в промышленных процессах или продуктах. Способ по изобретению включает, что желательный протеин образуется из слитого протеина (обозначаемого также как слияние протеинов), причем слитый протеин или слияние протеинов составляется из нескольких ковалентно связанных друг с другом партнеров слияния. При этом по меньшей мере один из партнеров слияния представляет желательный протеин. Последовательность партнеров слияния и степень их повторения в слитом протеине любая; однако преимущественно она состоит из аминоконцевого протеина-носителя и карбоксиконцевого желательного протеина. Протеин-носитель или часть носителя служит для того, чтобы придавать желательному протеину в форме слитого протеина особенные свойства. Подобные свойства могут выражаться, например, в повышенной устойчивости слитых протеинов, которая основывается на структурных особенностях и тем самым в значительной степени на более высокой резистентное™ в противоположность клеточным протеазам или же на переносе слитых протеинов в окружающую среду с неболь 27365 шой протеолитической активностью. Кроме того, в протеине-носителе могут содержаться свойства, которые обеспечивают эффективную очистку слитых протеинов Сюда относятся например связывание определенных лиганд в связи с методами хроматографии сродства, отложение слитых протеинов в отделяемых с небольшими затратами осажденных телах и перенос протеинов на легко доступные места. Области внутри слитого протеина, в которых компоненты (протеины-носители и желательные протеины) слитого протеина соединяются друг с другом, называют переходными областями. Каждая переходная область может быть определена одной или несколькими последовательностями аминокислот. Последовательности аминокислот (как и все прочие последовательности аминокислот и протеинов) подразумевают и изображают от аминоконцевой (слева) в направлении к карбокси концевой (справа). В пределах способа изобретения все те последовательности аминокислот в переходных областях, которые должны быть расщеплены igAпротеазами, содержат последовательность расщепления или последовательность распознавания по способу изобретения То место между двумя аминокислотами последовательности аминокислот, в котором происходит расщепление слитых протеинов или слияний протеинов, называют точкой расщепления Способ по изобретению включает ферментативное расщепление слитых протеинов в переходных областях (gA-протеазой. Под ІдА-протеаэой или игазой в пределах способа изобретения понимают ІдА-протеазу штамма Neisseria gonorrhoeae MSII и все другие ферменты, родственные с этой лротеазой на уровне нуклеотида и по процессу ее образования. Сюда причисляют также особенно lgA-протеазы рода Neisseria и Haemophitus. Микроорганизм Е. соїі ЕД 8654 был депонирован под номером DSM 2102 в Немецком Центре микроорганизмов. Гризебахштрассе 8, 3400 Геттинтен. Изобретение поясняется следующими примерами в сочетании с чертежами. Чертежи показывают: Фиг. 1 показывает схематически слияние протеинов между протеином-носителем МВ2-попимеразой {99 аминокислот) и (^областью (положение аминокислот 1195-1505) предвестника )дА-протеазы из Nyononhoeae MSII. Переходная область между этими двумя частями состоит из 12 аминокислот и содержит последовательность расщепления - Pro - Pro .'. Thr - Pro - для игазы Для конструирования места расщепления встраивали четыре олигонуклеотида от (1) до (4) между ограничительными точками пересечения Eco RI и Hindi)) Получение полипептида и расщепление с очищенной игазой пояснены подробно в примере 5 Фиг. 2 показывает слияние протеинов, состоящее из протеина-носителя (99 аминокислот М52-полимеразы и 6 кодированных плазмидом аминокислот) и 206 аминокислот от CDe-протеина Т-лимфоцитов человека. В последовательности аминокислот СО8-протеина находится природная последовательность расщепления, которая расщепляется игазой (см. пример 6). Фиг 3 показывает слияние протеинов В63, которое было продуцировано при помощи секреторной системы экспрессии от Е colt - клеток Оно состоит на аминоконце из холерного токсина В нижняя часть (103 аминокислоты), сопровождаемая соединительной областью (11 аминокислот) с точкой расщепления игазы и на карбоксипконце из части (положение аминокислоты 1097-1160) В-области предвестника tgA-лротеазы Точку пересечения игазы встраивали при помощи обоих олигонуклеотидов Тк 006 и Тк007 между обоими областями протеинов Фиг. 4 схематически показывает слияния протеинов В49 и В59 Они состоят из холерного токсина В нижней части и В-области предвестника lgA-протеазы Между этими частями они содержат две различные переходные области с двумя различными последовательностями расщепления игаэы (-Pro - Pro - Ala - Pro и Pro - Pro - Thr - Pro -). Последовательность расщепления конструировали с синтетическими олигонуклеотидами (см фиг. 3) Пример 1 Конструирование плазмиды для экспрессии не содержащего метионина G-CSF Конструирование производят при применении носителя экспрессии pPzQT - mg11 ас (WO. 86/09373) Для этого носитель экспрессии pPzO7 mg11 ас расщепляют с Nco 1 и удаляют выступающие концы с Mung Ьеа п-нуклеазой. Затем расщепляют носитель с Bam HI Последовательность распознавания IgA на уровне ДНК получают через следующие олигонуклеотиды. Олигонуклеотид А: 5' ATT, TCG, GAG, GAA, ААА, ТТА, ATG, АСА, CCA, CTG, CGA. ССТ, ССТ, АСА, CCA, CTG, GGC, ССТ, G, З1 Олигонуклеотид В' 5' GAT СС AGG GCC CAG TGG TGT AGG AGG TCG CAG TGG TGT CAT ТАА ТТТ ТТС СТС CGA ATT 31 Обе-олигонуклеотиды добавляют в эквимолярных количествах и вводят приблизительно в 100-кратном избытке в расщепленный, как описано выше, носитель pPzO7 - mg11 ас После повторного перевязывания трансформируют обычным образом сделанные прочными клетки E.coli К12. Известными методами выделяют ДНК из клеток и расщепляют с Ара! и Ва Н1 Фрагмент G CSF длиной приблизительно 520 6п выделяют при применении ограничительных эндокуклеаз Apaf и Bam HI из G - CSF - последовательности (Science 232 (1986), 61-65). Этот фрагмент вводят в расщепленный так же с Apal и Bam HI носитель. Пример 2. Дополнительно к последовательности распознавания IgA! слившийся протеин может содержать еще также пептиды в качестве помощи для очистки Последние могут состоять из ДНК, которая кодирует стрептавидин. Для этого стрептавидин - ген (WO 89/03422) клонируют в правильную трансляционную решетку перед последовательностью распознавания lgA-протеазы. Пример 3 При помощи описанной в примере 1 плазмиды трансформируют Е coli K12 - клетки (ED 8654, DSM 2102), селекционируют на маркер антибиотик (ампициллин) и характеризуют плаэмид ограничительным анализом Такой клон применяют для культивирования и экспрессии G 27365 CSF. Клетки культивируются полной средой. Эта среда содержит на 1 литр 16 г бактотриптона (Дифко), 10 г дрожжевого экстракта (Дифко) и 5 г хлористого натрия. Клетки оставляют для роста до ОД (поверхностной дозы) 546 2,3 и затем индуцируют с 10 мол/л IPTG. Еще через 4 часа клетки собирают центрифугированием, растворяют при помощи лизозима /ЕДТА (зтипендиаминтетрауксусной кислоты) и выделяют G - CSF как включенные тела (IB'S, ср. европейский патент А 0219874). Денатурирование или реиатурирование выделенных нерастворимых частиц слияния G - CSF осуществляют, как описано в европейском патенте А 0219874 Денатурирование производят диализом относительно 6 мол/п гуанидингидрохлорида. Здесь можно отбирать уже делящуюся без остатка часть и после диализа относительно 5 ммол/л буферного раствора фосфата калия с рН 7 применять для расщепления с fgA-протеазой (пример 4). В качестве альтернативы осуществляют после денатурирования о гуанидингидрохлориде диализ относительно 5 ммол/л буферного раствора фосфата калия с рН 7, который содержит 1 ммол/л GSH и 3 ммол/л GSS G. После ренатурирования здесь также происходит диализ относительно 5 ммол/л буферного раствора фосфата калия с рН 7. Пример 4. Расщепление слитого протеина ІдАІ-протеазой для получения нативного G-CSF без метионина в положении -I lgAt-протеазу выделяют как описано в ЕМВО Jour. 3. (1984), 1595-1601. К 10 цг ренатурированного или денатурированного по примеру 3 G - CSF добавляют 2 - 5 jjr lgA-протеазы и инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Часть различные ионоробменные колонки, как Моно-Q или Моно-S, можно выделять не содержащий метионина G - CSF. Последовательность протеинов аминоконца показывает, что очищенный G - CSF начинается с правильной последовательности аминокислот Тпг (+1) - Pro (+2). Пример 5. Получение слияния протеинов и расщепление нерастворимых протоеиновых агрегатов из "включенных тел" на специфической точке пересечения игазы Прокариотный носитель экспрессии рЕХ31С (К. Strebel, Journal of Virology 57, 983-991, 1986) был модифицирован таким образом, что сверхпродуцированиое с этой системой в E.coliклетках слияние протеинов можно было расщеплять игаэой на протеин-носитель и желательный протеин. Для этого был составлен из полученных синтетическим путем олигоиуклеотидов двунитевой ДНК - фрагмент, который кодирует последовательность аминокислот Тпг - Pro - Ala - Pro - Arg Pro - Pro .'. Thr - Pro. Этот ДНК - фрагмент при помощи методов генной технологии вводили в точку пересечения EcoPI носителя экспрессии рЕХ31С Кроме того, непосредственно на границе в точке пересечения Hind II! вставляли два других синтетических ДНК - фрагмента, которые содержали эяд подходящих точек пересечения для ограничительных эндонуклеаз и концевых сигналов для /чествующих в экспрессии гена ферментов бактеэий. В полученный таким путем плазмид экспрессии pEV37, используя точки пересечения для 3mal и Н 111, вводили ДНК - фрагмент, который кодирует р-область IgA - протеазы-протеина-пред вестника из Neisseria gonorrhoeae MSII. В результате этого получался гибридный ген, при выражении которого в В coli образовывался слитый протеин. Последний содержал на аминоконце в качестве протеина-носителя 99 аминокислот MS2 полимеразы, сопровождаемые центральной переходной областью 12 аминокислот с последовательностью расщепления игазы и с желательной р-областью на карбоксильном конце (см. фиг. 1). При помощи очищенной игазы можно было отщеплять р-область от карбоксильного конца слияния протеинов в точке пересечения Pro .'. Thr внутри переходной области. Поазмидус гибридным геном вводили трансформацией в E.coli - клетки, которые для регулируемого перепроизводства слияния протеинов содержали фактор регуляции CI857 из бектериофага лямбда (Е, Remaut, Gene 22, 103-113, 1983) Повышением температуры с 28°С до 42°С инактивировали CI857 - репрессор и вследствие этого активировали производство протеина в рекомбинантных Е.соІ) - клетках. Для этого 50 мл выросшей в течение 12 часов при 28°С Е. colt - культуры переводили в 200 мл предварительно подогретой до 45°С среды и культивировали дальше 2 часа при 42°С. В этой стадии накапливали слияние протеинов в цитоплазме бактерий в больших количествах в форме "включенных тел". Затем собирали бактерии центрифугированием, суспендировали в 20 мл буферного раствора лизиса (10% сахарозы, 50 ммол трис/HCl рН 8,0, 1 ммол ЕДТА) и после добавки 400 цл раствора лизозима (5 мг/мл) инкубировали в течение 30 минут при 22°С. Добавляли детергент тритон-Х-100 до конечной концентрации 0,1% и инкубировали раствор снова в течение 30 минут. Высвобожденную при лизисе клеток ДНК измельчали обработкой ультразвуком, нерастворимые составные части, в том числе находящееся в осажденных телах слияние протеинов, центрифугировали и затем промывали в 5 мл HINTE - буферного раствора (1 мол мочевины, 50 ммол NaCI, 50 ммол трис/НС! рН 8,0, 1 ммол ЕДТА). После повторного центрифугирования осадок суспендировали облучением ультразвуком в 5 мл PBS -буферного раствора (20 ммол фосфата калия, Н 7,5,140 ммол NaCI) и промывали. Этот процесс повторяли несколько раз, чтобы удалять полностью остатки мочевины. Наконец, нерастворимую фракцию, которая содержала слитый протеин, суспендировали облучением ультразвуком в 5 мл PBS - буферного раствора. Количество и качество суспендированного слияния протеинов определяли при помощи электрофореза на SDS-полиакриламид-геле (12,5%) и последующего окрашивания при помощи Coomassie голубого. Для расщепления инкубировали суспензию протеинов в отношении фермент/субстрат 1/100 (вес/вес) а течение 3 часов при 37°С. Последующее расщепление неочищенного и нерастворимого слияния протеинов исследовали аналитичвески при помощи электрофореза на SDS-полиакриламид-геле, причем оказалось, что образовался полипептид ожидаемого для З-протеина* размера. Этот протеин был перенесен на мембрану из нитроцеллюлозы и подвергнут автоматизированному анализу последова 10 27365 тельностей Последовательность концевых аминокислот подтвердила его образование иэ слияния протеинов точным расщеплением на имеющейся точке расщепления игазы Однако при расщеплении превращали только приблизительно до 50% всего количества введенного субстрата Добавкой больших количеств игазы и более продолжительными временами реакции не могли достигать никакого повышения Это указывает на то, что в непересеченной части слитого протеина точка пересечения для игазы недоступна Гибридный протеин и продукты расщепления и после инкубирования игаэой находятся в форме нерастворимых агрегатов и поэтому не могут быть седиментированы из суспензии центрифугированием Выходы расщепления до 90% достигали в том случае, когда вместо загрязненной фракции "включенных тел" применяли слияние протеинов которое предварительно было подвергнуто дополнительной стадии очистки Для этого нерастворимый осадок после промывки в HlNTE-буферном растворе (см выше) поглощали в 5 мп H7NTE-6yферного раствора (7 мол мочевины, 50 мл NaCl, 50 ммол трис/HCl рН 8. 1, 1 ммол ЄДТА) Нерастворимые части отделяли центрифугированием, а растворимую фракцию подвергали диализу относительно 5 литров PBS-буферного раствора при 4°С. При получении мочевины диализом слитый протеин осаждался из раствора в форме нерастворимых агрегатов Осажденные агрегаты в результате обработки облучением ультразвуком переводили в тонкую суспензию и, как описано выше, расщепляли игазой и анализировали Пример 6 Специфичвеское расщепление ренатурированного, растворимого слияния протеинов игазой При применении рЕХ-системы экспрессии получали гидридный протеин (см пример), который состоит из М52-полимеразы и части CD8-npoтеина цитотоксических Т-лимфоцитов человека (см фиг 2) После предварительной очистки и растворения протеина из ' включенных тел" в Н7ЫТЕ-буферном растворе в качестве следующей стадии очистки применяли приготовленный 12,5%ный SDS-лолиакриламидный гель Слияние протеинов как отдельную полосу после окрашивания Coomassie - голубым вырезали из геля и затем по методу Hunkaptller (Melhodsin EnrymoJogy 91, 227235, 1983) отделяли от материала геля При этом электроэлюцию производили в ТАЕ - буферном растворе (40 ммол трис/ацетат, рН 7,9), к которому бып добавлен 0,1%-ый SOS (лаурилсульфат натрия) SDS позднее удаляли диализом относительно 5 литров ТАЕ - буферного раствора при 22°С При дальнейшем диализе протеин переводили в буферный раствор для хранения (20 ммол фосфата калия, рН 7,5, 140 ммол NaCl, 50% глицерина) Полученный таким путем растворимый слитый протеин инкубировали очищенной игазой (см пример 5) и при этом полностью расщепляли на содержащейся в CD8 - молекуле точке расщепления (-Pro - Pro ' Thr - Pro - Ala -, см фиг 2) на два полипептидных фрагмента Специфичность расщепления проверяли анализом последовательности аминокислот на аминоконце меньшего продукта расщепления При этом получалась, как ожидали последовательность Thr - Pro - Ala - Pro Thr - lie Пример 7 Специфическое расщепление растворимого, полученного из надосадочных жидкостей культуры слияния протеинов при помощи игазы Слияние протеинов, состоящее из холератоксина В нижняя часть и части р-области (пози ции 1097-1160, J Pohlner Nature 325, 458-462, 1987) предвестника IgA протеазы иэ N gonorrhoeae MSII получали в растворимой форме из надосадочных жидкостей культуры рекомбинантных Е coli -клеток Чтобы можно было отделять друг от друга обе части протеинов, в переходную область между холератоксином В - нижней частью и р областью при помощи методов генной технологии была введена искусственная последовательность расщепления для игазы (Pro - Pro ' Thr - Pro -) Для этого олигонуклеотиды ТкООб и ТкОО7 были введены между ограничительными точками пересечения EcoRI и Saci! в переходной области (см фиг 3) Протеин слияния собрали из 2 литров надосадочной жидкости выращенной в течение 12 часов при 37°С бактериальной культуры осаждением при помощи сульфата аммония и затем диализом относительно 5 литров PBS - буферного раствора Для расщепления его при концентрации 50 г/мл в PBS - буферном растворе при отношении фермент/субстрат 1/50 вес/вес) инкубировали с очищенной игазой в течение 2 часов при 37°С Иммунный анализ показал, что появляющийся при полном расщеплении более крупный фрагмент расщепления по своему молекулярному весу и по своей реакции с антисывороткой соответствовал природному холератоксину В - нижней части Пример 8. Специфическое расщепление слияний протеинов из поверхности грамотрицательных бактерий при помощи игазы Секреторную систему экспрессии использовали для того, чтобы слияния протеинов ТКВ49 и ТКВ59, состоящие из холератоксина в нижней части и IgA - протеазы р-области на поверхности реКомбинантных салмоНелл, экспонировать наружу Кодирующий ТКВ 49 гибридный ген содержал в переходной области между областью токсина и робластью оригинальную последовательность расщепления (с) (-Pro - Pro ', Ata - Pro -) для игазы Напротив, в ген для ТкВ59 вводили искусственный ДНК - фрагмент, состоящий из олигонуклеотидов ТкООб и ТкОО7 между ограничительными точками пересечения EcoRI и Sactl, который кодировал последовательность расщепления (-Pro - Pro ' Thr - Pro -) (см фиг 3) Если неповрежденные бактерии, которые несли такие сцепленные с их поверхностью слияния протеинов, инкубировали с очищенной игазой, том можно было наблюдать специфическое расщепление на точках пересечения игазы В иммунных анализах было показано, что появляющиеся при расщеплении небольшие фрагменты расщепления по своему размеру и по реакции с антисывороткой соответстсвовали природному холератоксину В нижней части Пример 9 Очищение активной игазы из надосадочных жидкостей культуры рекомбинантных Е coli - клеток 11 27365Рекомбинантные Е. coli C600 - клетки, которые содержат плазмиду рЕХ1070 (патент ФРГ 3622221.6) с модифицированным геном IgA - протеазы, выделяют активную игазу в надосадочную жидкость культуры. Фильтрованием через мембрану можно было накапливать фермент в надосадочной жидкости культуры и затем осаждать из раствора сульфатом аммония (0.42 г/мл). После центрифугирования осадок растсворяли в Биорекс-буферном растворе (50 ммол фосфата калия, рН 7,0, 8,6% глицерина) (1 мл буферного раствора на 1 литр надосадочиой жидкости культуры), уравновешивали диализом относительно 2 литров буферного раствора и затем подвергали катионообменной хроматографии (Биорекс 70). Связанную IgA - протеазу в одной стадии элюировали отмывающим буферным раствором (500 ммоп фосфата калия, рН 7,0, 8,6% глицерина) с колонки и фракционировали. Затем содержащие IgA - протеазу фракции анализировали электрофорезом на SDS-полиакриламид-геле (12,5%). В этой точке очистки получали среднюю степень чистоты > 90%. Для получения игазы в чистой форме осуществляли гельфильтрацию с Сефакрилом HR300 в Биорекс-буферном растворе, сопровождаемую последующей катионообменной хроматографией (см. выше). Активность игазы проверяли инкубированием с IgA - актителами и разделением образующихся продуктов расщепления в - полиакриламидгеле. Пример 10. Конструирование плазмиды для экспрессии не содержащего метионина интерлейкина 3: Конструирование осуществляют с применением носителя экспрессии pPzO7 - mglac (WO 88/09373). Для этого носитель экспрессии pPzO7 mgllac расщепляют при помощи NC01 и выступающие концы удаляют с Mung benn - нуклеазой. Затем дополнительно расщепляют носитель с BamHi. Оптимированную аминоконцевую область слитого протеина получают на уровне ДНК через следующие олигонуклеотиды: Первичный IA: 5'AATTCGGAGGAAAAATTAATGAAAGCCAA ACGTTTTAAAAAACATGTCGACCATGGAG 3' Первичный IB: 5'GGATCCTCCATGGTCGACATG I ГI I I IAA AACGTTTGGCTTTCATTAAIІ I I ICCTCCGAATT3' Оба олигонуколеотида добавляют вместе в эквимолярных количествах и вводят приблизи-ельно в 100-кратном избытке в расщепленный, ;ак описано выше, носитель PpzO7 - mgllac. После юревяэывания сделанные обычным путем компеентными клетки Е. Coli K12 трансформируют. Изустными методами выделяют из клеток ДНК, расцепляют при помощи Sall/BamHl и перевязывают ДНК - фрагментом, который содержит кодируюдую область интерлейкина 3 без сигнальной поседовательности (описано ниже). Получение кодирующей области интерлей«іна 3 с областью распознавания для IgA - провазы на уровне ДНК осуществляют через известую технику PCR, причем проводят PCR - реакцию с - ДНК интерлейкина 3 в качестве шаблона и с ижеописа иными первичными: Первичный 2А: 5'AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCC CATGACCCAGACAACGCCC 3' Первичный 2ЕЗ: 5'TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCGAGGC TCAAAGT 3' Получающийся PCR - фрагмент дополнительно перерезают ферментами Sal 1 и BamHi и его можно вставлять непосредственно в вышеописанный носитель ДНК и связывать ковалентно при помощи лигазы. После трансформации ДНК в соответствующего хозяина, например Е. coli. K12 С600, можно синтезировать 11 3 в В. coli в форме Rb'S и затем выделять. Как описано для G - CSF, осуществляют денатурирование и ренатурирование протеина и расщепляют ренатурированный протеин при помощи IgA - протеазы. Полученный таким путем не содержащий метионина 113 после дальнейших стадий очистки можно применять для терапии. Пример 11. Конструирование ллазмида для экспрессии не содержащего метиоиина интерлейкина 2 Конструирование можно осуществлять с применением носителя экспрессии pPzO7 - mgllac (WO 88/09373), который после включения первичных IA и IB, как описано в примере 10, расщепляли с Sall/BamHl. Получение кодирующей области интерлейкина 2 с областью распознавания IgA протеазы на уровне ДНК осуществляют методом PCR, причем проводят PCR - реакцию с с-ДНК интерлейкина 2 в качестве шаблона и первичными ЗА и ЗВ. которые так же кодируют область распознавания для IgA - протеазы. Первичный ЗА; 5'AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCAC CTACTTCAAGTTCTACAAAG 3' Первичный ЗВ; 5TTCGTTGGATCCTCAAGTTAGTGTTGAGA TGATGCTTT З1 Полученный таким путем PCR - фрагмент дополнительно перерезают ферментами Sail и BamHi и его можно непосредственно вставлять в вышеописанный носитель ДИК. Дальнейшее происходит, как описано при 113 В предыдущем примере было описано, как соответствующим применением точки распознавания IgA - протеазы и последующим способом можно получать не содержащие метионина терапевтические протеины, которые начинаются с последовательности кислот Ala - Pro. Другие протеины, которые аналогично вышеописанным примерам можно получать без метионина, а именно при применении олигонуклеотидов, которые содержат область распознавания для IgA - протеазы и область, которая по аналогии соответствует 5' или 3' концу опубликованной последовательности и может быть получена через PCR - увеличение. Ниже приведены другие соответствующие терапевтические протеины, которые в зрелой встречающейся в природе форме начинаются с Ala - Pro и поэтому могут быть получены аналогичным образом по способу изобретения. Cathepsin L (ЕС 3.4.22.15), MaSoh, R.W. et al, Biochem. J. 240. 373-377, 1986. Эритропойетин, Lai, P.H. et al. J. Biol. Chem. 261,3116-3121, 1986. 27365 Atnal natnurelic factor, Kambayashi, J e! al, FEBS Lett 259. 341-345, 1990 Другими примерами для протеинов, которые а своей зрелой форме начинаются с Thr - Pro и могут быть соотвєтственио терапевтическими, являются например Complement factor 8, CampeJI R-Det al. Proc Nat Acad Sci 80 4464-4468, 1983 Аполипопротеин A. Eato D L et al, Proc Nat Acad Sci 84 3224 3228, 1987 Интерлейкин - 1 бета, Isebo, К М et al Biood 71, 962-968, 1988 Остеонектин, Fisher, L N et al J Biol Chem 262,9702-9708. 1987 Тип IV коллагеназы, Collier I E el al J Biol, Chem 263. 6579-6587, 1988 Далее, таким путем можно получать протеины, которые в зрелой форме начинаются последовательностью аминокислот Ser, Pro В качестве примера здесь следует назвать Альфа - I антитрипсин, Hill, R Є et al , Nature 311. 175-177, 1984 Ниже приведены данные о депонировании для упомянутого микроорганизма в ~t HS2 TK66 EcoRl Hmdlll 1JAATTCTACTCCACCTCCACGT CCA CCA АСА CCC 2) GATGAGGTCGAGGTGCA GGT GGT T5T GGG GGGCCCGAGACGGCGGGTTTACAAGATCTCTAGA |3) CCCGGGCTCTGCCGCCCAAATGTTCrAGAGATCrTCGA (M Фиг. 1 MS2 CD8 (30-235) FPCD8 P r o — P r o — T h r — P r o — A l a — P r o ------Thr —He ----- A Фиг. 2 QxB (1097-1160) В 63* EcoRI P r o — P r o ----- T h r — P r o AATTCAGCCGCAATTAGTATGGtAAATCCACGT C C A CCA АСА CCG С GTCGGCGTTAATCATACCGTTTAGGTGCA GGT GGT TGT GG Фиг. 3 13 ТК0С6 TK007 27365 Pro - ro P - Pro - Pro — — - Ala - Thr — -Pro — Pro — - (B 49 59 ] Фиг. 4 Тираж 50 екз Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м Ужгород, вул Гагаріна, 101 {03122) 3-72-89 (03122) 2-57-03 14