Виділений поліпептид, кодований геном, подібним до гена ліпази (llg), композиції, що його містять, та способи їх використання

УКРАЇНА (19) UA (11) 75319 (13) C2 (51) МПК (2006) C12N 9/20 (2006.01) C12N 15/52 C07K 16/40 A61K 38/46 (2006.01) МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) ВИДІЛЕНИЙ ПОЛІПЕПТИД, КОДОВАНИЙ ГЕНОМ, ПОДІБНИМ ДО ГЕНА ЛІПАЗИ (LLG), КОМПОЗИЦІЇ, ЩО ЙОГО МІСТЯТЬ, ТА СПОСОБИ ЇХ ВИКОРИСТАННЯ C2 (13) 75319 (11) SEQ ID NО: 8 і уявну молекулярну масу близько 68 кДа за результатами електрофорезу в 10% ДСНПААГ. 5. Виділений поліпептид за пп. 1-4, де вказаний поліпептид має активність фосфоліпази А. 6. Виділений поліпептид за п. 1, де вказаний виділений поліпептид має амінокислотну послідовність SEQ ID NО: 6 і уявну молекулярну масу близько 40 кДа за результатами електрофорезу в 10% ДСНПААГ. 7. Виділений поліпептид за пп. 1-6, де вказаний поліпептид походить від людини. 8. Композиція, що містить поліпептид за пп. 1-7 і біологічно сумісний розчин. 9. Фармацевтична композиція, що містить поліпептид за пп. 1-7 і фармацевтично прийнятний носій. 10. Антигенний фрагмент виділеного поліпептиду за пп. 1-7, що містить послідовність SEQ ID NO: 16. 11. Виділена нуклеїнова кислота, що кодує поліпептид за пп. 1-7. 12. Виділена нуклеїнова кислота за п. 11, якою є кДНК. 13. Виділена нуклеїнова кислота за п. 12, де вказану нуклеотидну послідовність вибирають із групи, що включає SEQ ID No: 5, 7 і 9. 14. Виділена нуклеїнова кислота за п. 13, що включає нуклеотиди 252-1754 SEQ ID NО: 7. 15. Виділена нуклеїнова кислота, яка гібридизується з нуклеїновою кислотою, що має послідовність, вибрану з групи, що включає SEQ ID NО: 3, 5 і 7 за умов, при яких така гібридизована нуклеїнова кислота здатна витримувати промивання в умовах високої жорсткості: 0,1*SSC, 0,5% ДСН при 68оС. 16. Виділена нуклеїнова кислота за п. 15, яка включає 20 нуклеотидів. 17. Виділена нуклеїнова кислота за п. 15, яка є антисмисловою нуклеїновою кислотою. 18. Виділена нуклеїнова кислота за п. 17, де вказана антисмислова послідовність нуклеїнової кислоти оперативно зшита з областю, що регулює експресію гена. UA (21) 99073794 (22) 05.12.1997 (24) 17.04.2006 (86) PCT/US97/22331, 05.12.1997 (31) 60/032,254 (32) 06.12.1996 (33) US (31) 60/032,783 (32) 06.12.1996 (33) US (46) 17.04.2006, Бюл. № 4, 2006 р. (72) Джей Майкл К., US, Доан Кім-Анх Тхі, US, Кравік Джон А., US, Лінч Кевін Дж., US, Амін Діліп В., US, Саут Вікторія Дж., US (73) АВЕНТІС ФАРМАСЬЮТІКАЛЗ ІНК., US (56) VAN TILBEURGH ET AL.: "Lipoprotein Lipase" J. Biol. Chem., vol. 269, 1994, pages 4626-4633. COOPER D.A. ET AL.: "The structure and the complete nucleotide sequence of the avian lipoprotein lipase gene" BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA, vol. 1129, 1992, pages 166-171 (57) 1. Виділений поліпептид, кодований геном, подібним до гена ліпази (LLG), де вказаний поліпептид (a) зв'язується з гепарином; (b) має гомологію з ліпопротеїдліпазою і ліпазою печінки людини; і (c) включає каталітичний домен масою 39 кДа сімейства триацилгліцеролліпаз, що має SEQ ID NO: 10, де вказаний поліпептид містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8. 2. Виділений поліпептид за п. 1, де вказаний каталітичний домен масою 39 кДа сімейства триацилгліцеролліпаз має амінокислотну послідовність SEQ ID NО: 10. 3. Виділений поліпептид за п. 1, де вказаний виділений поліпептид має амінокислотну послідовність SEQ ID NО: 8 і уявну молекулярну масу близько 55кДа. 4. Виділений поліпептид за п. 1, де вказаний виділений поліпептид має амінокислотну послідовність 2 (19) 1 3 75319 4 19. Виділена нуклеїнова кислота за п. 15, що гіб36. Антитіло за п. 33 або 34, яке є поліклональним ридизується в умовах високої жорсткості з мішенантитілом. ню, вибраною з групи, що складається з нуклеоти37. Гібридомна клітина, яка продукує антитіло за п. дів 44-79 SEQ ID NО: 3 і нуклеотидів 1036-1065 35.38. Композиція, що містить антитіло за пп. 33SEQ ID NО: 5. 36 і біологічно сумісний розчин. 20. Композиція, що містить нуклеїнову кислоту за 39. Фармацевтична композиція, яка містить антип. 17 і біологічно сумісний розчин. тіло за пп. 33-36 і фармацевтично прийнятний но21. Фармацевтична композиція, яка містить нуклесій. їнову кислоту за п. 17 і фармацевтично прийнят40. Спосіб скринінгу для виявлення агоністів або ний носій. антагоністів LLG-активності, що передбачає: 22. Вектор, що містить виділену нуклеїнову кисло(a) контактування потенційних агоністів або антату за пп. 11-14, оперативно зшиту з регуляторною гоністів з LLG і субстратом LLG, і ділянкою. (b) вимірювання здатності потенційних агоністів 23. Вектор за п. 22, де вказана регуляторна ділянабо антагоністів підсилювати або інгібувати LLGка отримана з гетерологічного джерела. активність, де вказаним LLG є поліпептид за п. 1. 24. Вектор за п. 22 або 23, що є вірусним векто41. Спосіб ферментативного гідролізу складного ром. ефіру фосфатидилхоліну, що передбачає контак25. Вектор за п. 24, що є аденовірусним вектором. тування вказаного складного ефіру фосфатидил26. Рекомбінантна клітина-хазяїн, що містить векхоліну з поліпептидом за пп. 1-5. тор за пп. 22-25. 42. Спосіб поліпшення ліпідного профілю в сиро27. Рекомбінантна клітина за п. 26, де вказаною ватці людини або тварини, що має небажаний ліклітиною є еукаріотична клітина. підний профіль, де вказаний спосіб передбачає 28. Рекомбінантна клітина за п. 27, де вказаною введення ефективної кількості фармацевтичної клітиною є клітина COS-7. композиції за п. 9 або 21. 29. Композиція, що містить вектор за пп. 22-25 і 43. Спосіб поліпшення ліпідного профілю в сиробіологічно сумісний розчин. ватці людини або тварини, що має небажаний лі30. Фармацевтична композиція, що містить вектор підний профіль, де вказаний спосіб передбачає за пп. 22-25 і фармацевтично прийнятний носій. введення ефективної кількості фармацевтичної 31. Спосіб одержання поліпептиду за п.1, що пекомпозиції за п. 39. редбачає культивування рекомбінантних клітин за 44. Виділений поліпептид за п. 1, де вказаний попп. 26-28, в умовах, які сприяють експресії вказаліпептид походить від кролика. ного поліпептиду. 45. Виділений поліпептид за п. 44, що має аміно32. Поліпептид за п.1, одержаний способом за кислотну послідовність SEQ ID NО: 12. п.31. 46. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує полі33. Антитіло, здатне специфічно зв'язуватися з пептид за п. 45. поліпептидом за пп. 1-7 або 32. 47. Нуклеїнова кислота за п. 46, яка має послідов34. Антитіло, здатне специфічно зв'язуватися з ність нуклеїнової кислоти SEQ ID NО: 11. поліпептидом за п. 5 і нейтралізувати фосфоліпа48. Трансгенна миша, яка експресує поліпептид за зну активність цього поліпептиду. пп. 1-5. 35. Антитіло за п. 33 або 34, яке є моноклональним антитілом. Ця заявка претендує на переваги двох одночасно поданих попередніх заявок 60/032254 та 60/032783, поданих 6 грудня 1996р. Цей винахід належить до поліпептидів сімейства триацилгліцерол-ліпаз, до нуклеїнових кислот, що кодують указані поліпептиди, до антизмістовних послідовностей, похідних указаних нуклеїнових кислот та до антитіл проти указаних поліпептидів. Цей винахід належить також до одержання указаних поліпептидів з використанням рекомбінантних технологій та до використання указаних поліпептидів для скринінгу з метою виявлення агоністів або антагоністів указаних поліпептидів. Цей винахід належить також до способів терапевтичного використання таких поліпептидів та послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують указані поліпептиди, в фармацевтичних композиціях, які включають композиції для генної терапії та композиції для лікування порушень метаболізму ліпідів і ліпопротеїнів. А) Ліпіди Ліпіди являють собою нерозчинні в воді органічні біологічні молекули, які є неодмінними учасниками різноманітних біологічних функцій, які включають накопичення, транспорт та метаболізм енергії, а також відіграють важливу роль для структури та плинності мембрани. Ліпіди, що містяться в організмі людини та інших тварин, утворюються з двох джерел: деякі ліпіди поступають з харчовими жирами та маслами, а інші ліпіди біологічно синтезуються організмом людини або тварини. У ссавців, принаймні, 10% від маси їх тіла складають ліпіди, більшість з яких присутні в формі триацилгліцеринів. Триацилгліцерини, відомі також як тригліцериди або триацилгліцериди, складаються з трьох жирних кислот, етерифікованих гліцерином. Харчові триацилгліцериди накопичуються в жирових 5 75319 6 тканинах як джерела енергії або гідролізуються в 81, 561-568; , Goldberg, I.J., Le, N., Paterniti J.R., травному тракті триацилгліцерол-ліпазами, з яких Ginsberg, H.N., Lindgren, FT. & Brown, W.V. (1982) найважливішою є панкреатична ліпаза. ТриацилгJ. Clin. Invest., 70, 1184-1192; Hide, W.A., Chan, L, & ліцерини транспортуються між тканинами в формі Li, W.-H. (1992) J. Lipid. Res. 33, 167-178]. Панкреліпопротеїнів. атична ліпаза відповідальна, головним чином, за Ліпопротеїни являють собою міцелоподібні гідроліз харчових ліпідів. Були описані варіанти структури, які знаходять в плазмі та які містять панкреатичної ліпази, але їх фізіологічна роль не варіювальні співвідношення різних типів ліпідів і була визначена [Giller, Т., Buchwald, P., Blumбілків (які називають апопротеїнами). Є п'ять осKaelin, D., & Hunziker, W. (1992) J. Biol. Chem., 267, новних класів ліпопротеїнів плазми, головною фу16509-16516]. Ліпопротеїн-ліпаза є головним фернкцією яких є транспорт ліпідів. Такими класами є, ментом, відповідальним за розподіл та утилізацію в порядку зростання густини: хіломікрони, ліпопротригліцеридів в організмі. Ліпопротеїн-ліпаза гідтеїни дуже низької густини (ЛДНГ), ліпопротеїни ролізує тригліцириди як в складі хіломікронів, так і проміжної густини (ЛПГ), ліпопротеїни низької гусв виді ЛДНГ. Ліпаза печінки гідролізує тригліцеритини (ЛНГ) та ліпопротеїни високої густини (ЛВГ). ди з утворенням ЛПГ та ЛВГ, і є відповідальною за Хоч кожен клас ліпопротеїнів включає в себе багаремоделювання ліпопротеїнів. Ліпаза печінки тато типів ліпідів, однак, кожен клас транспортує кож діє як фосфоліпаза та гідролізує фосфоліпіди переважно один тип ліпідів: триацилгліцерини, що з утворенням ЛВГ. описані вище, транспортуються в складі хіломікроФосфоліпази відіграють важливу роль в катанів, ЛДНГ та ЛПГ; тоді, як фосфоліпіди та складні болізмі та ремодулюванні фосфоліпідного компоефіри холестерину транспортуються в складі ЛВГ нента ліпопротеїнів і фосфоліпідів мембран. Фоста ЛНГ, відповідно. фоліпази також відіграють певну роль в Фосфоліпіди являють собою складні ефіри вивільненні арахідинової кислоти з наступним двохосновної жирної кислоти та гліцеринфосфату, утворенням простагландинів, лейкотриєнів та інякі також містять полярну групу, що зв'язана з фоших ліпідів, які беруть участь в ряді запальних сфатом. Фосфоліпіди є важливими структурними процесів. компонентами клітинних мембран. Фосфоліпіди Поліпептиди ліпази, що кодуються генами лігідролізуються ферментами, які називаються фопази, мають послідовність довжиною приблизно до сфоліпазами. Фосфатидилхолін, типовий фосфо450 амінокислот з пептидами лідерної сигнальної ліпід, є головним компонентом мембран більшості послідовності для полегшення секреції. Білки ліпаеукаріотичних клітин. зи складаються з двох головних доменів [Winkler, Холестерин являє собою метаболічний попеK., D'Arcy, A., & Hunziker, W. (1990) Nature, 343, редник стероїдних гормонів та жовчних кислот і є 771-774]. Аміно-кінцевий домен містить каталітичтакож основним компонентом клітинних мембран. ний центр, а карбокси-кінцевий домен, очевидно, У людини та інших тварин, холестерин поступає з відповідальний за зв'язування з субстратом, приєїжею, а також синтезується печінкою та іншими днання кофактора та взаємодію з клітинними ретканинами. Холестерин транспортується між ткацепторами [Wong, H., Davis, R.C., Nikazy, J., нинами в формі складних ефірів холестерину, які Seebart, K.E., & Schotz, M.C. (1991) Proc. Natl. входять до складу ЛНГ та інших ліпопротеїнів. Acad. Sci. USA 88, 11290-11294; van Tilbeurgh, H., Кожна жива клітина оточена мембранами, які Roussel, A., Lalouel, J.-M., & Cambillau, С (1994) J. служать бар'єром між внутрішньоклітинними та Biol. Chem. 269, 4626-4633; Wong, H., Davis, R.C., позаклітинними компартментами. Мембрани також Thuren, Т., Goers, J.W., Nikazy, J., Waite, M., & оточують ядро еукаріотичної клітини, входять до Schotz, M.C. (1994) J. Biol. Chem. 269, 10319складу ендоплазматичного ретикулуму та здійс10323; Chappell, DA, Inoue, I., Fry, G.L., Pladet, нюють спеціальні функції, такі як функції в мієліноM.W., Bowen, S.L, Iverius, P.-H., Lalouel, J.-M. & вій оболонці, що оточує аксони. Типова мембрана Strickland, D.K. (1994) J. Biol. Chem., 269, 18001містить біля 40% ліпіду та 60% білка, але є і істотні 18006]. Загальний рівень амінокислотної гомології варіації. Головними ліпідними компонентами є між членами цього сімейства складає 22-65%, при фосфоліпіди, зокрема, фосфатидилхолін та фосцьому, є локальні ділянки високої гомології, що фатидилетаноламін, і холестерин. Фізико-хімічні відповідають структурній гомології, яка пов'язана з властивості мембран, такі як плинність, можуть ферментативною функцією. бути змінені шляхом модифікації або профілів жиПриродна ліпопротеїн-ліпаза (LPL) глікозилорних кислот, які входять до складу фосфоліпідів, вана і це глікозилування необхідне для LPLабо вмісту холестерину. Модуляція складу та ферментативної активності [Semenkovich, С.F., структури мембранних ліпідів також призводить до Luo, С.-С, Nakanishi, M.K., Chen, S.-H., Smit, L.C., & модуляції мембрано-асоційованих клітинних фунChan, L. (1990) J. Biol. Chem., 265, 5429-5433]. В кцій, таких як, рецепторна активність, ендоцитоз та ліпазі печінки та ліпопротеїн-ліпазі присутні два надходження холестерину. сайти N-глікозилування, а в панкреатичній ліпазі В) Ферменти присутній один сайт N-глікозилування. Крім того, Триацилгліцерол-ліпази являють собою сімейчотири групи цистеїнів утворюють дисульфідні ство ферментів, що відіграють декілька ключових містки, які мають важливе значення в зберіганні ролей в метаболізмі ліпідів в організмі. Були опиструктурної цілісності для забезпечення ферменсані три члени сімейства триацилгліцерол-ліпаз: тативної активності [Lo, J.-Y., Smith, L.C., & Chen, панкреатична ліпаза, ліпопротеїн-ліпаза та ліпаза L. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, печінки [Goldberg, I.J., Le, N.-A., Ginsberg, H.N., 266-271; Brady, L, Brzozowski, A.M., Derewenda, Krauss, R.M., & Lindgren, FT. (1988) J. Clin. Invest., 2.S., Dodson, E., Dodson, G., Tolley, S., Turkenburg, 7 75319 8 J.P., Christiansen, L, Huge-Jensen В., Norskov, L, 1,7 та 1,8 тисяч пар основ, відповідно. Два мРНКThim, L, & Menge, U. (1990) Nature, 343, 767-770]. транскрипти довжиною 3,6 та 3,2 тисяч пар основ Члени сімейства триацилгліцерол-ліпаз мають транскрибуються з гена ліпопротеїн-ліпазу людиряд загальних консервативних структурних особни. Ці два транскрипти використовують альтерналивостей. Однією з таких особливостей є мотив тивні сигнали поліаденілування та відрізняються «GXSXG», в якому центральний сериновий зализа ефективністю своєї трансляції [Ranganathan, G., шок є одним з трьох залишків, що складають «каOng, J.M., Yukht, A., Saghizadeh, M., Simsolo, R.B., талітичну тріаду» [Winkler, К., D'Arcy, A., & Pauer, A., & Kern, P.A. (1995) J. Biol. Chem., 270, Hunziker, W. (1990) Nature, 343, 771-774; 7149-7155]. Faustinella, F., Smith, L.C., & Chan, L. (1992) С) Фізіологічні процеси Biochemistry, 31, 7219-7223]. Інші залишки каталіМетаболізм ліпідів здійснюється шляхом взатичної тріади складають консервативні аспартатні ємодії ліпідів, апопротеїнів, ліпопротеїнів та ферта гістидинові залишки. Коротка ділянка з 19-23 ментів. амінокислот (ділянка «кришки») утворює амфіпаЛіпаза печінки та ліпопротеїн-ліпаза являють тичну спіральну структуру та покриває каталітичсобою багатофункціональні білки, які опосередконий «карман» ферменту [Winkler, К., D'Arcy, А., & вують зв'язування, утилізацію, катаболізм та реHunziker, W. (1990) Nature, 343, 771-774]. Ця ділямоделювання ліпопротеїнів і фосфоліпідів. Ліпопнка відрізняється у різних членів цього сімейства, ротеїн-ліпаза та ліпаза печінки функціонують а недавно було встановлено, що ця ділянка перешляхом зв'язування з люмінальною поверхнею дає ферменту субстратну специфічність [Dugi, ендотеліальної клітини в периферичних тканинах і К.А., Dichek H.L., & Santamarina-Fojo, S. (1995) J. в печінці, відповідно. Обидва ці ферменти беруть Biol. Chem., 270, 25396-25401]. Порівняння ліпази участь в зворотному транспорті холестерину, який печінки та ліпопротеїн-ліпази показало, що різниця полягає в переносі холестерину з периферичних в активностях триацилгліцерол-ліпази та фосфотканин в печінку або для екскреції з організму, або ліпази опосередкована, почасти даною ділянкою для повторного метаболічного циклу. Відомо, що «кришки» [Dugi, K.A., Dichek H.L., & Santamarinaгенетичні дефекти як ліпази печінки, так і ліпопроFojo, S. (1995) J. Biol. Chem., 270, 25396-25401]. теїн-ліпази викликають спадкові порушення метаТриацилгліцерол-ліпази мають різні ступені болізму ліпопротеїну. Дефекти в метаболізмі ліпогепарин-зв'язуючої активності. Ліпопротеїн-ліпаза протеїнів призводять до серйозних метаболічних має найвищу спорідненість до гепарину, та, у відрозладів, включаючи гіперхолестеринемію, гіперповідності до проведеного картування, ця ділянка ліпідемію та атеросклероз. зв'язуючої активності простягається до позитивно Атеросклероз являє собою комплексне полізаряджених залишків в аміно-кінцевому домені генне захворювання, яке, з гістологічного погляду, [Ma, Y., Henderson, H.E., Liu, M.-S., Zhang, H., визначається як відкладання (ліпідні або фіброліForsythe, I.J., Clarke-Lewis, I., Hayden, M.R., & підні бляшки) ліпідів та інших похідних крові на Brunzell, J.D., J. Lipid Res., 35, 2049-2059]. Локалістінках кровоносних судин, особливо великих арзація ліпопротеїн-ліпази на поверхні ендотеліальтерій (в аорті, коронарній артерії, сонній артерії). ної клітини [Cheng, C.F., Oosta, G.M., Bensadoun, Ці бляшки, що є більш або менш кальцифікованиA., & Rosenberg, R.D. (1981) J. Biol. Chem., 256, ми у відповідності до стадії атеросклеротичного 12893-12896], опосередкується, головним чином, процесу, можуть бути пов'язані з ураженнями та через зв'язування з поверхневими протеогліканаасоціюватися з акумуляцією в кровоносних судими [Shimada, К., Gill, P.J., Silbert, J.E., Douglas, нах жирових відкладень, які складаються в основW.H.J., & Fanburg, B.L (1981) J. Clin. Invest, 68, ному зі складних ефірів холестерину. Ці бляшки 995-1002; Saxena, U., Klein, M.G., & Goldberg, I.J., супроводжуються потовщенням стінки кровоносної (1991) J. Biol. Chem., 226, 17516-17521; Eisenberg, судини, гіпертрофією гладенької мускулатури, поS., Sehayek, E., Olivecrona, Т., & Vlodavsky, I. явою «пінистих» клітин (навантажених ліпідом клі(1992) J. Clin. Invest., 90, 2013-2021]. Саме ця зв'ятин, які утворюються в результаті нерегульованого зуюча активність дозволяє ферменту прискорювапоглинання холестерину «рекрутованими» макроти поглинання ЛНГ, діючи як місток між ЛНГ та фагами) та акумуляцією фіброзної тканини. Атеклітинною поверхнею [Mulder, M., Lombardi, P., роматозні бляшки помітно виступають на стінці Jansen, Н., van Berkel, T.J., Frants R.R., & Havekes, судини, що надає їм стенозувальних властивосL.M. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 185, тей, які є відповідальними за оклюзію судин унас582-587; Rutledge, J.C., & Goldberg, I.J. (1994) J. лідок атероми, тромбозу або емболії, що розвиваLipid Res. 35. 1152-1160; Tsuchiya, S., Yamabe, M., ються у тих пацієнтів, які найбільш сприйнятливі Yamaguchi, Т., Kobayashi, Y., Konno, Т., & Tada, K. до цих уражень. Вказані ураження можуть призво(1980) Int. J. Cancer. 26, 171-176]. дити до серйозних серцево-судинних патологій, Відомо, що як ліпопротеїн-ліпаза, так і ліпаза таких як, інфаркт, раптова смерть, серцева недопечінки функціонують в поєднанні з білками коакстатність та інсульт. тиваторами: аполіпопротеїном СП для ліпопротеРоль триацилгліцерол-ліпаз в судинних патоїн-ліпази та коліпазою для панкреатичної ліпази. логіях, таких як, атеросклероз, є об'єктом інтенсиГенетичні послідовності, що кодують панкреавного дослідження [див., огляд G., & Olivecrona, G., тичну ліпазу, ліпазу печінки та ліпопротеїн-ліпазу & Olivecrona, T. (1995) Curr. Opin. Lipid 6, 291-305]. людини, описані в літературі (Genbank, реєстраВ основному дія триацилгліцерол-ліпаз є, очевидційні номери М93285, J03540 і М15856, відповідно, антиатерогенною, оскільки ці ферменти знино). Інформаційні РНК ліпази печінки та панкреажують рівень триацилгліцерину в сироватці та тичної ліпази людини мають довжину приблизно стимулюють утворення ЛВГ. Трансгенні тварини, 9 75319 10 які експресують ліпопротеїн-ліпазу або ліпазу пета має уявну молекулярну масу біля 40кДа на 10% чінки людини, виявляли занижений рівень тригліДСН-ПААГ-гелі. церидів в плазмі та підвищений рівень ліпопротеїКрім того, цей винахід належить до антигеннонів високої густини (ЛВГ) [Shimada, M., Shimano, го фрагменту LLG-поліпептиду. H., Gotoda, Т., Yamamoto, К., Kawamura, М., Inaba, В іншому своєму аспекті, цей винахід налеТ., Yazaki, Т., & Yamada, N. (1993) J. Biol. Chem. жить до виділеної нуклеїнової кислоти, що кодує 268, 17924-17929; Liu, M.-S., Jirik, F.R., LeBoeuf, поліпептид та має указану вище послідовність. R.C., Henderson, H., Castellani, L.M., Lusis, A. J., В іншому своєму аспекті, цей винахід налеMa, Y., Forsythe, I.J., Zhang, H., Kirk, E., Brunzeil, жить до вектора, що включає вищевказану нуклеїJ.D., & Hayden, M.R. (1994) J. Biol. Chem. 269, нову кислоту, що кодує указаний поліпептид, та 11417-11424]. Було встановлено, що люди з генеправильно приєднана до регуляторної ділянки, тичними дефектами, що призводять до зниження такої як промотор. рівня ліпопротеїн-ліпазної активності, схильні до В іншому своєму аспекті, цей винахід налегіпертригліцеридемії, але без підвищеного ризику жить до рекомбінантної клітини, яка включає укавиникнення ішемічної хвороби серця. Повідомлязаний вище вектор. лось, що це зумовлено відсутністю продукування В іншому своєму аспекті, цей винахід налеатерогенних ліпопротеїнів проміжних розмірів, які жить до способу одержання поліпептиду, який пеможуть акумулюватися в субендотеліальному редбачає культивування рекомбінантних клітин, просторі [Ziiversmit, D.B. (1973) Circ. Res. 33, 633що містять нуклеїнову кислоту, яка кодує указаний 638]. поліпептид, в умовах, що сприяють експресії укаОднак, було висловлене припущення, що в заного поліпептиду. локалізованій ділянці атеросклеротичного ураженВ іншому своєму аспекті, цей винахід наленя, підвищений рівень ліпазної активності прискожить до антитіла, що здатне специфічно зв'язуварює атерогенний процес хZiiversmit, D.B. (1995) тися з поліпептидами цього винаходу та/або нейтClin. Chem. 41, 153-158; Zambon, A., Torres, A., ралізувати біологічну активність цих поліпептидів. Bijvoet, S., Gange, С, Moojani, S., Lupien, P.J., Дійсно, додаткова властивість поліпептиду цього Hayden M.R., & BrunzeІl, J.D. (1993) Lancet 341, винаходу полягає в тому, що він специфічно зв'я1119-1121]. Це може бути обумовлено збільшензується з антитілом цього винаходу, тобто з антиням зв'язування та поглинання ліпопротеїнів сутілом, яке є специфічним відносно LLGдинною тканиною, що опосередковане ліпазами поліпептиду. [Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, Т., В іншому своєму аспекті, цей винахід налеVlodavsky, I. (1992) J. Clin. Invest. 90, 2013-2021; жить до композиції, яка містить поліпептид, нуклеTabas, I., Li, I., Brocia R.W., Xu, S.W., Swenson, T.L, їнову кислоту, вектор, антизмістовну нуклеїнову Williams, K.J. (1993) J. Biol. Chem. 268, 20419кислоту або антитіло цього винаходу та фармаце20432; Nordestgaard, B.G., & Nielsen, A.G. (1994) втично прийнятний носій. Curr. Opin. Lipid. 5, 252-257; Williams, K.J., & Tadas, В іншому своєму аспекті, цей винахід налеI. (1995) Art. Thromb. And Vase. Biol. 15, 551-561). жить до способу скринінгу з метою виявлення агоКрім того, високий локальний рівень ліпазної актиністів або антагоністів ферментативної активності, вності може призводити до цитотоксичних рівнів яку мають поліпептиди цього винаходу, де указажирних кислот та лізофосфатидилхоліну, який ний спосіб передбачає контактування потенційних продукується в попередниках атеросклеротичних агоністів або антагоністів з указаними поліпептиуражень. дами та їх субстратом, і вимірювання здатності Не дивлячись на появу великої кількості відопотенційних агоністів або антагоністів підсилювати мостей, що до ролі, яку відіграє ліпазна активність або інгібувати цю активність. в ліпідному гомеостазі, однак, необхідність в іденВ іншому своєму аспекті, цей винахід налетифікації додаткових генів, що кодують білки та жить до способу ферментативного гідролізу скларегулюють ліпідний метаболізм, залишається акдного ефіру фосфатидилхоліну, який передбачає туальною. контактування указаного складного ефіру фосфаЦей винахід належить до виявлення гена, потидилхоліну з поліпептидом цього винаходу. дібного до гена ліпази (LLG), до поліпептидних В іншому своєму аспекті, цей винахід налепродуктів експресії цього гена, а також до компожить до способу лікування людини або тварини з зицій і до способів їх використання. LLGметою покращання профілю вмісту ліпідів в сирополіпептид зв'язується з гепарином, має гомологію ватці даної людини або тварини, що мають небаз ліпопротеїн-ліпазою та ліпазою печінки людини і жаний ліпідний профіль, де указаний спосіб певключає каталітичний 39кДа-домен сімейства триредбачає введення ефективної кількості ацилгліцерол-ліпаз. В іншому варіанті здійснення композиції цього винаходу. винаходу, цей поліпептид має активність фосфоВ іншому своєму аспекті, цей винахід налеліпази А. жить до способу лікування або попередження атеЦей винахід належить до виділеного поліпепросклерозу у людини або тварини, що передбачає тиду, що містить послідовність SEQ ID No: 10. введення даній людині або тварині ефективної Крім того, цей винахід належить до виділеного кількості композиції цього винаходу. поліпептиду, що містить послідовність SEQ ID No: Інші аспекти та переваги цього винаходу, крім 8 та має уявну молекулярну масу біля 55кДа або того, проілюстровані на рисунках та в детальному 68кДа на 10% ДСН-ПААГ-гелі. описі переважних варіантів його здійснення. Цей винахід належить також до виділеного поНа Фіг.1 показані послідовності (SEQ ID No: ліпептиду, що містить послідовність SEQ ID No: 6 17-31) праймерів, що використані для експеримен 11 75319 12 тальних PCR-ампліфікацій. середовища від клітин COS-7, корткочасно трансНа Фіг.2 показана нуклеотидна послідовність фікованих експресуючим вектором, що містить (SEQ ID No: 1) та виведена амінокислотна послікДНК для LLGN або LLGXL, або не містить ДНК довність (SEQ ID No: 2) продукту RT-PCR-реакції (Контроль). Білки від РМА-стимульованих ендоте(що проводиться методом диференційного відоліальних клітин (НСАЕС + РМА) були включені для браження), що містить кДНК ген, подібний до гена порівняння розмірів. Цифри зліва позначають уявліпази. Послідовності, які відповідають двом прайну молекулярну масу основних імунореактивних мерам, що використовуються при ампліфікації, білків, визначену шляхом порівняння з білкамипідкреслені. Стоп-кодон та сигнал поліаденілуванстандартами. ня виділені рамкою. Мотиви GAATTC та фланкуюНа Фіг.13 показана послідовність PCRча послідовність є похідними вектора pCRII, в який продукту кролячого LLG (RLLG, SEQ ID No: 12) та був клонований цей продукт. порівняння первинних послідовностей PCRНа Фіг.3 показана нуклеотидна послідовність продукту кролячого LLG та відповідної послідов(SEQ ID No: 3) та виведена амінокислотна посліності кДНК людини (LLG7742A). Ідентичні нуклеодовність (SEQ ID No: 4) 5'RAСЕ-подовження кДНК тиди заштиховані. для LLG. Послідовності, які відповідають двом На Фіг.14 проілюстрована фосфоліпазна (А) праймерам, що використовуються при ампліфікаактивність LPL, LLGN та LLGXL з використанням ції, підкреслені. Мотиви GAATTC та фланкуюча фосфатидилхолінового субстрату. послідовність є похідними вектора pCRII, в який На Фіг.15 проілюстрована фосфоліпазна (А) був клонований цей продукт. активність LPL, LLGN та LLGXL з використанням На Фіг.4 показана послідовність (SEQ ID No: 7) триолеїнового субстрату. кДНК, що містить повну відкриту рамку зчитування На Фіг.16 показана гібридизація LLG- та LRLгена, подібного до гена ліпази, LLGXL. Стартзондів для геномних ДНК, які походять від різних кодон (ATG) та стоп-кодон (TAG) виділені рамкою. видів. Dra1-сайт (ТТТААА) та Srf1-сайт (GCCCGGGC), Цей винахід належить до виявлення гена, пощо використані при конструюванні експресуючих дібного до гена ліпази (LLG), та до поліпептидних векторів, підкреслені. продуктів його експресії. Ці поліпептидні продукти, На Фіг.5 показана виведена амінокислотна почлени сімейства триацилгліцерол-ліпаз, містять слідовність (SEQ ID No: 8) білка LLGXL. Передбакаталітичний домен приблизно 39кДа, характерний чувана сигнальна послідовність підкреслена. для сімейства триацилгліцерол-ліпаз, наприклад, На Фіг.6 показане порівняння первинних посякий має послідовність SEQ ID No: 10. В одному зі лідовностей членів сімейства генів триацилгліцесвоїх варіантів, цей винахід належить до поліпепрол-ліпаз (SEQ ID No:13-15). Заштриховані залиштиду LLGN, що має 354 амінокислоти. В своєму ки ідентичні білкові LLGXL (SEQ ID No: 8). Прориви іншому варіанті, цей винахід належить до поліпепбули введені в послідовності для максимізації потиду LLGXL, що містить 500 амінокислот та має рівняння первинних послідовностей з використан43%-ну подібність з ліпопротеїн-ліпазою людини і ням програми CLUSTAL. 37%-ну подібність з ліпазою печінки людини. ПоліНа Фіг.7 показано Нозерн-аналіз мРНК LLG в пептид LLGXL має фосфоліпазну (А) активність. клітинах ТНР-1. Клітини були стимульовані або Авторами цього винаходу була виділена непоРМА, або РМА та окисленим LDL (РМА + окис. вна кДНК з мРНК клітин ТНР-1, які були оброблені LDL). Цифри зліва вказують на положення РНКфорболовим складним ефіром та окисленими стандартів (тисяч пар основ). ЛНГ. Після 5'RACE-подовження цієї неповної На Фіг.8 показано Нозерн-аналіз мРНК з безлікДНК, була виділена трохи менша альтернативно чі тканин людини, зондованих з використанням сплайсована кДНК. Інша більша кДНК була видікДНК LLG, ліпопротеїнліпази (LPL) та бета-актину лена з кДНК-бібліотеки плаценти людини. людини. Положення 4,4т.п.о. - РНК-стандарт укаНозерн-аналіз показав, що ген LLG експресузане зліва від панелів LLG та LРL. ється в ендотеліальних клітинах. Антисироватка, На Фіг.9 показано Нозерн-аналіз експресії LLG продукована проти пептиду, передбаченого вихота LPL в культивованих ендотеліальних клітинах дячи з відкритої рамки зчитування кДНК, дозволита в клітинах ТНР-1 людини. Ці клітини або не ла знайти білки очікуваних розмірів для LLGN та стимулювали (не обробляли РМА), або стимулюLLGXL в кондиціонованому середовищі від кульвали РМА. тивованих ендотеліальних клітин. Оброблення На Фіг.10 показана послідовність імунізуючого ендотеліальних клітин форболовими складними пептиду (SEQ ID No: 16) та його споріднення з поефірами призводить до підвищеного продукування слідовністю білка LLGXL. Цей пептид показано в LLG як на рівні мРНК, так і на рівні білків. Цей бізаштрихованій рамці. Термінальний цистеїн був лок є першим членом сімейства триацилгліцеролвведений шляхом приєднання пептиду до білкаліпаз, який, як було виявлено, експресується енносія. дотеліальними клітинами. На Фіг.11 показано Вестерн-аналіз білків, що А) Визначення концентровані на гепарин-сефарозі, з кондиціоноНижче наводиться визначення термінів, що ваного середовища від культивованих ендотеліавикористовуються в описі цього винаходу, яке мольних клітин. Блот зондували з використанням же бути корисним для розуміння суті та застосуантисироватки проти LLG. Цифри зліва указують вання цього винаходу. на положення білків-стандартів в кілодальтонах. «Поліпептид» являє собою полімерну сполуку, На Фіг.12 показано Вестерн-аналіз на білки, яка складається з ковалентно зв'язаних амінокисзв'язані з гепарин-сефарозою, з кондиціонованого лотних залишків. Амінокислоти мають, таку зага 13 75319 14 або неглікозилованим. «LLG-поліпептид», в основному, належить як до поліпептиду LLGN, так і до поліпептиду LLGXL. LLG-поліпептидом або білком цього винаходу є будь-який аналог, фрагмент, похідна або мутант, що походить від LLG-поліпептиду і який зберігає, принаймні, одну біологічну властивість LLGполіпептиду. В природі існують різноманітні варіанти LLG-поліпептиду. Ці варіанти можуть бути алельними варіантами, які характеризуються відАмінокислоти були поділені на сім груп у відмінностями нуклеотидних послідовностей структуповідності до своїх бічних ланцюгів R: (1) аліфатирного гена, що кодує даний білок, або вони можуть чні бічні ланцюги, (2) бічні ланцюги, що містять відрізнятися за сплайсингом або за постгідроксильну групу (ОН), (3) бічні ланцюги, що містрансляційною модифікацією. Кожен фахівець тять атоми сірки, (4) бічні ланцюги, що містять киможе самостійно одержати варіанти, що мають слотні або амідні групи, (5) бічні ланцюги, що місодну або безліч амінокислотних замін, делецій, тять основні групи, (6) бічні ланцюги, що містять додатків або перестановок. Такими варіантами ароматичне кільце та (7) пролін, амінокислота, в можуть бути, inter alia, (а) варіанти, в яких один якій бічний ланцюг зв'язаний з аміногрупою. або декілька амінокислотних залишки замінені «Білок» являє собою поліпептид, який відіграє консервативними або не консервативними амінопевну структурну або функціональну роль в живій кислотами, (b) варіанти, в яких одна або декілька клітині. амінокислот додані до LLG-поліпептиду, (с) варіаПоліпептиди та білки цього винаходу можуть нти, в яких одна або декілька амінокислот вклюбути глікозилованими або неглікозилованими. чають замінну групу та (d) варіанти, в яких LLGТермін «гомологія» означає подібність посліполіпептид з'єднаний з іншим поліпептидом, таким довностей, яка відображає їх загальне еволюційне як, альбумін сироватки. Іншими LLGпоходження. Вважається, що поліпептиди або білполіпептидами цього винаходу є варіанти, в яких ки мають гомологію або подібність, коли значна амінокислотні залишки, що походять від одного кількість їх амінокислот є або (1) ідентичними, або виду, замінені на відповідні амінокислотні залишки (2) мають хімічно подібний бічний ланцюг R. Ввавід іншого виду або в консервативних, або в нежається, що нуклеїнові кислоти мають гомологію, консервативних положеннях. В іншому варіанті коли значна кількість їх нуклеотидів є ідентичними. здійснення винаходу, амінокислотні залишки в «Виділений поліпептид» або «виділений бінеконсервативних положеннях замінені консервалок» являє собою поліпептид або білок, який, в тивними або неконсервативними залишками. Споосновному, не містить тих сполук, які звичайно соби одержання цих варіантів, включаючи генетиасоціюються з ними в природних умовах (напричні (супресії, делеції, мутації і т.п.), хімічні та клад, інші білки або поліпептиди, нуклеїнові кислоферментативні способи, відомі кожному середти, вуглеводи, ліпіди). Термін «виділений» не ньому фахівцю. означає, що він виключає штучні або синтетичні Якщо такі алельні варіанти, аналоги, фрагменсуміші з іншими сполуками, або присутність доміти, похідні, мутанти та модифікації, включаючи шок, які не впливають на біологічну активність та альтернативні форми мРНК-сплайсингу та альтеякі можуть бути присутніми, наприклад, через нернативні форми пост-трансляційної модифікації, повне очищення, додання стабілізаторів або вигопризводять до продукування похідних LLGтовлення фармацевтично прийнятних препаратів. поліпептиду, які зберігають будь-які з біологічних Молекула є «антигенною», якщо вона здатна властивостей цього LLG-поліпептиду, то всі вони специфічно взаємодіяти з антиген-розпізнаючою входять в об'єм цього винаходу. молекулою імунної системи, такою як, імуноглобу«Нуклеїнова кислота» являє собою полімерну лін (антитіло) або рецептор для Т-клітинного антисполуку, що складається з ковалентно зв'язаних гена. Антигенний поліпетид містить, принаймні, субодиниць, які називаються нуклеотидами. Нукбіля 5, а переважно, принаймні, біля 10 амінокислеїновими кислотами є полірибонуклеїнова кислолот. Антигенна ділянка молекули може бути тією та (РНК) та полідезоксирибонуклеїнова кислота ділянкою, яка є імунодомінантною для антитіла (ДНК), обидві з яких можуть бути одноланцюговиабо для розпізнавання Т-клітинного рецептора, ми або дволанцюговими. ДНК може являти собою або вона може бути ділянкою, що використовуєтькДНК, геномнуДНК, синтетичну ДНК та напівсинтеся для продукування антитіла до даної молекули тичну ДНК. Послідовність нуклеодитів, що кодує шляхом кон'югування антигенної ділянки з молебілок, називається змістовною послідовністю. кулою-носієм для імунізації. Молекула, яка є анти«Антизмістовна нуклеїнова кислота» являє геном, необов'язково повинна бути сама імуногенсобою послідовність нуклеотидів, яка є комплеменою, тобто здатною індукувати імунну відповідь в нтарною до змістовної послідовності. Антизмістоввідсутності носія. на послідовність може бути використана для інгі«Поліпептид LLGN» та «білок LLGN» позначабування або блокування експресії поліпептиду, ють поліпептид, що включає послідовність SEQ ID кодованого змістовним ланцюгом. No: 6, де указаний поліпептид є глікозилованим Термін «виділена нуклеїнова кислота» познаабо неглікозилованим. чає нуклеїнову кислоту, яка, в основному, не міс«Поліпептид LLGXL» та «білок LLGXL» познатить сполук, що звичайно асоціюються з нею в чають поліпептид, що включає послідовність SEQ природних умовах. Термін «виділений» не ознаID No: 8, де указаний поліпептид є глікозилованим льну структуру: 15 75319 16 чає, що він виключає штучні або синтетичні суміші умовах не присутня в цій клітині. Термін «рекомбіз іншими сполуками, або присутність домішок, які нантна клітина» включає вищі еукаріотичні клітини, не впливають на біологічну активність та які мотакі як, клітини ссавців, нижчі еукаріотичні клітини, жуть бути присутніми, наприклад, через неповне такі як, дріжджові клітини, прокаріотичні клітини та очищення, додання стабілізаторів або виготовленархебактеріальні клітини. ня фармацевтично прийнятних препаратів. «Фармацевтично прийнятний носій» включає Фраза «нуклеїнова кислота, яка гібридизується розріджувачі та наповнювачі, які є фармацевтично в умовах високої жорсткості» позначає, що гібриприйнятними для цього способу введення та стедизовані нуклеїнові кислоти здатні витримувати рильними, і можуть являти собою водні або маспромивання в умовах високої жорсткості. Приклаляні суспензії, виготовлені з використанням придадом промивання в умовах високої жорсткості для тних диспергуючих або змочувальних агентів та суспендуючих агентів. Вибір конкретного фармагібридів ДНК-ДНК є промивання 0,1 SSC, 0,5% цевтично прийнятного носія та відношення вмісту ДСН при 68°С. Фахівцям відомі і інші промивання в активної сполуки до вмісту цього носія визначаумовах високої жорсткості. ється розчинністю та хімічними властивостями Термін «регуляторна ділянка» позначає послікомпозиції, конкретним способом введення та стадовність нуклеїнової кислоти, яка регулює експрендартною фармацевтичною практикою. сію нуклеїнової кислоти. Регуляторна ділянка мо«Ліпаза» являє собою білок, який може ферже включати послідовності, що по своїй природі є ментативно розщеплювати ліпідний субстрат. відповідальними за експресію конкретної аміноки«Фосфоліпаза» являє собою білок, який може слоти (гомологічна ділянка), або вона може вклюферментативно розщеплювати фосфоліпідний чати послідовності різноманітного походження субстрат. (відповідальні за експресію різних білків або навіть «Триацилгліцерол-ліпаза» являє собою бГяок, синтетичних білків). Зокрема, такими послідовносякий може ферментативно розщеплювати триацитями можуть бути послідовності еукаріотичних лгліцеридний субстрат. генів або вірусних генів, або похідні від них послі«Фосфатидилхолін» являє собою гліцериндовності, що стимулюють або пригнічують трансквмісний фосфоліпід, що має таку структуру: рипцію гена специфічним або не специфічним способом та індукованим або не індукованим способом. Регуляторні ділянки включають ділянки ініціації реплікації, сайти сплайсингу РНК, енхансери, послідовності термінації транскрипції, сигнальні послідовності, що направляють поліпептид секреторним шляхом до клітини-мішені, та промотори. Регуляторна ділянка з «гетерологічного джерела» являє собою регуляторну ділянку, яка в природних умовах не асоціюється з нуклеїновою кислотою, що експресується. До гетерологічних де R та R' являють собою вуглеводневі бокові регуляторних ділянок належать регуляторні ділянланцюги жирних кислот. Фосфатидилхолін також ки особин іншого виду, регуляторні ділянки іншого відомий як лецитин. гена, гібридні регуляторні послідовності та регуляТермін «ліпідний профіль» позначає серію торні послідовності, які не зустрічаються в природі, концентрацій холестерину, тригліцериду, ліпопроале які були сконструйовані штучно. теїнового холестерину та інших ліпідів в організмі Термін «вектор» позначає будь-яку послідовлюдини або тварини. ність, що призначена для перенесення нуклеїнової «Небажаний ліпідний профіль» являє собою кислоти цього винаходу до клітини-хазяїна. Термін стан, при якому концентрації холестерину, триглі«вектор» включає вектори вірусного та не вірусноцериду або ліпопротеїнового холестерину знахого походження, які використовуються для введендяться поза стандартними межами, які визначені ня нуклеїнової кислоти в прокаріотичну або еукадля цього віку та статі. Звичайно, небажаним ліпіріотичну клітину in vitrp, ex vivo або in vivo. дним профілем вважаються концентрації загальВекторами не віросного походження є плазміди, ного холестерину >200мг/дл, тригліцеридів плазми ліпосоми, ліпіди з електричним зарядом (цитофек>200мг/дл, холестерину ЛНГ >130мг/дл, холестетини), комплекси ДНК-білок та біологічні полімери. рину ЛВГ 4,0. Небажаний йовані віруси, вектори на основі поксвірусів, бакуліпідний профіль асоційований з рядом патологічловірусів, вірусів коров'ячої віспи, вірусів простого них станів, включаючи гіперліпідемію, діабетичну герпесу, вірусів Епштейна-Барра та аденовірусів. гіперхолестеринемію, атеросклероз та інші форми Окрім нуклеїнової кислоти цього винаходу, вектор ішемічної хвороби серця. може також містити одну або декілька регуляторВ) Поліпептиди них ділянок та/або селективні маркери, що викоЦей винахід належить до поліпептидів, які є ристовуються для відбору, вимірювання та монічленами сімейства тригліцерол-ліпаз та які вклюторингу результатів перенесення нуклеїнової чають каталітичний 39кДа-домен сімейства триакислоти (перенесення в тканини, тривалості ексцилгліцерол-ліпаз, наприклад, домен, що має поспресії і т.п.). лідовність SEQ ID No: 10. Одним з варіантів «Рекомбінантна клітина» являє собою клітину, здійснення цього винаходу є виділений LLGщо містить нуклеїнову кислоту, яка в природних поліпептид, що містить послідовність SEQ ID No: 6 17 75319 18 та має уявну молекулярну масу біля 40кДа на 10% кератину, GFAP); промотори терапевтичних генів ПААГ-ДСН-гелі. Іншим варіантом здійснення цього (наприклад, типу MDR, CFTR, фактора VIII); тканивинаходу є виділений LLG-поліпептид, що містить носпецифічні промотори (наприклад, промотор послідовність SEQ ID No:8 та має уявну молекуляактину в клітинах гладеньких м'язів або промотори рну масу біля 55кДа або 68кДа на 10% ПААГ-ДСНFlt та Flk, активні в ендотеліальних клітинах); прогелі. мотори, які, переважно, активуються в клітинах, Поліпептиди та білки цього винаходу можуть що діляться; промотори, що є сприйнятливими до бути рекомбінантними поліпептидами, природними стимуляторів (наприклад, рецептор стероїдного поліпептидами або синтетичними поліпептидами гормона, рецептор ретиноєвої кислоти); модулята можуть походити від людини, кролика або від тори транскрипції, що регулюються тетрацикліном; інших тварин. Ці поліпептиди характеризуються передранні промотори цитомегаловіруса; довгі репродукованими однією молекулярною масою кінцеві повтори (LTR) ретровірусів; промотори мета/або безліччю молекулярних мас, хроматографіталотіонеїну; промотори SV40; промотори ЕІа та чними реакціями та профілями елюції, амінокиспромотори MLP. Модулятори транскрипції, що релотним складом та амінокислотною послідовністю, гулюються тетрацикліном, та промотори CMV опиа також біологічною активністю. сані в WO 96/01313, в патентах США 5168062 та Поліпептиди цього винаходу можуть бути ви5385839, зміст яких вводиться в цей опис шляхом ділені з природних джерел, таких як, екстракти посилання. плаценти, плазма людини або кондиціоновані сеКраще, щоб вірусні вектори, які використовуредовища від культивованих клітин, таких як, макються в генній терапії, були дефектними по реплірофаги або ендотеліальні клітини, з використанкації, тобто, краще, щоб вони були нездатні автоням процедур очищення, добре відомих фахівцям. номно реплікуватися в клітинах-мішенях. В Альтернативно, поліпептиди цього винаходу основному, в геномі дефектних по реплікації вірусможуть бути одержані з використанням методу них векторів, які використовуються в цьому винарекомбінантних ДНК, який передбачає вставляння ході, відсутня, принаймні, одна ділянка, що необнуклеїнової кислоти, що кодує цей поліпептид, в хідна для реплікації віруса в інфікованих клітинах. придатний вектор, введення одержаного вектора в Ці ділянки можуть бути або еліміновані (повністю придатну клітину-хазяїн, виділення поліпептиду, або частково), або зроблені не функціональними продукованого одержаною клітиною-хазяїном та відомими способами. Ці способи передбачають очищення цього виділеного поліпептиду. повне вилучення, заміну (іншими послідовностями, С) Нуклеїнові кислоти зокрема, інсертованою нуклеїновою кислотою), Цей винахід належить до виділених нуклеїночасткову делецію або додання однієї або декільвих кислот, що кодують LLG-поліпептиди. кох основ до головної (для реплікації) ділянки. Ці Цей винахід належить також до антизмістовспособи можуть бути здійснені in vitro (на виділеній них нуклеїнових кислот, що можуть бути викорисДНК) або in situ, з використанням техніки модифітані для супресії або блокування експресії LLGкації генів або шляхом обробляння мутагенними поліпептидів in vitro, ex vivo або in vivo. агентами. Техніка рекомбінантних ДНК відома кожному При цьому переважно, щоб дефектний по рефахівцю в цій галузі. Загальні методи клонування плікації вірус зберігав послідовності свого геному, та експресії рекомбінантних молекул описані в необхідні для утворення капсиду вірусних частипораднику Maniatis [Molecular Cloning, Cold Spring нок. Harbor Laboratories, 1982], та Ausubel [Current Ретровіруси являють собою віруси, що інтегProtocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, руються та які інфікують клітини, що діляться. Ге1987], які вводяться в цей опис шляхом посиланном ретровіруса включає два LTR (довгих кінцевих ня. повтори), послідовність, що відповідає за утворенНуклеїнові кислоти цього винаходу можуть буня капсиду, та три кодуючих ділянки (gag, pol та ти з'єднані з однією або декількома регуляторними env). Було описано конструювання рекомбінантних ділянками. Вибір відповідної регуляторної ділянки ретровірусних векторів: [див., зокрема, ЕР 453242, або регуляторних ділянок являє собою рутинний ЕР 178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) метод доступний кожному середньому фахівцю. 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, і т.п.] Регуляторні ділянки включають промотори та моВ рекомбінантних ретровірусних векторах, гени жуть включати енхансери, супресори та т.п. gag, pol та env, звичайно делетировані, повністю Промоторами, які можуть бути використані в або частково, та замінені потрібною гетерологічцьому винаході, є конститутивні промотори та реною послідовністю нуклеїнової кислоти. Ці вектори гульовані (індуцибельні) промотори. Ці промотори можуть бути сконструйовані з ретровірусів різних можуть бути прокаріотичними або еукаріотичними типів, таких як, MoMuLV («мишачий вірус лейкозу в залежності від хазяїна. Прокаріотичними промоМолоні»), MSV («мишачий вірус саркоми Молоні»), торами (включаючи бактеріофагові промотори), які HaSV («вірус саркоми Харвея»); SNV («вірус некможуть бути використані в цілях цього винаходу, є розу селезінки»); RSV («вірус саркоми Рауса») та lad, lacZ, Т3, Т7, лямбда Рr, Рl та trp-промотори. віруса Фрейнда. Еукаріотичними промоторами (включаючи вірусні В основному, для конструювання рекомбінанпромотори), які можуть бути використані в цілях тних ретровірусів, що містять послідовності, які цього винаходу, є конститутивні промотори (накодують LLG-поліпептид цього винаходу, була приклад, промотори HPRT, віментину, актину, тусконструйована плазміда, що містить LTR, послібуліну); промотори проміжних філаментів (напридовність, що відповідає-за утворення капсиду, та клад, промотори десміну, нейрофіламентів, кодуючу послідовність. Цю конструкцію використо 19 75319 20 вували для трансфекції упаковувальної клітинної вірус). лінії, що здатна забезпечити в транс-положенні В переважному варіанті здійснення цього виретровірусні функції, які відсутні в плазміді. Таким находу, таким вектором є аденовірусний вектор. чином, упаковувальні клітинні лінії, в основному, Аденовіруси являють собою еукаріотичні ДНКздатні експресувати гени gag, pol та env. Такі упавіруси, які можуть бути модифіковані для доставки ковувальні клітинні лінії були описані раніше, а, нуклеїнової кислоти цього винаходу в клітини різзокрема, клітинна лінія РА317 (US4861719); кліних типів. тинна лінія PsiCRIP (WO 90/02806), і клітинна лінія Існують різноманітні серотипи аденовірусів. З GP+envAm-12 (WO 89/07150). Окрім того, рекомбіцих серотипів, з погляду цього винаходу, краще нантні ретровірусні вектори можуть містити модивикористовувати аденовіруси людини типу 2 або 5 фікації в LTR для інгібування транскрипційної ак(Ad2 або Ad5) або аденовіруси, які походять від тивності, а також подовженні послідовності, що тварин (див. WO94/26914). Такими аденовірусами відповідають за утворення капсиду та які можуть тваринного походження, які можуть бути викорисвключати частину гена gag [Bender et al., J. Virol, тані в цьому винаході, є аденовіруси собак, корів, 61 (1987) 1639]. Рекомбінантні ретровірусні вектомишей [наприклад, Mavl, Beard et al., Virology 75 ри очищають за допомогою стандартних методик, (1990) 81], овець, свиней, птахів та мавп (наприякі добре відомі фахівцям. клад, SAV). Кращими аденовірусами, що походять Аденоасоційованими вірусами (ААВ) є ДНКвід тварин, є аденовіруси собак, найкраще аденовмісні віруси відносно невеликого розміру, які мовірус CAV2 [наприклад, штам Манхетен або штам жуть інтегруватися стабільним та сайтА26/61, наприклад, АТСС VR-800]. специфічним способом в геном клітин, які вони Переважні дефектні по реплікації аденовірусні інфікують. Ці віруси здатні інфікувати широкий вектори цього винаходу містять ITR, послідовність спектр клітин без індукування якої-небудь дії на утворення капсиду та потрібну нуклеїнову кислоту. ріст, морфологію або диференціювання клітин, та Ще краще, щоб, принаймні, ділянка Е1 аденовірувони, очевидно, не викликають яких-небудь патосного вектора була не функціональною. При цьологій у людини. Геном ААВ був клонований, секму, краще щоб делеція на ділянці Е1 охоплювала венований та охарактеризований. Він містить приділянку від нуклеотиду 455 до нуклеотиду 3329 в близно 4700 основ та містить ділянку інвертованих послідовності аденовірусу Ad5. Можуть бути також кінцевих повторів (ITR) приблизно в 145 основ на модифіковані інші ділянки, зокрема, ділянка Е3 кожному кінці, яка є ділянкою ініціації реплікації (WO95/02697), ділянка Е2 (WO94/28938), ділянка вірусу. Решта геному ділиться на дві основні діляЕ4 (WO94/28152, WO94/12649 та WO95/02697) або нки, що мають функції утворення капсиду: лівосділянка в будь-якому з пізніх генів L1-L5. Дефектні торонню частину геному, яка містить ген гер, що ретровірусні вектори описані в WO95/02697. приймає участь в реплікації вірусу та експресії В переважному варіанті здійснення винаходу, вірусних генів; та правосторонню частину геному, аденовірусний вектор має делецію на ділянках Е1 яка містить ген cap, який кодує капсидні білки вірута Е4. В іншому переважному варіанті здійснення су. винаходу, аденовірусний вектор має делецію на Використання векторів, що походять від ААВ, ділянці Е1, в яку були вбудовані ділянка Е4 та подля переносу генів in vitro і in vivo, описано в робослідовність, що кодує LLG (див. FR94 13355). тах [див. WO91/18088, WO93/09239; патенти США Дефектні по реплікації рекомбінантні аденові4797368; ЕР 488528]. В цих публікаціях описані руси цього винаходу можуть бути одержані будьрізноманітні конструкції, які походять від ААВ, та в яким способом, що є відомим фахівцям [Levrero et яких гени гер та/або cap були делеговані та заміal., Gene 101 (1991) 195, ЕР 185573; Graham, нені потрібним геном, а також використання цих EMBO J., 3 (1984) 2917]. Зокрема, вони можуть конструкцій для перенесення указаного потрібного бути одержані шляхом гомологічної рекомбінації гена in vitro (в культивовані клітини) або in vivo між аденовірусом та плазмідою, яка містить, inter (безпосередньо в організм). Дефектні по реплікації alia, потрібну ДНК-послідовність. Ця гомологічна рекомбінантні ААВ цього винаходу можуть бути рекомбінація здійснюється після котрансфекції одержані шляхом контрансфекції плазміди, що указаного аденовірусу та плазміди у відповідну містить потрібну послідовність нуклеїнової кислоклітинну лінію. Використовувана клітинна лінія ти, фланковану двома ділянками інвертованих повинна бути, переважно, такою, що (і) трансфоркінцевих повторів (ITR) ААВ, та плазміди, що несе мується указаними елементами та (іі) містить посгени, відповідальні за утворення капсиду ААВ (гелідовності, комплементарні частини геному дефени гер та cap), в клітинну лінію, інфіковану людськтного по реплікації аденовірусу, переважно, в кім вірусом-помічником (наприклад, аденовірусом). інтегрованій формі для усування ризику рекомбіПотім, продуковані рекомбінантні ААВ очищають нації. Прикладами клітинних ліній, які можуть бути стандартними методами. Отже, цей винахід налевикористані, є ниркова клітинна лінія ембріона жить до похідного від ААВ рекомбінантного вірусу, людини 293 [Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) геном якого охоплює послідовність, що кодує LLG59], яка містить лівосторонню частину генома адеполіпептид, фланкований AAB-ITR. Цей винахід новірусу Ad5 (12%), інтегровану в її геном; та клітакож належить до плазміди, яка включає послідотинні лінії, здатні до комплементації функцій Е1 та вність, що кодує LLG-поліпептид, фланкований Е4, як описано в заявках WO94/26914 та двома ITR від ААВ. Така плазміда також може буWO95/02697. Рекомбінантні аденовіруси виділяли ти використана для перенесення послідовності та очищали з використанням стандартних методів LLG, причому, ця плазміда, якщо це необхідно, молекулярної біології добре відомих кожному фаможе бути введена в ліпосомний вектор (псевдохівцю. 21 75319 22 Інгібування експресії гена з використанням анлянки каркасних варіабельних доменів легкого тизмістовних нуклеїнових кислот може бути досягта/або важкого ланцюга є похідними імуноглобулінене на трансляційному або транскрипційному ну, відмінного від людського, а інші ділянки молерівні. Антизмістовні нуклеїнові кислоти цьокули походять від одного або декількох імуноглого,винаходу, переважно, являють собою фрагменбулінів людини. «Гуманізованими» антитілами ти нуклеїнових кислот, що здатні специфічно гібтакож є антитіла, які характеризуються тим, що у ридизуватися зі всією або з частиною нуклеїнової них «гуманізований» важкий ланцюг асоційований кислоти, що кодує LLG або відповідну інформаційз донорним або акцепторним немодифікованим ну РНК. Ці антизмістовні нуклеїнові кислоти молегким ланцюгом або з химерним легким ланцюжуть являти собою синтетичні олігонуклеотиди, гом, або навпаки. «Гуманізування» антитіл може необов'язково модифіковані для підвищення їх бути здійснене методами, відомими фахівцям стабільності та селективності. Вони-можуть також [див., наприклад, G.E. Mark & Е.А, Padlan, являти собою ДНК-послідовністі, експресія яких в «Chapter 4. Humanization of Monoclonal Antibodies», клітині призводить до продукування РНК, комплеThe Handbook of Experimental Pharmacology Vol. ментарної всій або частині мРНК LLG. Антизмісто113, Springer-Verlag, New York, 1994]. Для продувні нуклеїнові кислоти можуть бути одержані шлякування «гуманізуванних» антитіл можуть бути хом експресії всієї або частини послідовності, використані трансгенні тварини. вибраної з групи, яка складається з SEQ ID No: 2, Для продукування одноланцюгових антитіл SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 7 або SEQ ID No: 11, і проти імуногенних поліпептидів та білків цього знаходиться в протилежній орієнтації, як описано в винаходу можть бути пристосовані методики, віЕР 140308. Для здійснення цього винаходу придадомі фахівцям та які використовуються для продутною є антизмістовна послідовність будь-якої довкування одноланцюгових антитіл. жини, за умови, що вона здатна інгібувати або Антитіла проти LLG можуть бути використані в блокувати експресію LLG. Переважно, щоб довжианалізах для виявлення або для кількісної оцінки на антизмістовної послідовності складала, прирівнів LLG. В одному з варіантів здійснення цього наймні, 20 нуклеотидів. Одержання та використанвинаходу, ці аналізи дозволять проводити клінічну ня антизмістовних нуклеїнових кислот, ДНК, що діагностику та оцінку рівнів LLG на різних стадіях кодують антизмістовні РНК, та використання олігозахворювання та здійснювати моніторинг ефектиі генних антизмістовних послідовностей описано в вності лікування. заявці WO92/15680, зміст якої вводиться в цей Е) Методи скринінгу для виявлення агоністів опис через посилання. або антагоністів D) Антитіла Цей винахід належить до способів скринінгу Цей винахід належить до антитіл проти LLGбібліотек невеликих молекул або джерел природполіпептиду. Ці антитіла можуть бути моноклонаних продуктів для виявлення агоністів (енхансерів льними або поліклональними антитілами. Цей виабо коактиваторів, включаючи білкові коактиватонахід включає химерні, одноланцюгові, «гуманізори) або антагоністів (інгібіторів) LLGXL-активності. вані» антитіла, а також Fab-фрагменти та продукти Передбачуваний агоніст або антагоніст піддають бібліотеки Fab-фрагментів, що експресуються. контакту з білком LLGXL та субстратом LLGXL, і Можуть бути одержані поліклональні антитіла оцінюють здатність передбачуваного агоністаабо проти антигенного фрагменту LLG-поліпептиду, як антагоніста підсилювати або інгібувати активність описано в Прикладі 4А. Можуть бути також продуLLGXL. ковані антитіла проти інтактного LLG-білка або Білок LLGXL, що використовується в цьому поліпептиду, або проти фрагменту, похідного або способі, може бути продукований рекомбінантним епітопу цього білка, або поліпептиду. Антитіла мометодом в ряді клітин-хазяїнів, включаючи клітини жуть бути продуковані після введення білка, поліссавців (як показано в Прикладі 7), клітини, інфікопептиду, фрагменту, похідного або епітопу тварині вані бакуловірусом, дріжджі та бактерії. Експресія з використанням техніки та процедур, відомих фаLLG в стабільно трансфікованих клітинах СНО хівцям. може бути оптимізована шляхом метотрексатМоноклональні антитіла можуть бути одержані ампліфікації цих клітин. Білок LLGXL може бути методом Mishell, В.В., et al., Selected Methods in також виділений з природних джерел, таких як, Cellular Immunology [W.H. Freeman, ed., San плазма людини, плацентарні екстракти або кондиFrancisco (1980)]. Для цього, поліпептид цього виціоноване середовище від культивованих ендотенаходу використовують для імунізації клітин селеліальних клітин, клітин ТНР-1 або макрофагів. зінки мишей BALB/c. Імунізовані клітини селезінки Оптимізація аналітичних параметрів, включапіддають злиттю з мієломними клітинами. Злиті ючи pH, концентрацію іонів, температуру, концентклітини, що мають властивості клітин селезінки та рацію субстрату та умови емульгування, може мієломної клітини, виділяють шляхом культивубути проведена емпірично будь-яким фахівцем. вання в середовищі HAT, тобто, в середовищі, на Жирнокислотні замісники субстратів можуть якому обидві батьківські клітини гинуть, але продуваріюватися по довжині ланцюга, а також за стукти злитих клітин виживають і ростуть. пенем та положенням ненасиченості. Субстрати Моноклональні антитіла цього винаходу моможуть бути помічені радіоактивною міткою в жуть бути «гуманізовані» для запобігання вироббудь-якому з декількох положень. Фосфоліпідні лянню у хазяїна імунної відповіді на ці антитіла. субстрати, такі як, фосфатидилхолін, можуть бути «Гуманізоване антитіло» являє собою антитіло, в піддані радіоактивному міченню, наприклад, в поякому гіперваріабельні ділянки (які визначають ложенні жирних кислот Sn-1 або Sn-2, або в гліцекомплементарність ділянки - CDR) та/або інші діриновій, фосфатній або полярній головній групі 23 75319 24 (холін у випадку фосфатидилхоліну). зія. Ця композиція може бути введена парентераЯк альтернатива до радіоактивних субстратів, льно в вигляді готових лікарських форм, що місв методах скринінгу можуть бути також використатять стандартні добре відомі нетоксичні фізіологіні і інші класи мічених субстратів, такі як, флуоречно прийнятні носії, ад'юванти та наповнювачі, сцентні субстрати або тіовмісні субстрати. якщоце необхідно. Флуоресцентні субстрати є особливо придатПереважними стерильними препаратами для ними для використання в аналізах скринінгу, оскіін'єкцій можуть бути розчин або суспензія в нетокльки в цьому випадку ферментативний каталіз сичному парентерально прийнятному розчиннику може оцінюватися безперервно шляхом вимірюабо розріджувачі. Прикладами фармацевтично вання інтенсивності флуоресценції, не вдаючись прийнятних носіїв є фізіологічний розчин, забуфедо фізичного відділення (екдгракції) продуктів від рений фізіологічний розчин, ізотонічний фізіологічсубстратів. Прикладом флуоресцентного фосфаний розчин (наприклад, однозамінений фосфат тидилхолінового субстрату є С6NВD-РС{1-ацил-2натрію, двозамінений фосфат натрію, хлорид на[6-(нітро-2,1,3-бензоксадіазол-4-іл)трію, калію, кальцію або магнію, або суміші цих аміно]капроїлфосфатидилхолін}. солей), розчин Рінгера, декстроза, вода, стерильТіовмісними субстратами є 1,2-біс(гексаноїлна вода, гліцерин, етанол та їх комбінації. Звичайтіо)-1,2-дидезокси-sn-гліцеро-3-фосфорилхолін но, як розчинники або суспендуючі середовища [L.J. Reynolds, W.N. Washburn, R.A. Deems, & E.A. використовуються 1,3-бутанол та стерильні жирні Dennis, 1991, Methods in Enzymology 197: 3-23; L. масла. З цією метою може бути використане будьYu & E.A. Dennis, 1991, Methods in Enzymology 197: яке м'яке жирне масло, включаючи синтетичні мо65-75; L.A. Wittenauer, K. Shirai, R.L. Jackson & J.D. но- або дигліцериди. В препаратах для ін'єкцій Johnson, 1984, Biochem. Biophys. Res. Commun. можуть бути також використані жирні кислоти, такі 118:894-901]. як олеїнова кислота. F) Гідроліз складних ефірів фосфатидилхоліну Середовищем для композицій може бути таЦей винахід належить до способу ферментакож гідрогель, який одержують з будь-якого біолотивного гідролізу складних ефірів фосфатидилхогічно сумісного або нетоксичного (гомо- або гетеліну, наприклад, для промислової або харчової ро-) полімеру, такого як, гідрофільний полімер обробки, або для одержання миючих засобів для поліакрилової кислоти, який може діяти як губка, прання білизни. Поліпептиди цього винаходу мощо абсорбує лікарський засіб. Такі полімери були жуть бути використані для гідролізу складних ефіописані, наприклад, в заявці WO93/08845, зміст рів фосфатидилхоліну в розчині або ці ферменти якої вводиться в цей опис через посилання. Деякі можуть бути зв'язані з твердим носієм, який може з них, зокрема, такі як, полімери, які одержують з бути потім підданий контакту з субстратом. Цей етилену та/або окису пропілену, є комерційно досметод може бути використаний для продукування тупними. Гідрогель може бути осаджений безполізофосфоліпідів та вільних жирних кислот. середньо на поверхню тканини, що обробляється, G) Композиції наприклад, під час хірургічного втручання. Цей винахід належить до композицій в біологіВ іншому переважному варіанті свого здійсчно сумісному розчині, що включає поліпептиди, нення, цей винахід належить до фармацевтичних нуклеїнові кислоти, вектори та антитіла цього викомпозицій, що включають дефектний по репліканаходу. Біологічно сумісний розчин являє собою ції рекомбінантний вірус та полоксамер. Конкретрозчин, в якому поліпептид, нуклеїнова кислота, ніше цей винахід належить до композиції, яка місвектор або антитіло цього винаходу підтримуються тить дефектний по реплікації рекомбінантний в активній формі, наприклад, у формі, яка є сприявірус, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує тливою для здійснення біологічної активності. Так, LLG-поліпептид, та полоксамер. Переважним понаприклад, поліпептид цього винаходу повинен локсамером є Полоксамер 407, який є в продажу мати фосфоліпазну активність, нуклеїнова кислота (BASF, Parsippany, NJ), а найкращим є нетоксичповинна бути здатною до реплікації та до трансний біологічно сумісний багатоатомний спирт. Поляції транскрипту або гібридизуватися з комплелоксамер, просочений рекомбінантним вірусом, ментарною нуклеїновою кислотою; вектор повинен може бути осаджений безпосередньо на поверхню бути здатен трансфікувати клітину-мішень; а антитканини, що обробляється, наприклад, під час хітіло повинне зв'язуватися з поліпептидом цього рургічного втручання. Полоксамер має, в основвинаходу. В основному, таким біологічно сумісним ному, ті ж переваги, що й гідрогель, але при цьому розчином є водний буфер, наприклад, Трис, фосвін має нижчу в'язкість. фат або буфер HEPES, що містить іони солі. ЗвиН) Способи лікування чайно концентрація іонів солі аналогічна фізіологіЦей винахід належить до способів лікування, чним рівням. В конкретному варіанті здійснення які передбачають введення людині або іншій твавинаходу, біологічно сумісний розчин являє собою рині ефективної кількості композиції цього винахофармацевтично прийнятну композицію. Біологічно ду. сумісні розчини можуть включати стабілізуючі агеЕфективні кількості композиції можуть варіюнти та консерванти. ватися в залежності від віку, типу та важкості стану Такі композиції можуть бути виготовлені для пацієнта, що піддається лікуванню, а також від місцевого, перорального, парентерального, інтрамаси тіла, необхідної тривалості лікування, спосоназального, підшкірного та внутрішньоочного ввебу введення та інших параметрів. Ефективної кільдення. Під парентеральним введенням мається на кості визначаються лікуючим лікарем та іншим увазі внутрішньовенна ін'єкція, внутрішньом'язова кваліфікованим медичним персоналом. ін'єкція, внутрішньоартеріальна ін'єкція або інфуПоліпептиди цього винаходу вводять, в основ 25 75319 26 ному, в дозах, що складають від біля 0,01мг/кг до ду, експресія LLG інгібується або блокується за біля 100мг/кг, переважно, від біля 0,1мг/кг до біля допомогою експресії послідовності нуклеїнової 50мг/кг, а найкраще, від біля 1мг/кг до біля 10мг/кг кислоти, що кодує внутрішньоклітинний зв'язуючий маси тіла на день. білок, здатний вибірково взаємодіяти з LLG. В заяРекомбінантні віруси цього винаходу звичайно ках WO94/29446 та WO94/02610, зміст яких вво4 продукують та вводять в дозах від близько 10 до диться в цей опис через посилання, описана транблизько 1014б.у.о. У випадку ААВ та аденовірусів, сфекція клітин генами, що кодують краще використовувати дози від близько 105 до внутрішньоклітинний зв'язуючий білок. Внутрішблизько 1011б.у.о. Термін «б.у.о.» (бляшкоутворюньоклітинним зв'язуючим білком є будь-який білок, юча одиниця) відповідає інфекційній здатності сущо здатен вибірково взаємодіяти або зв'язуватися спензії вібріонів, яка визначається інфекцією відз LLG в клітині, в якій він експресується, та нейтповідної клітинної культури та вимірюється ралізувати функцію зв'язаного LLG. Переважним кількістю утворених бляшок. Способи визначення внутрішньоклітинним зв'язуючим білком є антитіло титру б.у.о. вірусного розчину добре описані в ліабо фрагмент антитіла. Кращим внутрішньоклітературі. тинним зв'язуючим білком є одноланцюгове антиЦей винахід належить до способів лікування тіло. атеросклерозу, де указаний атеросклероз є реВ WO94/02610 описано одержання антитіл та зультатом надлишкової, аномальної або неадекідентифікація нуклеїнової кислоти, що кодує конкватної експресії LLG-поліпептидної активності. ретне антитіло. З використанням LLG або його Крім того, цей винахід належить до способів фрагмента, специфічне моноклональне антитіло лікування людини або іншої тварини, що має неможе бути одержане способами, що відомі фахівбажаний ліпідний профіль, де указаний небажаний цям. Для використання в способі цього винаходу ліпідний профіль є результатом високої або неаможе бути потім одержаний вектор, що включає декватної експресії LLG-поліпептидної активності. нуклеїнову кислоту, яка кодує внутрішньоклітинний Цей винахід також належить до способів лікузв'язуючий білок або його фрагмент, та здатен вання цукрового діабету, гіперліпідемії, внутрішекспресувати ся в клітині-хазяїні. ньопечінкового холестазу або інших метаболічних Альтернативно, LLG-активність може бути порушень, де указані цукровий діабет, гіперліпідеблокована шляхом введення нейтралізуючого анмія, внутрішньопечінковий холестаз або інші метатитіла в кровотік. Це нейтралізуюче антитіло може болічні порушення є результатом високої або неабути введене безпосередньо в вигляді білка або декватної експресії LLG-поліпептидної активності. воно може бути експресоване з вектора (що міс1) Корекція небажаних ліпідних профілів, асотить секреторний сигнал). ційованих з підвищеною експресією LLGВ іншому варіанті, цього винаходу, LLGXLполіпептиду. активність інгібують шляхом введення композиції, Способи зниження експресії LLG-поліпептиду що містить поліпептид LLGN або інший фрагмент для корекції указаних станів, де ці стани або поLLG. Ця композиція може бути введена стандартрушення асоційовані з небажаним ліпідним профіним способом, таким як, пероральрне, місцеве, лем, обумовлені LLG-поліпептидною активністю, внутрішньовенне, внутрішньоочеревенне, внутріпередбачають, але не обмежуються, введення шньом'язове, підшкірне, інтраназальне або черезкомпозиції, що містить антизмістовну нуклеїнову шкірне введення. Ця композиція може бути введекислоту; введення композиції, що містить внутрішна безпосередньо або вона може бути ньоклітинний зв'язуючий білок, такий як, антитіло; інкапсульована (наприклад, в ліпідній системі, в введення композиції, що містить LLGN-поліпептид амінокислотних мікросферах або в глобулярних або інші фрагменти LLG, та введення композиції, дендримерах). В деяких випадках, цей поліпептид що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує LLGNможе бути приєднаний до іншого полімеру, такого поліпептид або інший фрагмент LLG. як, альбумін сироватки або полівінілпіролідон. В одному з варіантів здійснення винаходу, В іншому варіанті цього винаходу, LLGXLкомпозицію, що містить антизмістовну нуклеїнову активність інгібують шляхом використання низькокислоту, використовують для пригнічення або бломолекулярних сполук, які пригнічують його фермекування експресії LLG. В одному з варіантів здійснтативні властивості або запобігають його розпінення винаходу, указана нуклеїнова кислота кодує знавання клітинними сайтами зв'язування. антизмістовні РНК-молекули. В такому варіанті В іншому варіанті цього винаходу, LLGXLцього винаходу, нуклеїнову кислоту правильно активність інгібують шляхом використання генної з'єднують з сигнальними послідовностями, які затерапії, тобто шляхом введення сполуки, що місбезпечують експресію нуклеотидної послідовності, тить нуклеїнову кислоту, яка кодує та направляє та вбудовують в клітину, використовуючи, переваекспресію поліпептиду LLGN або іншого фрагменжно, рекомбінантні векторні конструкції, що здатні та LLG. В конкретному варіанті здійснення винаекспресувати антизмістовну нуклеїнову кислоту ходу, ген LLG цього винаходу також має споріднепісля введення цього вектора в клітину. Прикланість до гепарину. LLG-поліпептид, який дами придатних векторів є плазміди, аденовіруси, зв'язується з внутрішньоклітинним гепарином в аденоасоційовані віруси, ретровіруси та віруси порожнині кровоносних судин, дозволяє LLG зв'ягерпесу. Переважним вектором є аденовірус. Найзуватися та прискорювати поглинання ЛНГ, діючи кращим вектором є дефектний по реплікації адеяк місточковий зв'язок між ЛНГ та внутрішньокліновірус, що має делецію на ділянках вірусу Е1 тинним гепарином. Передбачається, що на ділянці та/або Е3. локалізації атеросклеротичних уражень підвищеВ іншому переважному варіанті цього винахоний рівень ліпазної активності прискорює атеро 27 75319 28 генний процес [Zilversmit, D.B. (1995) Clin. Chem. ня рівнів холестерину та фосфоліпіду в сироватці 41, 153-158; Zambon, A., Torres, A., Bijvoet, S., [Ishizaki, К., Kinbara, S., Miyazawa, N., Takeuchi, Y., Gagne, C, Moojani, S., Lupien, P.J., Hayden M.R., & Hirabayashi, N., Kasai, H., & Araki, T. (1997) Toxicol. Brunzell, J.D. (1993) Lancet 341, 1119-1121]. Це Letters 90, 29-34]. Продукти цього винаходу можуть може бути обумовлене підвищеним рівнем зв'язубути використані для лікування внутрішньопечінвання та поглинання ліпопротеїнів тканиною сукового холестазу у пацієнтів з підвищеними рівнядин, що опосередковане ліпазами [Eisenberg, S., ми холестерину та/або фосфоліпіду в сироватці. Sehayek, E., Olivecrona, Т., Vlodavsky, I. (1992) J. Крім того, ця модель з використанням пацюків таClin. Invest, 90, 2013-2021; Tabas, I., Li, I., Brocia кож показала значне зниження швидкості виділенR.W., Xu, S.W., Swenson, T.L, Williams, K.J. (1993) ня холестерину з жовчю. LLG-поліпептид та проJ. Biol. Chem., 268, 20419-20432; Nordestgaard, дукти нуклеїнової кислоти цього винаходу можуть B.G., & Nielsen, A.G. (1994) Curr. Opin. Lipid. 5, 252бути використані для лікування пацієнтів з пору257; Williams, K.J., & Tabas, I. (1995) Art. Thromb. шенням системи жовчовиділення. and Vase. Biol. 15, 551-561]. Окрім того, високий Внутрішньопечінковий холестаз характеризулокальний рівень ліпазної активності може призється як порушення виділення жовчі з печінки. Неводити до цитотоксичних рівнів жирних кислот та давно проведене картування показало, що локуси лізофосфатидилхоліну, що продукується в попедля прогресуючого спадкового внутрішньопечінкоредниках атеросклеротичних уражень. Ця конкревого холестазу (ПСВХ або хвороба Байлера) та тна активність LLG може сприяти розвитку або доброякісний рецидивуючий внутрішньопечінковий прогресуванню атеросклерозу, особливо на фоні холестаз (ДРВХ) знаходяться на 18q21-q22 надлишкових рівнів ліпідів, обумовлених харчу[Cariton, V.E.H., Knisely, A.S., & Freimer, N.B. (1995) ванням або генетичними факторами. Таким чином, Hum. Mol. Genet. 4, 1049-1053 & Houwen, R.H., цей винахід дозволяє інгібувати акумуляцію ліпопBaharioo, S., Blankenship, K., Raeymaekers, P., ротеїнів шляхом інгібування експресії LLGJuyn, J., Sandkuijl, L.A., & Freimer, N.B. (1994) поліпептиду або зв'язування з ліпопротеїном (наNature Genet. 8, 380-386, відповідно]. Оскільки ген приклад, ЛНГ). LLG був картований на цій хромосомі на ділянці 2) Корекція небажаних ліпідних профілів, асо18q21, то ген LLG або продукти цього винаходу ційованих з недостатньою активністю LLGможуть бути використані для лікування пацієнтів, поліпептиду які страждають внутрішньопечінковим холестазом, Способи підвищення експресії LLG для корекщо викликаний мутацією або дефектною експресіції тих станів, в яких активність LLG-поліпептиду єю гена (генів), відповідального за захворювання сприяє розвитку хвороб або порушень, асоційоваПСВХ/ДРВХ. них з небажаним ліпідним профілем, передбачаВ іншому варіанті здійснення цього винаходу, ють, але не обмежуються, введення композиції, ген LLG або поліпептидні продукти цього винаходу що містить поліпептид LLGXL, та введення компоможуть бути використані для лікування пацієнтів, зиції, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує які страждають внутрішньопечінковим холестазом, поліпептид LLGXL. що не викликається дефектом гена, відповідальВ одному з варіантів здійснення цього винахоного за захворювання ПСВХ/ДРВХ, на ділянці ду, LLGXL-активність підвищують шляхом введен18q21-q22. Недавно проведені дослідження доня композиції, що містить поліпептид LLGXL. Ця зволили припустити, що інший локус, розташовакомпозиція може бути введена стандартним споний за межами ділянки 18q21-q22, може також собом, таким як, пероральрне, місцеве, внутрішпродукувати ПСВХ-фенотип [Strautnieks, S.S., ньовенне, внутрішньоочеревенне, внутрішньом'яKagalwalla, A.F., Tanner, M.S., Gardiner, R.M., & зове, підшкірне, інтраназальне або черезшкірне Thompsqn, R.J. (1996) J. Med. Genet. 33, 833-836]. введення. Ця композиція може бути введена безОднак, введення LLG-поліпептиду або безпосерепосередньо або вона може бути інкапсульована дньо, або за допомогою генної терапії, може поле(наприклад, в ліпідній системі, в амінокислотних гшити стан, що викликаний цією формою захворюмікросферах або в глобулярних дендримерах). В вання. деяких випадках, цей поліпептид може бути приєВ генній терапії одну або декілька нуклеїнових днаний до іншого полімеру, такого як, альбумін кислот, що кодують поліпептид, а також регулятосироватки або полівінілпіролідон. рні ділянки, які контролюють її експресію, переноВ іншому варіанті цього винаходу, LLGXLсять в клітини-мішені людини або іншої тварини. активність підвищують шляхом використання ниЦе перенесення здійснюється або ех vivoзькомолекулярних сполук, які можуть підсилювати способом, в якому нуклеїнову кислоту переносять експресію LLGXL на рівні транскрипції, трансляції в клітини в лабораторії, а потім модифіковані кліабо після трансляції. тини вводять людині або іншій тварині, або in vivoВ іншому варіанті цього винаходу, рівень способом, в якому нуклеїнову кислоту вводять LLGXL підвищують шляхом введення композиції, безпосередньо в клітини людини або іншої тварищо містить нуклеїнову кислоту, яка кодує та нани. Перенесення нуклеїнових кислот може бути правляє експресію LLGXL-поліпептиду. здійснене з використанням або вірусних, або невіВнутрішньопечінковий холестаз може бути русних векторів, описаних вище. охарактеризований як збільшення рівнів холестеНевірусні вектори можуть бути перенесені в рину та фосфоліпіду в сироватці. Недавно повідоклітини будь-якими методами, що відомі фахівцям, млялось, що модель внутрішньопечінкового холевключаючи копреципітацію фосфатом кальцію, стазу у пацюків, індукованого лікарським засобом ліпофекцію (з використанням синтетичних аніонфалоїдином, продемонструвала значне збільшенних та катіонних ліпосом), опосередковану рецеп 29 75319 30 тором доставку гена, ін'єкцію «голою» ДНК, електВ) Синтез кДНК ропорацію та доставку методами біобалістики або Синтез кДНК та PCR-ампліфікацію здійснюваприскорення частинок. ли у відповідності до інструкцій, що додаються до Приклади набору для здійснення методу диференціального Цей винахід проілюстровано наступними привідображення [Differential Display Kit, версія 1,0, кладами. Ці приклади приводяться лише з ілюстDisplay Systems Biotechnology, Inc.]. Ця система ративною метою та не обмежують об'єм претензій. заснована на методі вперше описаному Liang і Приклад 1 Pardee [Mead, DA, Pey, N.K., Hermstadt, С, Marcil, Ідентифікація диференціально експресованої R.A., & Smith, L.M. (1991) Bio/Technology 9657-663]. кДНК Пари праймерів, які давали кДНК-фрагмент, що А) Одержання РНК містить першу інформацію про ген ліпазоМоноцитарні клітини ТНР-1 людини [Smith подібного поліпептиду, являли собою прямий Р.К., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, А.К., праймер 7 та зворотний праймер 15. кДНК для Gartner, F.N., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., ампліфікації синтезували, як описано нижче, з виGoeke, N.M., Olson, B.J., and Klenk, D.C. (1985) користання РНК, яка походить від клітин ТНР-1, Anal. Biochem. 150, 76-85] культивували в середооброблених РМА та експонованих або буфером, вищі RPMI-1640 (GIBCO), що містить 25мМ або окисленим ЛНГ: 3мкл 25мкМ прямого праймеHEPES, 10% фетальну бичачу сироватку, ра 7 та 7,5мкл води, обробленої діетилпірокарбо100одиниць/мл натрій-вмісного пеніціліну G та натом (DEPC), додавали до 300нг (3,0мкл) РНК від 100одиниць/мл сульфату стрептоміцину. Клітини будь-якого зразка РНК ТНР-1. Цю суміш нагрівали висівали в 15см-чашки для культивування тканини до 70°С на протязі 10 хвилин, а потім охолоджували на льоду. В цю пробірку додавали 3мкл 5 х при концентрації 1,5 107клітин/чашка та обробляPCR-буфера (250мМ Трис-НСІ, pH 8,3, 375мМ КСІ) ли 40нг/мл 12-міристат-13-ацетатом форболу (GIBCO), 3мкл 25мМ МgСІ2, 3мкл 0,1М ДТТ, 1,2мкл (Sigma) на протязі 48 годин для індукування дифе500мкМ dNTP, 0,7мкл РНКазину та 5,6мкл DEPCренціювання клітин. Людські ліпопротеїни низької, обробленої води. Пробірки інкубували на протязі 2 густини (ЛНГ), які поставляються фірмою хвилин при кімнатній температурі, після чого доCalbiochem, піддавали вичерпному діалізу проти давали 1,5мкл (300 одиниць) Superscript II РНКази PBS при 4°С. Потім ЛНГ розводили до 500мкг/мл Н-зворотної транскриптази (GIBCO). Пробірки інта діалізували проти 5мкМ CuSO4 в PBS при 37°С кубували послідовно на протязі 2 хвилин при кімна протязі 16 годин. Для припинення окислення натній температурі, 60 хвилин при 37°С та 5 хвиЛНГ піддавали вичерпному діалізу проти 150мМ лин при 95°С, а потім охолоджували на льоду. NaCI, 0,3мМ EDTA, а потім фільтр стерилізували. PCR-ампліфікацію здійснювали з використанням Концентрацію білка визначали методом ВСА набору Master Міх, що містить 117мкл 10 х PCR[Schuh, J., Fairclough, G.F., and Haschemeyer, R.H. буфера (500мМ КСІ, 100мМ Трис-НСІ pH 8,3, (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3173-3177] 15мМ МgСІ2 та 0,01% (мас/об.) желатину), 70,2мкл (Pierce). Ступінь окислення був визначений мето25мМ МgСІ2, 5,9мкл альфа-33Р-аАТР (10мКі/мл. дом TBARS [Chomczynski, P. (1993) Biotechniques DuPont NEN), 4,7мкл 500мкМ суміші dNTP, 11мкл 15, 532-537] та складав 25-30нмоль еквівалентів ДНК-полімерази Ampli-Taq (5одиниць/мкл, PerkinMDA/мг білка. Диференційовані клітини ТНР-1 обElmer), та 493,3мкл DEPC-обробленої води. Для робляли на протязі 24 годин або 50мкг/мл окислекожної реакції 12мкл набору Master Mix додавали ного ЛНГ, або NaCI-EDTA-буфером в середовищі до 2мкл прямого праймера #7, 1мкл кДНК та 5мкл RPMI, що містить 10%-ну фетальну бичачу сирозворотнього праймера #15. Реакційні суміші нагріватку з дефіцитом ліпопротеїну (Sigma). Для збору вали до 94°С на протязі 1 хвилини, а потім піддаРНК, чашки промивали 10мл PBS, а потім в кожну вали 40 термоциклам зі стадією денатурації при чашку додавали 14мл TRIZOL [Liang, P. & Pardee, 94°С на протязі 15 секунд; стадією відпалу при A.B. (1992) Science 257, 967-971] (GIBCO). Розчин 40°С на протязі 1 хвилини та зі стадією подовжендекілька разів піпетували для одержання суміші, а ня при 72°С на протязі 30 секунд. Після проведенпотім однакові зразки об'єднували в центрифуганя 40 циклів реакційні суміші інкубували при 72°С льних пробірках, додавали 3мл хлороформу на на протязі 5 хвилин та зберігали при 10°С. PCRчашку та змішували. Пробірки центрифугували на реакції здійснювали в термокомірці GeneAmp протязі 15 хвилин при 12000 д. Після центрифуSystem 9600 Perkin-Elmer. гування, верхній шар переносили в нову пробірку, Чотири мікролітри реакційної суміші для ампа потім додавали 7,5мл ізопропанолу на чашку та ліфікації змішували з рівним об'ємом буфера для змішували. Пробірки центрифугували при 12000 завантажування (0,2% бромфенолового синього, g на протязі 20 хвилин. Осад після центрифугу0,2% ксилолціанолу, 10мМ EDTA pH 8,0 та 20% вання промивали охолодженим на льоду 70%-ним гліцерину). Чотири мікролітри цієї суміші піддавали етанолом та сушили при кімнатній температурі. електрофорезу в 6%-ному акриламідному секвеОсади суспендували в 500мкл ТЕ (Трис-EDTA) та нуючому гелі, що неденатурує, на протязі 3 годин обробляли 200 одиницями ДНКази 1, яка не міспри 1200 Вольтах (постійна напруга). Цей гель тить РНКази, та 200 одиницями РНКази, плаценсушили при 80°С на протязі 1,5 годин та експонутарного інгібітора РНКази, (Promeda) на протязі 30 вали з плівкою Kodak XAR. Був ідентифікований хвилин при 37°С. РНК очищали за допомогою посампліфікований продукт, знайдений лише в реаклідовної екстракції фенолом, феноційній суміші, що містить кДНК від клітин ТНР-1, лом/хлороформом/ізоаміловим спиртом (25:24:1) оброблених окисленим ЛНГ, а потім цей продукт та хлороформом/ізоаміловим спиртом (24:1), а вирізували з гелю. В мікроцентрифугову пробірку, потім осаджували етанолом. 31 75319 32 що містить вирізаний гелевий фрагмент, додавали ли при 94°С на протязі 3 хвилин, а потім на льоду 100мкл DEPC-обробленої води, а потім інкубували на протязі 1 хвилини. Потім додавали 1мкл (10 на протязі 30 хвилин при кімнатній температурі, а одиниць) кінцевої дезоксинуклеотидилтрансферапотім ще на протязі 15 хвилин при 95°С. зи та суміш інкубували на протязі 10 хвилин при Для проведення повторної ампліфікації PCR37°С. Фермент піддавали тепловій інактивації продукту, 26,5 мікролітрів елюйованої ДНК викошляхом інкубування при 70°С на протязі 10 хвиристовували в реакції ампліфікації, яка також лин, а потім суміш ставили на лід. PCRвключала 5мкл 10 х PCR-буфера, 3мкл 25мМ ампліфікацію кДНК здійснювали на таких стадіях: МgСІ2, 5мкл 500мкМ dNTP, 5мкл 2мкМ прямого 5мкл кДНК з нарощеним кінцем була включена в праймера 7, 7,5мкл зворотного праймера 15 та реакційну суміш, яка також містила 5мкл 10 х PCR0,5мкл полімерази Amplitaq. Параметри PCRбуфера (500мМ КСІ, 100мМ Трис-НСl pH 8,3, 15мМ циклів та обладнання були описані вище. Після МgСІ2 та 0,01% (мас/об.) желатину), 1мкл 10мМ ампліфікації 20мкл повторно ампліфікованої реаксуміші dNTP, 2мкл (10пмоль) якірного праймера, ційної суміші аналізували на агарозному гелі та 1мкл (20пмоль) праймера 3а та 35мкл dH2O. Реак4мкл використали для субклонування PCRційну суміш нагрівали до 95°С на протязі 1 хвилипродуктів в векторі pCRII з використанням системи ни, а потім додавали 0,9мкл (4,5 одиниці) полімеклонування ТА [Frohman, М.А., Dush, М.К. & Martin, рази Ampiitaq. Реакцію проводили 40 циклів при G.R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998таких умовах: 94°С - 5 секунд, 50°С - 20 секунд та 9002] (Invitrogen). Після лігування на протязі ночі 72°С - 30 секунд. Один мікролітр цієї реакційної при 14°С, ліговані продукти використовували для суміші використовували для «гніздової» повторної трансформації Е. соlі. Одержані трансформанти ампліфікації з метою підвищення рівнів специфічзбирали та 3мл нічних культур використовували ного продукту для наступного виділення. Для подля приготування плазмідних мініпрепаратів. Розвторної ампліфікації використовували: 1мкл суміші міри вставок визначали з використанням EcoRIдля первинної ампліфікації, 5мкл 10 х PCRгідролізу плазмід та клони, які містять вставки, буфера, 1мкл 10мМ суміші dNTP, 2мкл (20пмоль) приблизно, розміру вихідного PCR-продукту, секуніверсального праймера для ампліфікації, 2мкл венували з використанням реагентів-термінаторів (20пмоль) праймера 4а та 38 мкл dH2O. Реакційну та флуоресцентного барвника (Prism, Applied суміш нагрівали до 95°С на протязі 1 хвилини, а Biosystems), та з використанням ДНК-секвенатора потім додавали 0,7 мкл (3,5 одиниці) полімерази Applied Biosystems 373. Послідовність PCRAmpiitaq. Реакцію проводили 40 циклів при таких продукту показана на Фіг.2. Послідовність ампліфіумовах: 94°С - 5 секунд, 50°С - 20 секунд та 72°С кованих праймерів підкреслена. 30 секунд. Ампліфіковані продукти аналізували С) Реакція 5'RACE шляхом електрофорезу в 0,8% агарозному гелі. Подовження кДНК, ідентифікованої за допомоБув знайдений переважаючий продукт, що містить гою RT-PCR, здійснювали з використанням систеблизько 1,2т.п.о. Два мікролітри продуктів реакції ми 5'RACE [Loh, E.Y., Eliot, J.F., Cwirla, S., клонували в вектор pCRII з набору для клонування Lanier.LL, & Davis, M.M. (1989) Science 243, 217ТА (Invitrogen) та інкубували на протязі ночі при 219; Simms, D., Guan, N., & Sitaraman, K., (1991) 14°С. Ці продукти лігування використовували для Focus 1399 (GIBCO)]. Один мікрограм РНК THP-1 трансформації E. соIі. Розміри вставок одержаних (оброблених окисленим ЛНГ), використаних спертрансформантів визначали шляхом EcoRIшу в реакціях диференціального відображення, гідролізу. Клони, які містять вставки приблизно використали в реакції 5'RACE: розміру вихідного PCR-продукту, секвенузали з 1мкл (1мкг) РНК об'єднували з 3мкл (3пмоль) використанням реагентів-термінаторів - флуореспраймера 2а та 11мкл DEPC-обробленої води, та центного барвника (Prism, Applied Biosystems), та з нагрівали до 70°С на протязі 10 хвилин, а потім використанням ДНК-секвентатора Applied витримували на протязі 1 хвилини на льоду. Потім Biosystems 373. Послідовність RACE-продукту, додавали 2,5мкл 10 х буфера для реакції (200мМ включаючи EcoRI-сайти від вектора ТА, показана Трис-НСІ pH 8,4, 500мМ КСІ), 3мкл 25мМ МgСІ2, на Фіг.3. Послідовності амплімерів (універсальний 1мкл 10мМ суміші dNTP та 2,5мкл 0,1М ДТТ. Цю ампліфікований праймер та праймер, комплеменсуміш інкубували на протязі 2 хвилин при 42°С, а тарний 5'RACE-праймеру 4а) підкреслені. потім додавали 1мкл обробленої транскриптази Приклад 2 Superscript II. Реакційну суміш інкубували ще 30 Кпонування та локалізація гена LLGXL на хрохвилин при 42°С, 15 хвилин при 70°С та 1 хвилину мосомі на льоду. Потім додавали один мікролітр РНКази А) Скринінг бібліотеки кДНК Н (2 одиниці) та суміш інкубували при 55°С на проПлацентарну бібліотеку кДНК людини (оліго dT тязі 10 хвилин. кДНК очищали з використанням та рандомізовано праймовану, кат. №5014b, серія колонок GlassMax [Sambrook, J. Fritsch, E.F. & #52033) одержували від Clontech (Palo Alto, CA). Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Радіоактивно мічений зонд створювали шляхом Manual, second edition, Cold Spring Harbor вирізання вставки плазміди, що містить описаний Laboratory Press, Plainview, NY], включених до навище PCR-продукт 5'RACE-реакції. Зонд радіоакбору. Цю кДНК елюювали з колонки в 50мкл dH2O, тивно мітили з використанням техніки рандомізоліофілізували та ресуспендували в 21мкл dH2O. ваного праймування: ДНК-фрагмент (50-100нг) Нарощування ланцюга кДНК здійснювали в такій інкубували з 1мкг рандомізованих гексамерів реакції: 7,5мкл dH2O, 2,5мкл буфера для реакції (Gibco) при 95°С на протязі 10 хвилин, а потім на (200мМ Трис-НСІ pH 8,4, 500мМ КСІ), 1,5мкл 25мМ льоду на протязі 1 хвилини. Потім при кімнатній МgСІ2, 2,5мкл 2мМ dCTP та 10мкл кДНК інкубуватемпературі були додані: 3мкл 10 х буфера Кле 33 75319 34 нова (100мМ Трис-НСІ pH 7,5, 50мМ МgСІ2, 57мМ пептиду [Higgins, D.G., & Sharp, P.M. (1988) Gene дитіотрейтол; New England Biolabs), 3мкл 0,5мМ 73, 237-244]. Передбачений пропептид має молекулярну масу 56800 Дальтон. Якщо припустити, dATP, dGTP, dTTP), 100мкКі -32PdCTP що розщеплення сигнального пептиду проходить в (3000Кі/ммоль, New England Nuclear) та 1мкл фраположенні 18, то молекулярна маса немодифікогменту Кленова ДНК-полімерази І (5 одиниць, ваного зрілого білка складає 54724 Дальтон. Gibco). Реакційну суміш інкубували на протязі 2-3 Повна схожість між цим білком та іншими вігодин при кімнатній температурі, а потім реакцію домими членами сімейства триацилгліцеролприпиняли шляхом підвищення об'єму до 100мкл з ліпази проілюстрована на Фіг.6 та в Таблиці 1. В використанням ТЕ, pH 8,0, та шляхом додання порівнянні первинних послідовностей, показаному EDTA до кінцевої концентрації 1мМ. Не включені на Фіг.6, LLG являє собою поліпептид (SEQ ID No: нуклеотиди вилучали шляхом підвищення об'єму 6), кодований кДНК (SEQ ID No: 5), яка описана в реакційної суміші до 100мкл, та її пропускання чеПрикладі 1, і далі позначається LLGN. За своїми рез центрифугову колонку G-50 (Boehringer аміно-кінцевими 345 залишками, цей білок є іденMannheim). Одержані зонди мали специфічну актичним до білка LLGXL. 9 унікальних залишків тивність, яка перевищує 5 108імп/хв/мкг ДНК. ідуть слідом за стоп-кодоном та продукують поліБібліотеку зондували стандартними методами пептид 39,3кДа та зрілий білок 37,3кДа. Послідов[Walter, P., Gilmore, R., & Blobel, G. (1984) Cell 38 , ності, які є загальними для LLGN та LLGXL, явля5-8]. Для цього фільтри гібридизували на протязі ють собою послідовність нуклеїнової кислоти SEQ 24 годин при 65°С в 4,8Х SSPE (20Х SSPE = 3,6М ID No: 9 та амінокислотну послідовність SEQ ID NaCI, 0,2М NaH2PO4, 0,02М EDTA, pH 7,7), 20мМ No: 10. Трис-НСІ pH 7,6, 1 х розчину Денхардта (100Х = Цікаво відзначити, що положення, в якому біл2% фікол 400, 2% полівінілпіролідон, 2% BSA), ки LLGN та LLGXL розрізняються, являє собою 10% сульфату декстрану, 0,1% ДСН, 100мкг/мл 6 ділянку, яка, як відомо зі структири іншої ліпази, ДНК сперми лосося та 1 10 імп/хв/мл радіоактивзнаходиться між аміно- та карбокси-доменами цих но міченого зонда. Потім фільтри промивали три білків. Тому білок LLGN, очевидно, складається з рази на протязі 15 хвилин при кімнатній темпераодного із двох доменів триацилгліцерол-ліпаз. Ця турі в 2 х SSC (1 х SSC = 150мМ NaCI, 15мМ цитпослідовність містить характерний мотив рат натрію, pH 7,0), 0,1% додецилсульфату натрію «GXSXG» ліпази в положеннях 167-171, а також (ДСН), а потім промивали три рази на протязі 15 консервативні залишки каталітичної тріади в Ser хвилин при 65°С кожен з 0,5 х SSC та 0,1% ДСН. 169, Asp 193 та His 274. Консервативність цистеїФаг, що гібридизувався з зондом, виділяли та амнових залишків (положення 64, 77, 252, 272, 297, пліфікували. ДНК очищали з ампліфікованого фага 308, 311, 316, 463 та 483), які приймають участь в з використанням реактиву LambdaSorb (Promega) дисульфідних зв'язках в інших ліпазах, дає підстау відповідності до інструкцій виробників. Вставки ву припустити, що білок LLGXL має структурну вирізували з фагової ДНК шляхом гідролізу ферсхожість з іншими ферментами. Є п'ять передбаментом EcoRI. Ці вставки субклонували в EcoRIчуваних сайтів N-глікозилування в положеннях сайт плазмідного вектора (Bluescript II SK, амінокислот 80, 136, 393, 469 та 491. ПослідовносStratagene). Шляхом описаного вище автоматичтями білка, які використовуються для порівняння, є ного секвенування була визначена послідовність ліпопротеїн-ліпаза людини (LPL; Genbank, номер відкритої рамки зчитування, яка знаходиться вседоступу #М15856, SEQ ID No: 13), ліпаза печінки редині 2,6т.п.o.-EcoRI-фрагмента кДНК. Ця послілюдини (HL, Genbank, номер доступу #J03540, довність показана на Фіг.4. Амінокослотна посліSEQ ID No: 14), панкреатична ліпаза людини (PL, довність передбаченого білка, кодованого Genbank, номер доступу #М93285, SEQ ID No: 15), відкритою рамкою зчитування, показана на Фіг.5, білок-1, споріднений з панкреатичною ліпазою та позначена LLGXL Було припущено, що перший людини (PLRP-1; Genbank, номер доступу метіонін кодується парами нуклеотидів 252-254. #М93283), білок-2, споріднений з панкреатичною Передбачений білок має довжину в 500 амінокисліпазою людини (PLRP-2; Genbank, номер доступу лот. Перші 18 амінокислот утворюють послідов#М93284), ність, характерну для секреторного сигнального Таблиця 1 Схожість сімейства генів тоиацилгліцерол-ліпаз LLGXL LPL HL PL PLRP1 PLRP2 LLGXL 42,7 36,5 24,5 22,5 22,6 LPL 42,7 40,0 22,8 22,7 20,9 Відсоток схожості оцінювали виходячи з порівняння пар основ первинних структур з використанням алгоритму Clustal [Camps, L., Reina.M., HL 36,5 40,0 22,8 24,0 22,0 PL 24,5 22,8 22,8 65,2 62,2 PLRP1 22,5 22,7 24,0 65,2 61,7 PLRP2 22,6 20,9 22,0 62,2 61,7 Llobera, M., Viiaro, S., & Olivecrona, T.(1990) Am. J. Physiol. 258, C673-C681] програми Megalign в наборі програм Lasergene Biocomputing Software 35 75319 36 Suite (Dnastar). хом двократного 15-хвилинного промивання фільВ) Локалізація на хромосомі трів 2 х SSC, 0,1% додецилсульфатом натрію при ДНК від клону Р1 [Sternberg, N., Ruether, J. & кімнатній температурі з наступним двократним 15DeRiel, K.The New Biologist 2; 151-62, 1990], що хвилинним промивання фільтрів 0,1 х SSC, 0,1% містить геномну ДНК LLG, мітили UTR (уридинтДСН при 62°С. Після промивання фільтри швидко рифосфатом) дигоксигеніну шляхом «нік»осушували, а потім експонували з плівкою Kodak транслації. Мічений зонд об'єднували з фрагменXAR-2 з підсилюючими екранами при -80°С. Ретованою ДНК людини та гібридизували з РНА, що зультати проілюстровані на Фіг.7, де показані вестимульована лімфоцитами периферичної крові, ликі мРНК-молекули, що складають приблизно 4,5 які взяті від донора чоловіка, в розчині, що містить тисяч пар основ. Були присутні також і менші мо50% формаміду, 10% сульфату декстрану та 2 х лекули довжиною 4,3 та 1,6 тисяч пар основ. ОчіSSC. Специфічні сигнали гібридизації детектували куваний розмір кДНК LLGN складав 1,6т.п.о. Посшляхом інкубування гібридизованих клітин з флулідовність LLGXL, очевидно, кодується великими оресцентно поміченими антитілами проти дигоксимолекулами детектованої мРНК. геніну з наступним контрастним забарвлюванням В) Експресія РНК LL.G в різноманітних тканиDAPI. Цей попередній експеремент призводив до нах людини специфічного мічення хромосоми групи Е, яка, Комерційно доступний готовий фільтр, що місвиходячи з DAPI-забарвлювання, є, очевидно, тить Змкг кожної з мРНК від різноманітних тканин хромосомою 18. людини (серця, головного мозку, плаценти, легень, Потім проводили інший експеримент, в якому печінки, скелетного м'яза, нирок та'підшлункової мічений біотином зонд, специфічний для центрозалози), одержували від фірми Clonetech (Catalog мери хромосоми 18, разом гібридизували LLG#7760-1). Цей фільтр зондували та обробляли, як зондом. Цей експеримент призводив до специфічописано вище. Після зондування радіоактивно ного забарвлення центромери хромосоми 18 черміченим фрагментом LLG та радіоавтогрфії, зонд воним та довгого плеча хромосоми 18 зеленим. очищали шляхом промивання в киплячому 0,1 х Виміри 11-ти специфічно мічених гібридизованих SSC, 0,1% ДСН в інкубаторі при 65°С на протязі хромосом 18 показали, що LLG має Fiter 0,67 (ви2x15 хвилин. Потім мембрани зондували з викориміри за Франку 0,38), що відповідає смузі 18q21. станням ДНК-фрагмента в 1,4т.п.о., що кодує ліДеякі спадкові захворювання, включаючи внутрішпопротеїн-ліпазу людини. Цей фрагмент одержуньопечінковий холестаз, колбочко-паличкову дисвали шляхом полімеразної ланцюгової реакції зі трофію (сітківки) та спадковий остеоліз, очевидно, зворотною транскриптазою (RT-PCR) РНК від кліобумовлені дефектами на цій ділянці хромосоми. тин ТРН-1 (оброблених РМА та окис. ЛНГ) з викоПриклад 3 ристанням 5'LPL- та 3'LРL-праймерів, показаних Аналіз РНК LLG на Фіг.1, та умов RT-PCR, описаних вище. Після А) Експресія РНК LLG в клітинах ТРН-1 авторадіографії мембрани знову очищали та знову Аналіз мРНК, з яких одержують кДНК, здійсзондували радіоактивно міченим фрагментом нювали шляхом Нозерн-аналізу РНК ТНР-1. РНК кДНК бета-актину людини для нормалізації вмісту від цих клітин одержували як описано вище. Цю РНК. Результати цих аналізів проілюстровані на мРНК виділяли з повної РНК з використанням сисФіг.8. Найвищі рівні транскрипту LLG виявлялися в теми poly-dT-магнітних сфер (Polyattract system, РНК плаценти, а найнижчі рівні виявлялися в РНК, Promega). Три мікрограми роІу(А)-вміснрї мРНК які походять від тканин легень, печінки та нирок. У піддавали електрофорезу на 1% агарозному форвідповідності до попередніх досліджень інших авмальдегідному гелі. Цей гель промивали на протяторів [Verhoeven, A.J.M., Jansen, H. (1994) зі 30 хвилин в dH2O. РНК переносили в умовах Biochem. Biophys. Acta 1211, 121-124], транскрипт вакууму на найлонову мембрану з використанням ліпопротеїн-ліпази виявлявся в багатьох тканинах, лужного буфера для перенесення (3М NaCI, 8мМ при цьому найбільші рівні виявлялися в тканинах NaOH, 2мМ саркозил). Після перенесення, блот серця та скелетного м'яза. Результати цих аналізів нейтралізували шляхом інкубування на протязі 5 показали, що розподіл експресії LLG в тканинах хвилин в 200мМ фосфатному буфері, pH 6,8. РНК дуже відрізняється від розподілу LPL. Характер перехресно зшивали з мембраною з використанекспресії LLG також відрізняється від характеру ням приладу для УФ-зшивання (Stratagene). експресії ліпази печінки або панкреатичної ліпази, Зонд одержували шляхом вирізання вставки як повідомлялось іншими дослідниками [Wang, C.плазміди, що містить 5'ВДСЕ-продукт PCR-реакції, S., & Hartsuck, J.A. (1993) Biochem. Biophys. Acta описаний вище. Цей зонд піддавали радіоактив1166, 1-19; Semenkovich, C.F., Chen S.-W., Wims, ному міченню з використанням техніки рандомізоM., Luo C.-C, Li, W.-H., & Chan, L. (1989) J. Lipid ваного праймування, яка описана в Прикладі 2. Res. 30, 423-431; Adams, M.D., Kerlavage, A.R., Фільтри попередньо гібридизували в розчині Fields, С, & Venter, С. (1993) Nature Genet. 4, 256для швидкої гібридизації QuikHyb (Stratagene) на 265]. протязі 30 хвилин при 65°С. Радіоактивно мічений Для визначення характеру експресії в інших 6 зонд (1-2 х 10 імп/хв/мл) та оброблену ультразвутканинах людини, інша комерційно доступна мемком ДНК сперми лосося (кінцева концентрація брана була зондована з використанням кДНК 100мкг/мл) денатурували шляхом нагрівання на LLGXL. Цей дот-блот (РНК людини Master Blot, протязі 10 хвилин до 95°С та швидко охолоджуваClontech Cat. #7770-1) містив 100-500нг мРНК з 50 ли льодом, після цього переносили на фільтр в різноманітних тканин та був нормалізований на розчин QuikHyb. Гібридизацію проводили 3 години еквівалентну експресію генів «домашнього госпопри 65°С. Негібридозований зонд вилучали шлядарства» [Chan, L, & Morin, R. (1971) Biochem. 37 75319 38 Biophys. Acta 231, 194-197]. 1,6т.п.о. Dral-Srflцьому найвищі рівні спостерігались в плаценті, а фрагмент кДНК LLGXL мітили 32PdCTP з викориснайнижчі рівні спостерігались в легенях, печінці та танням рандомізованої системи олігонуклеотиднонирках. В фетальній печінці, нирках та легені таго праймування (Prime It II, Stratagene) у відповідкож експресувалися майже ті ж самі рівні, що й у ності до інстукцій виробника. Після 30-хвилинної тканинах дорослих індивідуумів. Несподівано було передгібридизації при 65°С, зонд додавали до гібзнайдено, що зі всіх представлених тканин, тканиридизованого розчину QuikHyb при ни щитовидної залози експресували найвищі рівні, які складали 122% від рівня, що експресується в 1,3 106імп/хв/мл. Гібридизацію проводили на протканинах плаценти. Хоча експресія ліпази в платязі 2 години при 65°С. Негібридозований зонд центі спостерігалась раніше [Rothwell, J.E., Elphick, вилучали шляхом двократного промивання фільтM.C. (1982) J. Dev. Physiol. 4, 153-159; Verhoeven, рів 2 х SSC на протязі 15 хвилин, а потім 0,1% доA.J.M., Carling D., & Jansen H. (1994) J. Lipid Res. децилсульфатом натрію при кімнатній температурі 35, 966-975; Burton, B.K., Mueller, H. W. (1980) з наступним двократним промивання на протязі 15 Biochem. Biophys. Acta 618, 449-460], однак ексхвилин в 0,1 х SSC, 0,1% ДСН при 62°С. Після пресія якої-небудь ліпази в щитовидній залозі рапромивання фільтри піддавали швидкому сушінніше не спостерігалась. Ці результати дають підсню, а потім експонували з плівкою Kodak XAR-2 з таву припустити, що експресія LLG може сприяти використанням підсилюючих екранів при -80°С, в збереженню плаценти, де LLG може служити для різні періоди часу. Одержані зоброження кількісно вивільнення вільних жирних кислот з субстратів, оцінювали за допомогою денситометрії. Результатаких як, фосфоліпіди, як джерел енергії. LLG, що ти наведені в Таблиці 2. Відносні рівні експресії в експресований в щитовидній залозі, може служити тканинах, визначені за допомогою Нозеранпопередником для синтезу біологічно активних аналізу безлічі тканин та за допомогою дот-блотів, молекул цією залозою. одержаних з безлічі тканин, були аналогічні, при Таблиця 2 Експресія мРНК LLG в різноманітних тканинах людини весь головний чорна речовин.з. мозок на скронева часмигдалик н.з. тина хвіст ядра н.з. таламус підбугорне ядмозочок 4 ро кора головного н.з. спинний мозок мозку н.з. матка н.з. передміхурова залоза н.з. шлунок н.з. н.з. яєчка н.з. гіпокамп н.э. аорта н.з. гіпофіз нирки 12 тонка кишка 44 трахея 62 плацента 100 головний мо6 5 зок плоду н.з. селезінка підшлункова залоза н.з. серце 29 н.з. печінка 9 н.з. яєчник лобна частка 5 молочна залон.з. легені за н.з. серце плоду н.з. н.з. тимус н.з. нирка плоду 56 периферичний н.з. печінка плоду 14 лейкоцит селезінка н.з. лімфовузол н.з. н.з. плоду н.з. довгастий монадниркова н.з. скелетний м'яз н.з. зок залоза потилична часщитовидна зан.з. товста кишка 8 122 кістковий мозок н.з. тимус плоду тина лоза шкаралупа н.з. сечовий міхур н.з. слинна залоза н.з. апендикс 7 легеня плоду Ці величини являють собою відсотки експресії; при цьому рівні в тканинах плаценти були довільно прийняті за 100%. Ці величини являють собою середні значення з денситометричних вимірювань, одержаних з двох авторадіографічних експонувань, н.з. - не знаходили. С) Експресія РНК LLG в культивованих ендотеліальних клітинах Ендотеліальні клітини пупкової вени людини (HUVEC) та ендотеліальні клітини коронарної артерії людини (НСАЕС) одержували від Clonetics. HUVEC були розмножені в комерційно доступному середовищі для росту ендотеліальних клітин (EGM, Clonetics), в яке було додано 3мг/мл екстракту бичачого головного мозку [Масіад, Т., Cerundolo, J., llsley, S., Kelley, P.R., & Forand, R. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 5674-5678], н.з. 8 Clonetics, а НСАЕС були розмножені в середовищі EGM, в яке було додано 3мг/мл екстракту бичачого головного мозку та 3% фетальної бичачої сироватки (в кінцевій концентрації 5%). Клітини культивували до досягнення конфлюєнтності, після чого це середовище замінювали на середовище EGM, яке не містило екстракту бичачого головного мозку. Культури стимулювали шляхом додання 100нг/мл міристату форболу (Sigma). Після 24годинного інкубування, РНК екстрагували з клітин методом з використанням тризолу, описаним вище. Двадцять мікрограмів повної РНК піддавали електрофорезу та переносили на мембрану для аналізу. Мембрани зондували LLG- та LPLзондами, як описано вище. Результати проілюстровані на Фіг.9. Двадцять мікрограмів повної РНК з клітин ТНР-1, стимульованих РМА, піддавали блот-аналізу для порівняння. РНК, яка гібридизу 39 75319 40 ється з LLG-зондом, знаходили в нестимульованих зразки центрифугували на протязі 5 хвилин при та РМА-стимульованих клітинах HUVEC. На про150 х g. Потім середовище відсмоктували та сетивагу цьому, рівні мРНК LLG, що детектуються, фарозу промивали 14мл PBS. Після центрифугувиявлялись лише в культурах НСАЕС після стивання та відсмоктування, осаджену гепаринмуляції РМА. У відповідності до попередніх дослісефарозу суспендували в 200мкл 2 х ДСН-буфера джень інших авторів, якого-небудь рівня мРНК для завантаження (4% ДСН, 20% гліцерин, 2% (3ліпопротеїн-ліпази, що детектується, не було меркаптоетанол, 0,002% бромфеноловий синій та знайдено в жодній з ендотеліальних РНК 120мМ Трис, pH 6,8). Зразки нагрівали до 95°С на [Verhoeven, A.J.M., Jansen, H. (1994) Biochem. протязі 5 хвилин та 40мкл зразків наносили на Biophys. Acta 1211, 121-124]. 10%-ний Трис-гліциновий гель з ДНС. Після електПриклад 4 Аналіз на білок LLG рофорезу при 140В приблизно на протязі 90 хвиА) Одежання антитіл лин білки переносили на нітроцелюлозні мембраПродукували антисироватку проти пептидів, ни за допомогою апарата для електроблотингу що мають послідовність відповідну до ділянки, яка, Novex (210В, 1 година). Мембрани блокували на як припускають, кодується відкритою рамкою зчипротязі 30 хвилин в блокуючому буфері (5% знетування кДНК LLG. Був вибраний саме цей пептид, жирене сухе молоко, 0,1% Твін-20, 150мМ хлорид оскільки він має високий передбачений індекс аннатрію, 25мМ Трис, pH 7,2). Антипептидні антиситигенності [Jameson В.А. & Wolf, H. (1988) Comput. роватки та нормальну кролячу сироватку розводиApplic. In the Biosciences 4, 181-186]. Послідовність ли 1:5000 в блокуючому буфері та інкубували з імунізуючого пептиду не була виявлена ні в одномембранами на протязі ночі при 4°С при делікатму з білків або в трансльованій ДНК-послідовності, ному помішуванні. Потім мембрани 4 рази на прощо є в базі даних Genbank. Відповідне положення тязі 15 хвилин промивали TBST (0,1% Твін-20, цієї послідовньості в білку LLG показане на Фіг.10. 150мМ хлорид натрію, 25мМ Трис, pH 7,2). Козячі Карбокси-кінцевий цистеїн цього пептиду не відпоантикролячі антисироватки, кон'юговані з пероксивідає залишку в передбачуваному білку LLG, але дазою (Boehringer Mannheim) розводили 1:5000 в він був введений для полегшення зв'язування з блокуючому буфері та інкубували, перемішуючи, з білком-носієм. Цей пептид синтезували на синтемембраною на протязі 1 години. Ці мембрани прозаторі пептидів Applied Biosystems Model 433A. мивали, як описано вище, а потім піддавали реакДва міліграми пептиду об'єднували з двома мілігції з хемілюмінісцентним реагентом Renaissance рамами активованого малеімідом гемоціаніну лім(DuPont NEN) та експонували з плівкою Kodak фи слимака у відповідності з інструкціями, що доXAR-2. Результати наведені на Фіг.11. В зразках даються до набору Imject Activated Immunogen від нестимульованих клітин HUVEC та НСАЕС Conjugation Kit (Pierce Chemical). Після знесолюбули присутні два види імунореактивних білків. вання половину цього кон'югату емульгували з Рівні імунореактивного білка в нестимульованих використанням рівного об'єму повного ад'юванту зразках НСАЕС були набагато нижчими, ніж рівні, Фрейда (Pierce). Цю емульговану суміш вводили які відповідають зразку HUVEC. Після стимуляції новозеландським білим кроликам. Через чотири РМА три імунореактивних білки були секретовані тижні після первісної інокуляції, була зроблена ендотеліальними клітинними культурами. Оброббустер-інокуляція, при цьому емульгування проволяння РМА значно підвищило рівень білків LLG, дили так само, як було описано вище, за винятком продукованих культурами НСАЕС. РМАтого, що використовували неповний ад'ювант індукування білків LLG в культурах HUVEC не відіФрейда (Pierce). Через два тижні після бустергравало істотної ролі. інокуляція брали пробу крові та титри специфічних Приклад 5 Продукування рекомбінантного білантитіл визначали за допомогою аналізу ELlSA з ка LLG використанням iмобілізованого пептиду. Наступну А) LLG-експресуючі конструкції бустер-інокуляція проводили через місяць після кДНК, що кодує білки LLGN і LLGXL, клонувапершої бустер-інокуляції. ли в експресуючий вектор pCDNA3 ссавця В) Вестерн-аналіз середовища від ендотеліа(Invitrogen). Цей вектор дозволяє експресувати льних клітинних культур чужородні гени в багатьох клітинах ссавців завдяКлітини HUVES та НСЕАС культивували та ки використанню головного пізнього промотора стимулювали РМА, як описано в Прикладі 3С, за цитомегаловіруса. Цей 5'RAСЕ-продукт LLGN кловинятком того, що клітини стимулювали РМА на нували в EcoRI-сайт pCDNA3. кДНК LLGXL гідроліпротязі 48 годин. Зразки кондиціонованого серезували ферментами Dral та Srfl з одержанням довища (9мл) інкубували з 500мкл 50%-ної сукДНК розміром 1,55т.п.о. (див. Фіг.4). Одержаний спензії гепарину-сефарози CL-6B в забуференому вектор гідролізували рестриктуючим ферментом фосфатом фізіологічному розчині (PBS, 150мМ EcoRV, а потім вектор та вставку лігували з викохлорид натрію, 100мМ фосфат натрію, pH 7,2). ристанням ДНК-лігази Т4 та реагентів з набору Для часткового очищення та концентрування білдля швидкого лігування Rapid Ligation Kit ків LLG була вибрана саме гепарин-сефароза, (Boehringer Mannheim) у відповідності з інструкціяоскільки консервативність залишків в послідовносми виробників. Ці ліговані продукти були використі LLGXL була ідентифікована як критична для тані для трансформації компетентної Е.соIі. Одергепарин-зв'язуючої активності LPL [Ma, Y., жані колонії скринували шляхом рестрикційного Henderson, H.E., Liu, M.S., Zhang, H., Forsythe, I.J., аналізу та секвенували на присутність та орієнтаClarke-Lewis, I., Hayden, M.R., & Bruzell, J.D., J. цію вставки в експресуючому векторі. Lipid Res. 35, 2049-2059; та на Фіг.6). Після вихроВ) Короткочасна трансфекція LLG в клітинах вого перемішування при 4°С на протязі 1 години, COS-7 41 75319 42 LLG-експресуючі вектори вводили в клітини LLG у тварин різних видів COS-7 з використанням катіонного ліпідного реаА) Клонування кролячого гомолога LLG гента ліпофектаміну (GIBCO). За 24 години до Комерційно доступну бібліотеку кДНК лямбда, трансфекції, клітини COS-7 висівіли на 60ммяка походить від тканини легені кролика (Clontech, чашки для культивування тканини при густині кат. #TL1010b), використовували для виділення 5 фрагмента кролячого гомолога гена LLG. П'ять 2 10 клітин/чашка. Ці клітини розмножували в момікролітрів вихідної бібліотеки додавали до 45мкл дифікованому за способом Дульбеко середовищі води та нагрівали до 95°С на протязі 10 хвилин. Ігла (DMEM; GIBCO), в яке були додані 10% фетаБули додані такі матеріали в кінцевому об'ємі льна сироватка теляти, 100од/мл пеніциліну та 100мкл: 200мкМ dNTP, 20мМ Трис-НСІ, pH 8,4, 100мкг/мл стрептоміцину. До 300мкл безсировато50мМ-КСІ, 1,5мМ МgСІ2, 100мкМ кожного з прайчного середовища Optimem I (Gibco) додавали мерів DLIP774 та LLGgen2a, і 2,5 одиниці полімеодин мікрограм плазмідної ДНК. Десять мікролітрів рази Taq (GIBCO). Реакцію проводили за 35 терліпофектамінового реагенту розводили в 300мкл моциклів при таких умовах: 15 секунд - 94°С, 20 середовища Optimem І та цей розчин об'єднували секунд - 50°С, 30 секунд - 72°С. 10 мікролітрів цієї з розчином ДНК, і залишали для перемішування реакційної суміші аналізували за допомогою елекпри кімнатній температурі на протязі 30 хвилин. трофорезу в агарозному гелі. Був знайдений проПотім середовище вилучали з чашок та клітини дукт приблизно в 300 пар основ. Частину (4мкл) промивали 2мл середовища Optimem І. Розчин цієї реакційної суміші використовували для клонуДНК та ліпофектаміну додавали в чашки разом з вання продукту за допомогою системи клонування 2,7мл середовища Optimem, та ці чашки інкубуваТА. Вставку одержаного клона секвенували (SEQ ли на протязі 5 годин при 37°С. Після інкубування ID No: 11). Порівняння первинних виведеної кробезсироваточне середовище вилучали та замінялячої амінокислотної послідовності (SEQ ID No: ли середовищем DMEM, в яке були додані 2% FBS 12) та відповідної послідовності «ДНК людини тата антибіотики. Через 12 годин після трансфекції кож показано на Фіг.14. Для нуклеотидів, які не є певну частину культур обробляли або 0,25мМ частиною будь-якого праймера для ампліфікації, Pefablos SC (Boehringer Mannheim), або інгібітором спостерігалася 85,8%-на подібність між кролячою протеази, або 10од/мл гепарину. За 30 хвилин до послідовністю та послідовністю LLG людини. Пезбору, оброблені гепарином зразки обробляли ще редбачений білок, кодований цією кролячою кДНК, 40од/мл гепарину. Середовище вилучали з клітин має 94,6%-ну ідентичність з білком людини, при через 60 годин після трансфекції. До 1мл середоцьому більшість нуклеотидних замін знаходиться в вища додавали гепарин-сефарозу CL-4B (200мкл третьому положенні або в положеннях несуворої 50% суспензії в PBS, pH 7,2) та розмішували при відповідності («гойдалок») кодонів. Слід осрбливо 4°С на протязі 1 години. Потім сефарозу осаджувідзначити, що ця ділянка охоплює послідовність вали шляхом центрифугування при низькій швид«кришки» передбачених білків LLG та являє собою кості та три рази промивали 1мл холодного PBS. варіабельний домен в сімействі генів ліпази. ОчеЦю сефарозу осаджували та суспендували в видно, це забезпечує високий ступінь консервати100мкл 2 х буфера для завантажування. Зразки вності цього гена для різноманітних видів. нагрівали до 95°С на протязі 5 хвилин. 40мкл кожВ) LLG в інших видах ного із зразків наносили на 10% ДСН-ПААГ-гель. Для демонстрації присутності генів LLG в інЕлектофорез та вестерн-аналіз здійснювали з виших видах, геномні ДНК від різних видів гідролізукористанням антисироватки проти LLG, як описано вали рестриктуючим ферментом EcoRI, виділяли вище. Результати наведені на Фіг.12. Білки з коншляхом електрофорезу в агарозних гелях та блодиціонованого середовища від НСАЕС були вклютували на нітроцелюлозних мембранах. чені для порівняння розмірів. LLGN мігрує приблиМембрани гібридизували на протязі ночі при зно при 40кДа, що відповідає найнижчій смузі в 65°С з 2,5 106імп/хв/мл рандомізовано праймоваНСАЕС. Середовище від клітин COS, трансфікованих кДНК LLGXL, містить типи білка 68кДа та ного зонда 32P-LLG або 32Р-LРL (ліпопротеїнліпа40кДа. При оброблянні цих клітин гепарином кільза) в розчині для гібридизації: 6 х SSC, 10% сулькість білків 68кДа та 40кДа, виділених з середовифат декстрану, 5 х розчин Денхардта, 1% ДСН та ща, різко збільшувалась, що вказувало або на ви5мкг/мл ДНК сперми лосося. Ці мембрани промивільнення з клітинної поверхні білка, зв'язаного з вали 0,1 х SSC, 0,5% ДСН на протязі 10 хвилин протеогліканом, або на стабілізацію цих білків гепри кімнатній температурі, а потім послідовно на парином. При оброблянні клітин інгібітором протепротязі 10 хвилин при температурі 40°С, 50°С та ази Pefabloc кількість білка 68кДа збільшувалась в 55°С. Авторадіограми блотів показані на Фіг.16. порівнянні з білком типу 40кДа. Це дає підставу На Фіг.16 проілюстровано присутність генів припустити, що білок з нижчою молекулярною маLLG та LPL у всіх видах, що оцінювались, за винясою, який продукується цими клітинами, являє тком того, що гібридизації з зондом LLG проти ДНК собою продукт протеолізу більшої 68кДа-форми. пацюка не спостерігалось. Виняткові дані, одержаРоль мРНК, яка ідентифікована за допомогою дині для пацюків, можуть представляти артефакт, ференціального відображення, що кодує коротші викликаний генеруванням рестрикційних фрагменвиди білка 40кДа, до цього часу не відома. Однак тів аномального розміру, що містять послідовністі повідомлялося, що була одержана, альтернативно LLG. Такі фрагменти можуть знаходитись поза сплайсованій, форма ліпази печінки, яка, очевидмежами фракціонування агарозного гелю або моно, експресується тканиноспецифічним чином та жуть бути наслідком неефективного блотування. повинна продукувати усічений білок. Різні смуги, знайдені за допомогою дѐох зондів, Приклад 6 вказують на те, що LPL та LLG являють собою 43 75319 44 окремі еволюційно консервативні гени. 3,25мл метанолу-хлороформу-гептану Приклад 7 (1,41:1,25:1) (об/об/об), а потім 1,05мл 0,1М калійФерментативна активність LLGXL карбонатного/боратного буфера (pH 10,5). Після A) Фосфоліпазна активність інтенсивного розмішування на протязі 15 секунд, Кондиціоновані середовища від клітин COS-7, зразки центрифугували на протязі 5 хвилин при які короткочасно експресують ліпопротеїн-лірпазу 1000об/хв. 1,0мл-аліквоту верхньої водної фази людини (LPL), LLGN або LLGXL, аналізували на оцінювали в сцинтиляційному лічильнику. Резульфосліпазну активність. Мінімальне підтримуюче тати цих аналізів показані на Фіг.15. середовище (MEM), що містить 10% FBS (MEM), Приклад 8 використовували як сліпий контроль, а кондиціоВикористання LLG-поліпептиду для скринінгу з новане середовище від клітин COS-7, трансфікометою виявлення агоністів або антагоністів ваних антизмістовною LLGXL-плазмідою (AS), виРекомбінантний LLG продукували в клітинах користовували як негативний контроль. комах, інфікованих бакуловірусом. Рекомбінантний Фосфатидилхолінову (PC) емульсію готували з LLG очищали з кондиціонованого середовища, яке використанням 10мкл фосфатидилхоліну (10мМ), містить або нe містить сироватку, за допомогою 14 40мкл С-фосфатидилхоліну, дипальмітоїлу хроматографії на гепарин-сефарозі, а потім за (2мкКі), міченого в 1 і 2 положеннях, та 100мкл допомогою хроматографії на катіонообмінній смоТрис-TCNB (100мМ Трис, 1% Тритон, 5мМ СаСІ2, лі. Якщо це було необхідно, то при очищенні LLG 200мМ NaCI, 0,1% BSA). Одержану емульсію упавикористовували третю хроматографічну стадію, рювали на протязі 10 хвилин, а потім додавали до таку як, гель-фільтрація. Під час очищення антитікінцевого об'єму 1мл в Трис-TCNB. ла проти пептидів використовували для моніториРеакції проводили в дублікаті та вони містили нгу білка LLG, a фосфоліпазний аналіз використо50мкл емульсії PC і 950 мкл середовища. Зразки вували для визначення LLG-активності. ікубували в водяній бані зі струшуванням на проУ флуоресцентному аналізі кінцеві умови анатязі 2-4 годин при 37°С. Реакції закінчували шлялізу передбачали використання приблизно 10мм хом додання 1мл 1н НСІ, а потім екстрагували 4мл Трис-НСІ (pH 7,4), 100мМ КСІ, 2мМ СаСІ2, 5мкМ 2-пропанолтексан (1:1). Верхній 1,8мл гексановий С6NBD-РС{1-ацил-2-[6-(нітро-2,1,3-бензоксадіазолшар пропускали через колонку з силікагелем та 4-ил)]аміно}капроїл-фосфатидилхолін, та білок виділені жирні кислоти, що не містять 14С і які знаLLG (прибл. 1-100нг). Реакційну суміш піддавали ходяться в проточній фракції, кількісно оцінювали флуоресцентному збудженню при 470нм та здійсв сцинтиляційному лічильнику. Результати цих нювали моніторинг ферментної активності, що аналізів показані на Фіг.14. вимірювалась за флуоресцентним випроміненням B) Триацилгліцерол-ліпазна активність при 540нм. Потім сполуки та/або речовини, що Кондиціоноване середовище від клітин COS-7, тестуються на стимуляцію та/або інгібування LLGякі короткочасно експресують ліпопротеїн-лірпазу активності, додавали в вигляді 10-200мМ розчинів людини (LPL), LLGN або LLGXL, аналізували на в диметилсульфоксиді. Сполуки, які стимуляють тригліцерол-ліпазну активність. MEM, що містить або інгібують LLG-активність, ідентифікували як 10% FBS, використовували як сліпий контроль, а сполуки, що викликають підвищення або зниження кондиціоноване середовище з клітин COS-7, транфлуоресцентного випромінення при 540нм. сфікованих антизмістовною LLGXL-плазмідою В цьому тіо-аналізі кінцеві умови аналізу пе(AS), використовували як негативний контроль. редбачали використання приблизно 25мМ ТрисКонцентрований субстрат одержували в виНСІ (pH 8,5), 100мМ КСІ, 10мМ СаСІ2, 4,24мМ Тригляді безводної емульсії міченого триолеїну, [9,10тон Х-100, 0,5мМ 1,2-біс(гексаноїлтіо)-1,23 H(N)] та неміченого триолеїну (кінцевий вміст подидезокси-зп-гліцеро-3-фосфорилхолін, 5мМ 4,4'дитіобіспіридин (з 50мМ вихідного розчину в етавного триолеїну = 150мг при 6,25 108імп/хв), яку нолі), та 1-100нг рекомбінантного LLG. Фосфоліпастабілізували шляхом додання 9мг лецитину в зну активність визначали шляхом вимірювання 100% гліцерину. 0,56мл 3Н-триолеїну (0,28мКі) збільшення погилинання при 342нм. Сполуки змішували з 0,17мл неміченого триолеїну та 90мкл та/або речовини, що тестуються на стимуляцію лецитину (9мг). Одержану суміш упарювали в пота/або інгібування LLG-активності, додавали в витоці азоту. Осушену ліпідну суміш емульгували в гляді 10-200мМ розчинів в диметилсульфоксиді. 2,5мл 100% гліцерину шляхом обробляння ультСполуки, які стимуляють або інгібують LLGразвуком (30-секундні імпульси на рівні 2 з наступактивність, ідентифікували як сполуки, що виклиними 2-секундними циклами охолодження на прокають підвищення або зниження поглиняння при тязі 5 хвилин). 342нм. Субстрат для аналізу був одержаний шляхом Приклад 9 розведення 1 об'єму концентрованого субстрату Трансгенні миші, що експресують LLG людини чотирма об'ємами 0,2М Трис-НСІ-буфера (pH 8,0), Для подальшого дослідження фізіологічної що містить 3% мас/об, альбуміну бичачої сироватролі-LLG були продуковані трансгенні миші, що ки, в якому була відсутня жирна кислота. Розведеекспресують LLG людини. ний субстрат інтенсивно перемішували на протязі Рестрикційний 1,53т.п.o.-Dral/Srfl-фрагмент, 5 секунд. що кодує LLGXL (див. Фіг.4), клонували в плазмідРеакціїпроводили в дублікаті в повному об'ємі ний вектор (pHMG) нижче промотора для гена ре0,2мл, що містить 0,1мл субстрату для аналізу і дуктази, що конститутивно експресується, 30,1мл указаного кондиціонованого середовища. гідрокси-3-метилглутарил-конформента A (HMG Реакційні суміші інкубували на протязі 90 хвилин СоА). Трансгенні миші, в яких експресувались різні при 37°С. Реакції припиняли шляхом додання 45 75319 46 рівні LLGXL людини, одержували стандартними ний продукт в 983 п.о. для всіх чотирьох зразків методами [див., наприклад, G.L. Tromp et al., Gene судинної біопсії. Експресія LLG виявлялась у трьох 1565: 199-205, 1995]. Цих трансгенних мишей виз чотирьох зразків, а в зразку, взятому з сонної користовували для визначення впливу надекспреартерії, цієї експресії не спостерігалось. сії LLGXL на ліпідний профіль, судинну патологію, Всі обговорювані роботи вводяться в цей опис швидкість розвитку та тяжкість атеросклерозу, та через посилання. інших фізіологічних параметрів. Для кожного фахівця очевидно, що цей винаПриклад 10 хід може бути легко адаптований для здійснення Експресія LLG в атеросклеротичних тканинах мети винаходу та досягнення потрібних результаЕкспресію LLGXL при атеросклерозі оцінюватів і вищезгаданих переваг цього винаходу. Пепли шляхом проведення полімеразної ланцюгової тиди, полінуклеотиди, способи, процедури та техреакції зі зворотною транскриптазою (RT-PCR) з ніка, олисані в цій заявці, наведені як переважні використенням мРНК, що виділена за допомогою варіанти здійснення винаходу та приводяться з судинної біопсії від чотирьох пацієнтів з атероілюстративною метою, а тому вони не повинні розсклерозом. Зразки тканин брали зі стінки аорти глядатися як такі, що обмежують об'єм винаходу. (один зразок), клубової артерії (два зразки) та сонВ цей винахід можуть бути внесені зміни та інші ної артерії (один зразок). варіанти його використання, однак, вони не повинБіопсію з атеросклеротичних судин одержувані виходити за межі сутності та об'єму винаходу, ли з клініки (Gloucesterhire Royal Hospital, England), що зформульовані в формулі винаходу, яка додапісля чого одержували роІу(А)+мРНК та ресуспенється. дували в обробленій діетилпірокарбонатом Список послідовностей (DEPC) воді при концентрації 0,5мкг/мкл мРНК. (1) Загальна інформація: Реакції зі зворотною транскриптазою здійснювали (і) Заявник: Jaye, Michael С. у відповідності до протоколу Gibco BRL, що додаDoan, Kim-Ann Т. ється до системи попередньої ампліфікації Krawiec, John A. (Superscript Preamplification System) для синтезу Lynch, Kevin J. першого ланцюга кДНК. Коротко, кДНК синтезуваAmin, Dilip V. ли таким чином: 2мкл кожної з мРНК додавали до South, Victoria J. 1мкл oІіgо(аТ)12-18-праймера та 9мкл DEPC-води. (ii) Назва винаходу: Поліпептиди LLG сімейстПробірки інкубували на протязі 10,хвилин при 70°С ва триацилгліцерол-ліпаз, композиції та способи їх та ставили на 1 хвилину на лід. До кожної пробірки використання в ферментативному гідролізі, та тедодавали такі компоненти: 2мкл 10 х PCR-буфера, рапія з використанням білків та генів 2мкл 25мМ МgСі2, 1мкл 10мМ dNTP-суміші та 2мкл (ііі) Кількість послідовностей: 31 0,1М ДТТ. Після 5-хвилинного витримування при (iv) Поштова адреса: 42°С, додавали 1мкл (200 одиниць) зворотної тра(A) Адреса: Rhone-Poulenc Rorer Inc. скриптази Super Script II. Реакційну суміш злегка (B) Вулиця: 500 Arcola Rd. 3C43 розмішували, а потім інкубували 50 хвилин при (C) Місто: Collegeville 42°С. Реакції закінчували шляхом інкубування на (D) Штат: PA протязі 15 хвилин при 70°С, а потім реакційні су(E) Країна: США міші ставили на лід. мРНК, що залишилася, руйну(F) Поштовий індекс: 19426 вали шляхом додання в кожну пробірку 1мкл (v) Форма комп'ютерного зчитування: РНКази Н, та інкубували на протязі 20 хвилин при (A) Тип носія: гнучкий диск 37°С. (B) Комп'ютер: PC сумісна з IBM PCR-ампліфікацію здійснювали з використан(C) Операційна система: PC-DOS/MS-DOS ням 2мкл кДНК-реакційної суміші. В кожну з пробі(D) Програмне забезпечення: Patentin Release рок додавали такі компоненти: 5мкл 10 х PCR# 1.0, Version # 1.30 буфера, 5мкл 2мМ dNTP-суміші, 1мкл hllg-gspl(vi) Дані цієї заявки: праймера (20пмоль/мл, див. Фіг.1), 1мкл hllg(А) Номер заявки: US gsp2а-праймера (20пмоль/мл, див. Фіг.1), 1,5мкл (B) Дата подання: 50мМ МgСІ2, 0,5мкл полімерази Taq (5од/мл) та (C) Класифікація: 34мкл води. Після витримування реакційних сумі(viii) Дані про повіреного/агента: шей на протязі 2 хвилин при 95°С, проводили 30 (A) Ім'я, прізвище: Fehlner Ph.D., Paul F. циклів PCR при таких умовах: 15 секунд при 94°С, (B) Реєстраційний номер: 35135 20 секунд при 52°С та 30 секунд при 72°С. Заклю(C) Номер документа/досьє: A2582-WO чні реакції проводили на протязі 10 хвилин при (іх) Телекомунікаційні дані: 72°С, а потім здійснювали аналіз за допомогою (A) Телефон: (610) 454-3839 електрофорезу в агарозному гелі, hllg-gsp(B) Телефакс: (610) 454-3808 праймери є специфічними до LLG та дають очіку(2) Дані послідовності SEQ ID No: 1: ваний продукт в 300п.о. В паралельній PCR було (і) Характеристики послідовності: показано, що реакції синтезу кДНК були успішнми, (A) Довжина: 367 пар основ при цьому використовували праймери, що є спе(B) Тип: нуклеїнова кислота цифічними до гену «домашнього господарства» та (C) Ланцюговість: дволанцюгова до G3PDH (гліцеральдегід-3(D) Топологія: лінійна фосфатдегідрогенази) (1мкл кожного при концент(іі) Тип молекули: кДНК рації 20пмоль/мл). (іх) Відмітна ознака: GSPDH-праймери (див. Фіг.1) давали очікува(A) Ім'я/ключ: CDS 47 (B) Локалізація: 22 . . 180 (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 1: 75319 48 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 2: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 53 амінокислоти (B) Тип: амінокислотна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 2: (2) Дані послідовності SEQ ID No: 3: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 1382 пари основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Ланцюговість: дволанцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: кДНК (іх) Відмітна ознака: (A) Ім'я/ключ: CDS (B) Локалізація: 312 . . 1370 (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 3: (2) Дані послідовності SEQ ID No: 4: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 353 амінокислоти (B) Тип: амінокислотна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (xi) Опис послідовності SEQ ID No: 4: 49 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 5: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 1065 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: дволанцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: кДНК (іх) Відмітна ознака: (A) Ім'я/ключ: CDS (B) Локалізація: 1 . . 1065 (хі) Ог|іис послідовності SEQ ID No: 5: 75319 50 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 6: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 355 амінокислот (B) Тип: амінокислотна (D) Топологія: лінійна (іі) Тит молекули: білок (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 6: 51 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 7: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 2565 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Ланцюговість: дволанцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: кДНК (іх) Відмітна ознака: (A) Ім'я/ключ: CDS (B) Локалізація: 252 .. 1754 (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 7: 75319 52 53 75319 54 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 8: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 501 амінокислота (B) Тип: амінокислотна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 8: (2) Дані послідовності SEQ ID No: 9: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 1035 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Ланцюговість: дволанцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: кДНК (іх) Відмітна ознака: (A) Ім'я/ключ: CDS (B) Локалізація: 1 . . 1035 (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 9: 55 75319 56 (C) Ланцюговість: дволанцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: кДНК (іх) Відмітна ознака: (A) Ім'я/ключ: CDS (B) Локалізація: 1 . . 225 (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 11: (2) Дані послідовності SEQ ID No: 10: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 345 амінокислот (B) Тип: амінокислотна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 10: (2) Дані послідовності SEQ ID No: 12: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 75 амінокислот (B) Тип: амінокислотна (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 12: (2) Дані послідовності SEQ ID No: 13: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 472 амінокислоти (B) Тип: амінокислотна (C) Ланцюговість: (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (2) Дані послідовності SEQ ID No: 11: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 225 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота 57 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 14: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 499 амінокислот (B) Тип: амінокислотна (C) Ланцюговість: (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 14: 75319 58 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 15: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 465 амінокислот (B) Тип: амінокислотна (C) Ланцюговість: (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 15: 59 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 16: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 17 амінокислот (B) Тип: амінокислотна (C) Ланцюговість: (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: пептид (v) Тип фрагмента: внутрішній (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 16: 75319 60 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 17: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 13 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. = «олігонуклеотид» (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 17: TTTTTTTTTT TGA 13 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 18: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 10 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. = «олігонуклеотид» (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 18: GATCAATCGC 10 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 19: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 23 пари основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. = «олігонуклеотид» (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 19: TAGGACATGC ACAGTGTAAT CTG 23 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 20: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 20 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. = «олігонуклеотид» (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 20: GATTGTGCTG GCCACTTCTC 20 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 21: (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 19 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. = «олігонуклеотид» (хі) Опис послідовності SEQ ID No: 21: GACACTCCAG GGACTGAAG 19 (2) Дані послідовності SEQ ID No: 22: (і) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 48 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. = «олігонуклеотид» (іх) Відмітна ознака: (A) Ім'я/ключ: модифікована основа (B) Локалізація: 36 (D) Інша інформація: /мод.основа = і (іх) Відмітна ознака: