Інгібітори для використання при гемостазі і модуляції імунної функції

1. Застосування спорідненого з адипоциткомплементом білка, який зменшує тромбогенічну активність та активність комплементу у судинній системі, для виготовлення фармацевтичної композиції, що призначена для стимуляції потоку крові у судинній системі ссавця. 2. Застосування за п.1, яке відрізняється тим, що вказаний поліпептид зменшує тромбогенічну активність та активність комплементу внаслідок гальмування шляху обміну комплементу та гальмування опосередкованої колагеном адгезії, активації або агрегації тромбоцитів. 3. Застосування за пп.1 або 2, яке відрізняється тим, що виготовляють композицію, що призначають перед, протягом чи після гострого поранення судин у ссавця. 4. Застосування за п.3, яке відрізняється тим, що композиція призначена для терапії поранень, обумовлених реконструкцією судин. 5. Застосування за п.4, яке відрізняється тим, що вказана реконструкція судин включає ангіопластику, шунтування коронарної артерії, ендартеректомію, відновлення мікросудин або анастомоз тран 2 (19) 1 3 75037 4 15. Застосування за будь-яким з пп.1–13, яке відXaa-Pro повторення. різняється тим, що вказаний споріднений з ади20. Застосування за будь-яким з пп.14–18, яке відрізняється тим, що вказаний глобулярний поцит-комплементом білок включає поліпептид, який відповідає послідовності амінокислотних домен складається з десяти бета-пластів. залишків, яка щонайменше на 75% ідентична 21. Застосування за будь-яким з пп.14–19, яке відрізняється тим, що вказані бета-пласти амінокислотній послідовності SEQ ID NO:2 за залишками 26-281, де вказана послідовність вклюзв’язані з амінокислотними залишками, що відчає повторення Gly-Xaa-Xaa або Gly-Xaa-Pro, що повідають залишкам 147-151, 170-172, 178-181, утворюють домен колагену, де Хаа є будь-якою 191- 203, 207-214, 219-225, 227-239, 244-250 та амінокислотою, і карбокси-кінцеву глобулярну час269-274 послідовності SEQ ID N0:2. 22. Застосування за п.14, яке відрізняється тим, тину. 16. Застосування за п.14, яке відрізняється тим, що вказаний поліпептид включає залишки 1що поліпептид включає послідовність амінокис281 послідовності SEQ ID NO:2 або залишки 1лотних залишків, яка щонайменше на 90% іден281 послідовності SEQ ID N0:44. 23. Застосування за п.14, яке відрізняється тим, тична амінокислотній послідовності SEQ ID N0:2 за залишками 22-281. що вказаний поліпептид об'єднаний з другим 17. Застосування за п.14, яке відрізняється тим, поліпептидом з утворенням олігомеру. 24. Застосування за п.22, яке відрізняється тим, що вказаний поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90% ідентична що вказані поліпептиди об'єднані міжмолекуамінокислотній послідовності SEQ ID N0:2 за залярними дисульфідними зв'язками. лишками 26-281. 25. Застосування за будь-яким з пп.22, 23, яке відрізняється тим, що вказаний олігомер є три18. Застосування за будь-яким з пп.14–16, яке відрізняється тим, що будь-які відмінності між мером. вказаним поліпептидом та SEQ ID N0:2 обумов26. Застосування за будь-яким з пп.22, 23, яке відрізняється тим, вказаний олігомер є гексамелені консервативними амінокислотними заміщеннями. ром. 19. Застосування за будь-яким з пп.14–17, яке 27. Застосування за будь-яким з пп.22, 23, яке відрізняється тим, що вказаний домен колагену відрізняється тим, що вказаний мультимер є 18складається з 13 Gly-Xaa-Xaa повторень та 1 Glyмером. Поранення кров'яних судин призводить у дію серію чинників для зменшення пошкодження та регуляції витікання крові з судини. Цей процес відомий як гемостаз. Тромбоцити грають роль у гемостазі на ранньому етапі утворенням тромбу або пробки для тимчасового відновлення пошкоджених судин. Тромбоцити в нормі не взаємодіють з ендотеліальною обшивкою стінок судин, але поранення кров'яних судин внаслідок нещасного випадку або при хірургічній операції може зруйнувати клітини ендотелію. Залежно від ступеню поранення такі різні субендотеліальні елементи, як клітини колагену, еластичної плівки або гладеньких м'язів у поєднанні з фібрилярними колагенами діятимуть на кров, що протікає. Коли субендотелій оголюється після поранення судин, тромбоцити, що рухаються в локальному потоці крові, взаємодіють з оголеною матрицею субендотелію, яка містить колаген, та уповільнюються. Далі взаємодія між рецепторами на поверхні тромбоцитів та оголеного шару колагену призводить до зв'язування та активації тромбоцитів, що призводить до затримки локального потоку крові Зв'язані тромбоцити активуються та утворюють агрегати з тромбоцитами у потоці крові, що протікає, через утворення фібриногенміжтромбоцитних містків [Моrоi and Jung, Frontiers in Bioscience 3: 719-28, 1998; Barnes et al., Atherosclerosis XI, Jacotot et al., eds., Elsevier Science pp.299-306, 1998 та Barnes et al., Curr. Opin. Hematol., 5: 314-20, 1998]. Гемостатична реакція змінюється та залежить від ступеню поранення кров'яної судини оголених складових конкретних кров'яних судин та умов потоку крові у пораненій зоні [Rand et al., Thrombosis and Haemostasis, 78: 445-50, 1997]. Оголювання матриці субендотелію (колаген типу VI та фактор Віллебранда), як-то при помірному пораненні судин сприяє низькому ступеню адгезії, активації або агрегації в зоні в умовах слабкого потоку крові (у тексті не видно слова – заув. перекл.), що призводить до більшого ступеню травми судин, а оголення додаткових складових судин, якто внутрішня еластична плівка та еластинасоційовані мікрофібрили, стимулюватиме утворення міцніших агрегатів тромбоцитів. Сувора травма судин, оголюючи фібрилярний колаген, провокує реакцію тромбоцитів, яка захищає жертву від надлишкової втрати крові (Rand et al., вище). Інгібітори гемостазу могли б бути корисними для збільшення потоку крові після поранення судин та заспокоєння колагенових поверхонь. Фактор комплементу Clq складається з шести копій трьох споріднених поліпептидів (ланцюги А, В та С), кожний з яких має довжину 225 амінокислот з тісно зв'язаним з аміно-закінченням колагеновим доменом та карбокси-кінцевим глобулярним регіоном. Шість потрійних спіральних регіонів утворені колагеновими доменами з шести А, шести В та шести С ланцюгів утворюючи центральний регіон та шість стеблин. Глобулярна головна частина утворена поєднанням глобулярного карбоксикінцевого домену А, В та С ланцюга Clq тому скла 5 75037 6 дається з шести глобулярних головок, що поєднані утворенням олігомеру. Згідно з одним втіленням шістьма колагено-подібними стеблами центральвинаходу поліпептиди поєднані міжмолекулярними ного фібрилярного регіону. [Sellar et al., Biochem. дисульфідними зв'язками. Згідно з іншим втіленJ. 274: 481-90, 1991]. Ця конфігурація часто познаням винаходу олігомер є тримером. Згідно з ще чається як букет квітів. Асrр30 має подібну до буодним втіленням винаходу олігомер є гексамером. кету структуру, що утворена з одного типу поліпеЗгідно з ще одним втіленням винаходу мультимер птидного ланцюга. є 18-мером. Виявлено, що Clq стимулює захисні механізЗгідно з іншим втіленням винаходу поліпептид ми, а також ініціює початок генерування токсичних зменшує тромбогенічну активність та активність оксигенових часток, що можуть викликати пошкокомплементу інгібуванням шляху обміну компледження тканин [Tenner, Behrinct Inst. Mitt. 93: 241менту та інгібуванням опосередкованої колагеном 53. 1993]. Сайти зв'язування Clq знайдені на тромадгезії, активації або агрегації тромбоцитів. Згідно боцитах. Крім того, комплемент та Clq грають роль з іншим втіленням винаходу поліпептид призначапри запаленні. Активація комплементу ініціюється ють до, протягом або після гострого поранення приєднанням Clq до імуноглобулінів. судин вказаного ссавця. Згідно з ще одним втіленІнгібітори Clq та шляху обміну комплементу ням винаходу поранення обумовлене реконструкмогли б бути корисними для анти-запального зацією судин. Згідно зі спорідненим втіленням винастосування, інгібування активації комплементу та ходу реконструкція судин включає ангіо-пластику, тромботичної активності. шунтування коронарної артерії, ендартеректомію, Згідно з винаходом запропоновано такі полівідновлення мікросудин або анастомоз транспланпептиди для цього та іншого використання, що тату судини. Згідно з іншим спорідненим втіленням фахівці повинні зрозуміти з наведених тут даних. винаходу поранення обумовлене травмою, інсульЗгідно з одним аспектом винаходу запропонотом або аневризмою. вано спосіб стимуляції потоку крові у судинній сисЗгідно з іншим аспектом винаходу запропонотемі ссавця, що включає призначення вказаному вано спосіб відновлення пошкоджених колагеноссавцю терапевтично ефективної кількості спорідвих тканин ссавця, що включає призначення вканеного з адипоцит-комплементом білку у фармазаному ссавцю терапевтично ефективної кількості цевтично прийнятному наповнювачі, де вказаний спорідненого з адипоцит-комплементом білку, де споріднений з адипоцит-комплементом білок змевказаний білок робить пошкоджену колагенову ншує тромбогенічну активність та активність комтканину інертною стосовно активації комплементу, плементу у вказаній судинній системі. Згідно з одтромботичної активності або імунної активації. ним втіленням винаходу споріднений з адипоцитЗгідно з одним втіленням винаходу пошкодження комплементом білок включає поліпептид, що має колагенової тканини обумовлене пораненням, що послідовність амінокислотних залишків, яка щоспряжене з ішемією та реперфузією. найменше на 75% ідентична амінокислотній посліЗгідно з іншим втіленням винаходу поранення довності SEQ ID NO:2 за залишками 26-281, де включає травматичну ішемію, кишкову странгулявказана послідовність включає повторення Glyцію, або поранення, що спряжене з попереднім та Xaa-Xaa або Gly-Xaa-Pro, утворюючи колагеновий подальшим встановленням потоку крові. Згідно з домен, де Хаа є будь-якою амінокислотою, та карще одним втіленням винаходу поліпептид признабокси-кінцеву глобулярну частину. Згідно зі спорічають ссавцю, що потерпає від ішеми при штучдненим втіленням винаходу поліпептид включає ному кровообігу та рецесітацн (recesitation), інфарпослідовність амінокислотних залишків, яка щокті міокарду, або посттравматичному вазоспазмі. найменше на 90% ідентична амінокислотній посліЗгідно зі спорідненим втіленням винаходу посттдовності SEQ ID NO:2 за залишками 22-281. Згідно равматичний вазоспазм включає приступ, крізьшз іншим втіленням винаходу поліпептид включає кірну транслюмінальну анпопластику ендартерекамінокислотну послідовність, яка щонайменше на томію, випадкову травму судин або травму судин 90% ідентична амінокислотній послідовності SEQ при хірургічній операції. ID NO:2 за залишками 26-281. Згідно з ще одним Згідно з ще одним аспектом винаходу запровтіленням винаходу будь-які відмінності між вказапоновано спосіб надання інертності поверхні проним поліпептидом та SEQ ID NO:2 обумовлені тезувального біоматеріалу для використання при консервативними амінокислотними заміщеннями. поєднанні з твариною, що включає призначення Згідно з іншим втіленням винаходу колагеновий вказаному ссавцю терапевтично ефективної кільдомен складається з 13 повторень Gly-Xaa-Xaa та кості спорідненого з адипоцит-комплементом біл1 повторення Gly-Xaa-Pro. Згідно з ще одним втіку, причому вказаний поліпептид робить поверхню ленням винаходу глобулярний домен складається вказаного протезувального бюматеріалу інертною з десяти бета-пластів. Згідно зі спорідненим втістосовно активації комплементу, тромботичної ленням винаходу бета-пласти спряжені з амінокиактивності або імунної активації. Згідно з одним слотними залишками, що відповідають залишкам втіленням винаходу поверхню вказаного протезу147-151, 170-172, 178-181, 191-203, 207-214, 219вального біоматеріалу покривають колагеном або 225, 227-239, 244-250, та 269-274 послідовності фрагментами колагену желатином, фібрином або SEQ ID NO:2. Згідно з ще одним втіленням винафібронектином. ходу поліпептид включає залишки 1-281 послідовЗгідно з іншим аспектом винаходу запропононості SEQ ID NO:2 або залишки 1-281 послідовновано спосіб опосередкування загоєння поранення сті SEQ ID NO:44. у ссавця, що включає призначення вказаному ссаЗгідно з винаходом запропоновано також полівцю терапевтично ефективної кількості споріднепептид що приєднаний до другого поліпептиду з ного з адипоцит-комплементом білку, причому 7 75037 8 вказаний поліпептид посилює прогрес у загоєнні дують той же самий амінокислотний залишок (тобпоранення. то, триплети GAU та GAC, кожний, кодують Asp). Фіг.1 ілюструє багатократну накладку поліпепТермін "виділений" при застосуванні до політиду zsig37 згідно з винаходом та HUMUPST2_1 нуклеотиду, позначає, що полінуклеотид видалено [Maeda et al., Biochem. Biophys., Res. Comm. з його природного генетичного середовища, і тому 221(2):286-9, 1996]; С1QА_ЛЮДИНИ [Sellaret al., він позбавлений інших чужинних чи небажаних Biochem J. 274:481-90, 1991, Reid, Biochem J.179: кодуючих послідовностей та існує у формі, що 367-71,-1979, та Reid et al., Biochem J 203: 559-69, придатна для використання в генно-інженерній 1982], HP25_TAMAS [Takamatsu et al., Моl. Cell. системі продукування білку. Такі виділені молекуBiol. 13:1516-21, 1993 та Kondo & Kondo, J.Biol ли є тими, що видалено з їх природного середоChem 267: 473-8, 1992], HP27 TAMAS [Takamatsu вища, ι включають кДНК та геномні клони. Виділені et al., та Kondo & Kondo referenced above]; i молекули ДНК згідно з винаходом позбавлені інCERL_RAT [Wada & Ohtani, Brain Res, Моl. ших генів, з якими вони звичайно спряжені але Brain.Res., 9:71-7, 1991]. можуть включати природно існуючі 5' та 3' нетранФіг.2 представляє матрицю, що показує просльовані регіони, як-то промоте-ри та термінатори. цент амінокислотної ідентичності у порівнянні з Ідентифікація спряжених регіонів зрозуміла перешістьма показаними на Фіг.1 у багатократній насічним фахівцям (дивися, наприклад, Dynan and кладці білками. Tijan, Nature 316:774-78 1985). Фіг.3а показує приєднання zsig37-FITC до ко"Виділений" поліпептид або білок є поліпептилагену типу VI. дом або білком, що отримано у відмінному від Фіг.3d показує конкуренцію неміченого zsig37 з природного середовищі, як-то поза кров'ю та ткаміченим FITC zsig37 при приєднанні до колагену ниною тварини. У кращій формі виділений поліпетипу VI. птид по суті позбавлений інших поліпептидів, зокФіг.4 показує приєднання комплементу Clqрема інших поліпептидів тваринного походження. FITC до zsig37. Краще забезпечувати поліпептиди у високоочищеФіг.5 показує інгібування zsig37-активності ній формі, тобто з чистотою більше 95%, краще з комплементу людини. чистотою більше 99%. При використанні в цьому Фіг.6 показує процент агрегації тромбоцитів контексті термін "виділений" не виключає присутколагеном у присутності zsig37. ність такого поліпептиду в альтернативних фізичФіг.7 показує проліферацію фібробластів SK5 них формах, як-то димери чи альтернативно глікоу присутності zsig37. зиловані або дериватизовані форми. Для детального пояснення винаходу може доТермін "ортолог" позначає поліпептид або біпомогти визначення наступних термінів. лок, що отримані від одного виду, який є функціоТермін "афінна мітка" використано для познанальним аналогом поліпептиду або білку від відчення пептидного сегменту, що може бути приєдмінних видів. Відміни послідовностей серед наним до поліпептиду для забезпечення очистки ортолопв є результатом видоутворення. чи детектування поліпептиду, або забезпечення Термін "полінуклеотид" позначає одно- або сайтів для приєднання поліпептиду до субстрату. дволанцюговий полімер дезоксирибонуВ принципі, будь-який пептид або білок, для яких є клеотидних або рибонуклеотидних основ зі зчитуантитіло або інший специфічний зв'язувальний ванням від 5' до 3' закінчення. Полінуклеотиди засіб, можна використовувати як афінну мітку. включають РНК та ДНК, і їх можна виділити з приАфінні мітки включають поліпстидинову ділянродних джерел, синтезувати in vitro, або виготовику, протеїн A (Nilsson et al., EMBO J., 4:1075, 1985; ти з комбінації природної та синтетичної молекул. Nilsson et al., Methods Enzymol. 198.3, 1991), глутаРозміри полінуклеотидів виражають як пари основ тіон-S-трансферазу (Smith and Johnson, Gene (скорочено "по"), нуклеотиди ("нк"), або кілооснов 67:31, 1988), субстанцію Ρ, пептид Flag™ (Hopp et ("ко"). Коли контекст дозволяє, останні два терміни al., Biotechnology 6:1204-10, 1988, доступний від можуть описувати полінуклеотиди, що є одноланEastman Kodak Co., New Haven, CT), зв'язуючий цюговими або дволанцюговими. Коли термін застрептавідин пептид, або інший антигенний епітоп стосовують до дволанцюгової молекули, його виабо зв'язувальний домен. Дивися взагалі, Ford et користано для позначення загальної довжини i al., Protein Expression and Purification 2:95-107, слід розуміти, що він еквівалентний терміну "пари 1991 ДНК, що кодують афінні мітки, доступні від основ". Фахівці зрозуміють, що дві нитки дволанкомерційних постачальників (наприклад, цюгового полінуклеотиду можуть трохи відрізнятиPharmacia Biotech, Piscataway, NJ). ся за довжиною і тому їх кінці можуть бути розтаТермін "комплементи полінуклеотидних молешовані ступінчасто в результаті розщеплення кул" позначає полінуклеотидну молекулу, що має ферментами, отже не всі нуклеотиди у дволанцюкомплементарну послідовність основ та зворотну говому полінуклеотиді можуть бути спареними Такі орієнтацію у порівнянні з посилальною послідовнінеспарені закінчення звичайно не перевищують у стю, наприклад, послідовність 5' ATGCACGGG 3' є довжину 20нк. комплементарною стосовно 5' CCCGTGCAT 3'. Поліпептид: Є полімером з'єднаних пептидниТермін, "вироджена нуклеотидна послідовми зв'язками амінокислотних залишків, що продуність" позначає послідовність нуклеотидів, що кований природно чи синтетично. Поліпептиди включає один чи більше вироджених кодонів (у менше приблизно 10 амінокислотних залишків порівнянні з посилальною полінуклеотидною мозвичайно позначають як "пептиди". лекулою, що кодує поліпептид). Вироджені кодони "Зонди та/або праймери" можуть бути РНК або включають відмінні триплети нуклеотидів, але коДНК. ДНК може бути кДНК або геномною ДНК. 9 75037 10 Полінуклеотидні зонди та праймери є одно- або комплементом білком, Асrр30 (SEQ ID NO:3) та дволанцюговими ДНК або РНК, звичайно синтетисекретованим адипоцитами білком арМІ чними олігонуклеотидами, але можуть бути ство(HUMUPST2_1 на Фіг.1 та 2) Дещо віддаленішу реними з клонованої кДНК або геномної послідовгомологію також ідентифікували для ланцюга комності чи їх комплементів. Аналітичні зонди поненту комплементу C1Q А, двох факторів, що звичайно мають довжину щонайменше 20 нуклеоспостерігали при активному стані впадаючого в тидів, хоча іноді можна використовувати коротші зимову сплячку сибірського сурка (HP25_TAMAS зонди (14-17 нуклеотидів). PCR-праймери мають та HP27_TAMAS), та білку мозку щура довжину щонайменше 5 нуклеотидів, переважно (CERL_RAT), як показано на Фіг.1 та 2. 15 чи більше нк, краще 20-30нк. Короткі полінуклеНуклеотидну послідовність zsig37 описано поотиди можна використовувати, коли метою аналізу слідовністю SEQ ID NO:1, а похідну від неї аміноє невеликий регіон гена. Для загального аналізу кислотну послідовність описано послідовністю генів, полінуклеотидний зонд може включати суSEQ ID NO:2. Вироджена нуклеотидна послідовцільний екзон чи більше. Зонди можуть бути міченість, що кодує поліпептид з послідовністю SEQ ID ними для забезпечення виявного сигналу, як-то NO:2 представлена послідовністю SEQ ID NO:23. ферментом, біотином, радіонуклідом, флуорофоЯк вищезазначено взагалі, поліпептид zsig37 ром, хемілюмінофором, парамагнітною частинкою включає сигнальну послідовність, що простягаєтьтощо, які комерційно доступні з багатьох джерел, ся від амінокислоти 1 (Met) до амінокислотного як-то Molecular Probes, Inc., Eugene OR, та залишку 21 (Gly). Amersham Corp., Arlington Heights, IL, використоАльтернативна сигнальна послідовність провуючи добре відомі в рівні техніки способи. стягається від амінокислоти 1 (Met) до амінокислоМолекулярні маси та довжини полімерів вити 25 (Ser). Розвинений поліпептид тому простягазначали приблизними аналітичними способами ється від амінокислоти 22 (Leu) або 26 (Arg) до (наприклад, гель-електрофорезом), слід розуміти, амінокислоти 281 (Pro). У розвиненому поліпептиді що вони є приблизними. Коли таку величину поззнайдено N-кінцевий регіон невідомої гомологи, начають як "приблизно" X або "біля X визначена що простягається між амінокислотними залишками величина X, слід розуміти, визначена з похиб22 (Leu) та 98 (Lys). Крім того, скорочений колагекою ±10%. новий домен знайдено між амінокислотами 99 Представлений винахід зокрема оснований на (Gly) та 140 (Arg). У скороченому колагеновому виявленні того, що новий гомолог спорідненого з домені спостерігають 1 повне Gly-Xaa-Рrо та 13 адипоцит-комплементом білку інгібує опосередконеповних повторень Gly-Xaa-Xaa. За контрастом, вану колагеном активацію тромбоцитів та шлях Асrр30 включає 22 повних чи неповних повторень. обміну комплементу, включаючи Clq. Цей білок Поліпептид zsig37 також включає карбоксикінцепозначили як zsig37 та повністю описали у загальвий глобулярний домен, що простягається прибновизначеній опублікованій [патентній заявці РСТ лизно від амінокислоти 141 (Cys) до 281 (Pro). ПоWO 99/04000]. ліпептид zsig37, HUMUPST2_1 та Асrр30 Нуклеотидна послідовність zsig37 (SEQ ID виявляються як гомологічні у колагеновому домені NO:1) кодує поліпептид (SEQ ID NO:2), що має та у глобулярному домені, але не на N-кінцевій аміно-кінцеву сигнальну послідовність, суміжний частині розвиненого поліпептиду. N-кінцевий регіон відсутності гомологи, скорочений Глобулярний домен Clq з ACRP30, як визнаколагеновий домен, що складається з повторень чено, має топологію "желе-рулонів" з 10 бетаGly-Xaa-Xaa або Gly-Xaa-Pro, та карбокси-кінцеву пасом (Shapiro та Scherer, Curr. Biol., 8: 35-8, глобулярну частину. Нова полінуклеотидна послі1998), що вказує на значну структурну гомологію з довність також включає довгий 3' нетрансльований родиною TNF, а послідовність zsig37, яку предстарегіон. Вищезазначена загальна будова поліпепвлено послідовністю SEQ ID NO:2, включає усі 10 тиду спільною для Асrр30 та HUMUPST2_1, за бета-пасом цієї структури (амінокислотні залишки винятком того, що колагеново-подібний домен 147-151, 170-172, 178-181 185-188, 191-203, 207кожного з цих білків є довшим, ніж у поліпептидів 214, 219-225, 227-238, 244-250, та 269-274 посліzsig37. Також послідовність ДНК HUMUPST2_1 довності SEQ ID NO:2). Ці нитки позначено як "А", характеризується довгим 3' нетрансльованим регі"А"', "В", "В"', "С", "D", "E", "F", "G" та "Н", відоном. Більш того, Асrр30 та усі з сполучених на повідно. Фіг.1 послідовностей за винятком CERL_RAT, виZsig37 має два зв'язуючих рецептор контури користовують збережений залишок цистеїну в пона амінокислотних залишках 152-180 та 213-226. зиції 187 поліпептиду zsig37, як показано на Фіг.1 Амінокислотні залишки 191 (Gly), 193 (Туr), 238 та у послідовності SEQ ID NO:2. Також, поліпепти(Leu) та 272, (Gly) виявлені як збережені в рамках ди zsig37 згідно з винаходом включають гаданий надродини, включаючи CD40, TNFα, ΤΝΡβ N-зв'язаний глікозилований сайт на амінокислоті ACRP30 та zsig37. 93 (Asn) послідовності SEQ ID NO:2. Інший аспект згідно з винаходом включає виАналіз розподілу по тканинах мРНК, що відпокористання фрагментів поліпептиду zsig37 як інгівідає zsig37, показав, що експресія була найвибіторів гемостазу та імунних функцій. Переважні щою в серці та плаценті при відносно слабких сигфрагменти включають колагеново-подібний домен налах у нирках, яєчнику, наднирковій залозі та поліпептидів zsig37, що простягається від амінокискелетних м'язах, а слабші сигнали для великої слоти 99 (Gly) до амінокислоти 140 (Arg) послідоврізноманітності інших тканин наявні у норзернності SEQ ID NO:2, частину поліпептиду zsig37, що блоті. Для zsig37 було доказано гомологічне співвключає колагеново-подібний домен або частину відношення з спорідненим з адипоцитколагеново-подібного домену, що здатна до диме 11 75037 12 ризації чи олігомеризації. Інші переважні фрагменприєднаний до гена, що кодує визначуваний білок, ти включають глобулярний домен поліпептиду як-то люциферазу. Реакційні елементи ДНК моzsig37, що простягається від амінокислоти 140 жуть включати, але без обмеження реакційні еле(Arg) або 141 (Cys) до 281 (Pro) з послідовності менти циклічного AMP (CRE), реакційні елементи SEQ ID NО:2, і частини поліпептиду zsig37, що гормону (HRE), реакційний елемент інсуліну (IRE) включає глобулярно-подібний домен або активну (Nasrm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5273-7 частину глобулярно-подібного домену. Другий 1990) та реакційні елементи сироватки (SRE) фрагмент поліпептиду zsig37 згідно з винаходом (Shaw et al., Cell 56:563-72, 1989). Реакційні елевключає як колагеново-подібний домен, так і гломенти циклічного AMP описано у Roestler et al., J. булярний домен, що простягається від амінокисBiol Chem., 263(19):9063-6, 1988 та Habener, Molec лотного залишку 99 (Gly) до 281 (Pro) послідовносEndocrinol.,4(8):1087-94, 1990. Реакційні елементи ті SEQ ID NO:2. Ці фрагменти є зокрема гормону описано у Beato, Cell 56:335-44, 1989. корисними для інгібування опосередкованої колаКандидатні сполуки, розчини, суміші або екстракти геном активації тромбоцитів та інгібування комоб'єднані за здатністю інгібувати активність zsig37 плементу і Clq. у цільових клітинах, що доказують зменшенням Згідно з винаходом запропоновано також вистимуляції zsig37 експресії репортерного гена. користання конденсованих білків zsig37 наприклад Дослідження такого типу визначатимуть сполуки, конденсованих білків згідно з винаходом, що охопщо безпосередньо блокують приєднання zsig37 до люють (1) поліпептид, який вибрано з групи, що рецепторів клітинної поверхні, а також сполуки, що включає (а) молекули поліпептиду, що містять поблокують процеси у клітинному шляху обміну в слідовність амінокислотних залишків, яку показано результаті зв'язування рецептор-ліганд. Альтернана SEQ ID NO:2 від амінокислотного залишку 1 тивно, сполуки чи інші зразки можна тестувати на (Met) 22 (Leu) або 26 (Arg) до амінокислотного забезпосереднє блокування приєднання zsig37 до лишку 281 (Pro), (b) молекули поліпептиду, що рецептору використовуючи zsig37, мічений визнапростягаються від амінокислоти 99 (Gly) до аміночуваною міткою (наприклад, 125І, біотином, пероккислоти 140 (Arg) послідовності SEQ ID NO:2, чассидазою хрону FITC, тощо). У дослідженнях такого тину поліпептиду zsig37, що включає колагеновотипу здатність тест-зразку інгібувати приєднання подібний домен або частину колагеново-подібного міченого zsig37 до рецептору є індикатором активдомену, що здатна до димеризації чи олігомериності інгібітору, яку можна підтвердити вторинними зації, (с) молекули поліпептиду, що простягаються дослідженнями. Рецептори, що використано у довід амінокислоти 140 (Arg) або 141 (Cys) до 281 слідженнях рецепторів, можуть бути клітинними (Pro) послідовності SEQ ID NO:2, частини поліпепрецепторами або виділеними, іммобілізованими тиду zsig37, що включає глобулярно-подібний дорецепторами. мен чи активну частину глобулярно-подібного доТакож корисними у способах згідно з винахомену, або (d) молекули поліпептиду, що дом є антитіла, що специфічно приєднуються до простягаються від амінокислоти 99 (Gly) до 281 поліпептидних епітопів, пептидів або поліпептидів (Pro), частини поліпептиду zsig37, що включає zsig37. Способи виготовлення поліклональних та колагеново-подібний домен та глобулярний домен, моноклональних антитіл добре відомі в рівні техніта (2) інший поліпептид. Інший поліпептид може ки [дивися, наприклад, Sambrook et al., Molecular бути альтернативним або додатковим глобулярCloning-: A Laboratory Manual. Second Edition, Cold ним доменом, альтернативним або додатковим Spring Harbor, NY, 1989, та Hurrell, J.G.R., Ed., колагеново-подібним доменом, сигнальним пептиMonoclonal Hybndoma Antibody Techniquesта дом для полегшення секреції конденсованого білApplications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982] ку або подібним. Як повинні знати фахівці, поліклональні антиТакож корисними у способах згідно з винахотіла можна створити інокуляцією різних теплокродом є агоністи та антагоністи zsig37. Способи ідевних тварин, як-то коней, корів, кіз, овець, собак, нтифікації антагоністів відомі в рівні техніки , накурей, кролів, мишей, хом'яків, морських свинок та приклад, антагоністи поліпептиду zsig37 можна щурів, а також трансгенних тварин як-то трансгенідентифікувати забезпеченням чутливих до поліних корів, кіз, овець або свиней Антитіла можна пептиду zsig37 клітин, культивуванням першої чатакож експресувати у дріжджах та грибах у модистини клітин у присутності поліпептиду zsig37, куфікованих формах, а також у клітинах ссавців та льтивуванням другої частини клітин у присутності комах. Поліпептид zsig37 або його фрагмент слуполіпептиду zsig37 та тест-сполуки і визначенням гує антигеном (імуногеном) для інокуляції тварини зменшення клітинної реакції у другій частині клітин або виявлення імунної реакції Придатні антигени у порівнянні з першою частиною клітин. На додамогли б включати поліпептид zsig37, що кодоваток до цього розкритого тут аналізу зразки можна ний послідовністю SEQ ID NO:2 від амінокислотнотестувати стосовно інгібування активності zsig37 в го залишку 22 до амінокислотного залишку 281 рамках багатьох призначених для виміру приєдпослідовності SEQ ID NO:2, від амінокислотного нання рецептору або стимуляції/інгібування залишку 26 до амінокислотного залишку 281 посzsig37-залежних клітинних реакцій аналізів, наприлідовності SEQ ID NO:2, або їх спорідненим фрагклад, чутливі до zsig37 лінії клітин можна трансфементом з амінокислотних залишків 9-281. Імуноктувати констрактом репортерного гена, що є чутгенність поліпептиду zsig37 можна посилювати ливим до стимульованого zsig37 клітинного шляху використанням ад'юванту, як-то алюм (гідроксид обміну. Констракти репортерного гена подібного алюмінію) або повний або неповний ад'ювант типу відомі в рівні техніки, та звичайно включають Фрейда. Поліпептиди, що корисні для імунізації, реакційний сегмент ДНК zsig37, що оперативно включають також конденсовані поліпептиди, як-то 13 75037 14 конденсати zsig37 або його частини з поліпептитиди zsig37 людини. Крім того, антитіла можна дом імуноглобуліну або афінною міткою. Поліпеп"скринувати проти" відомих споріднених поліпептидний імуноген може бути молекулою повної дотидів для ізоляції популяції, що специфічно приєдвжини або її частиною. Якщо частина поліпептиду нується до поліпептидів згідно з винаходом, нає "гаптеноподібною", таку частину можна префеприклад, антитіла, що утворилися до поліпептидів ренційно об'єднувати чи зв'язувати з макромолеzsig37 людини, адсорбуються на споріднених покуля-рним носієм (як-то гемоціанін блюдечка ліпептидах, які прикріплені до нерозчинної матри(KLH), альбумін коров'ячої сироватки (BSA) або ці, антитіла, що специфічні до поліпептидів zsig37 токсоїд тетанусу) для імунізації. людини, протікатимуть через матрицю в належних Використаний тут термін "антитіла" включає умовах буферування. Такий скринінг дозволяє поліклональні антитіла, афінно очищені поліклоізоляцію поліклональних та моноклональних антинальні антитіла, моноклональні антитіла та антитіл, що не виявляють перехресних реакцій з блиген-зв'язуючі фрагменти як-то протеолітичні фрагзько спорідненими поліпептидами (Antibodies A менти F(ab')2 та Fab Також є включеними Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold генетично сконструйовані суцільні антитіла або Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current фрагменти, як-то химерні антитіла Fv-фрагменти, Protocols in Immunology, Coohgan, et al. (eds.) антитіла з одиничним ланцюгом тощо, а також National Institutes of Health, Fohn Wiley and Sons, синтетичні антиген-зв'язуючі пептиди та поліпепInc., 1995). Скринінг та виділення специфічних тиди. Антитіла не від людини можна пристосувати антитіл є добре відомими в рівні техніки [дивися, до людини прищепленням тільки CDR не від люFundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, дини до рамки та незмінених регіонів людини, або 1993; Getzoff et al., Adv in Immunol 43: 1-98, 1988; вставкою суцільних змінних доменів не від людини Monoclonal Antibodies Principles and Practice. (як варіант, "покриваючи" їх людиноподібною поGoding, J.W. (eds.). Academic Press Ltd., 1996; верхнею заміщенням оголених залишків, резульBenjamin et al., Ann Rev. Immunol. 2: 67-101,1984]. татом чого є "фанероване" антитіло). В деяких Репрезентативні приклади таких аналізів включавипадках, пристосовані до людини антитіла моють конкурентний імуноелектрофорез, радіоімуножуть зберігати залишки не від людини у доменах аналіз, радіоімунопреципітацію, імуносорбентний рамок змінних регіонів людини для посилення нааналіз на зв'язаних ферментах (ELISA), аналіз лежних характеристик зв'язування. Пристосованидот-блотингом або Вестерн-блотингом, інгібування ми до людини антитілами можна збільшити період або конкурентний аналіз, та сендвіч-аналіз. біологічного напівжиття, а можливість шкідливих Дія поліпептидів, фрагментів, конденсатів, імунних реакцій при застосуванні до людей зменагоністів чи антагоністів zsig37 у гемостазі, зокрешується. Альтернативні способи створення або ма, адгезії та активації тромбоцитів, що призвоселекції антитіл, що корисні при цьому, включають дить до агрегації тромбоцитів, можна визначити обробку in vitro лімфоцитів білком або пептидом представленими тут та відомими в рівні техніки zsig37, та селекцію виявлених бібліотек антитіл у способами та аналізами. Колаген є потужним індуфагах чи подібних векторах (наприклад, викорисктором агрегації тромбоцитів. Це призводить до танням іммобілізованого або міченого білку або ризику для пацієнта, що одужує від поранень супептиду zsig37). дин. Інгібітори індукованої колагеном агрегації Антитіла позначають як специфічно зв'язуючі, тромбоцитів могли б бути корисними для такої якщо 1) вони виявляють пороговий рівень активмети. Виявлено, що Zsig37 приєднується до фібності до зв'язування, та/або 2) вони не виявляють ро-нектину та колагенів типу І, II, III, V та VI. Зокпомітних перехресних реакцій з молекулами спорема, zsig37 приєднується до специфічних домерідненого поліпептиду. По-перше, антитіла специнів на колагені VI залежно від концентрації. фічно приєднуються, якщо вони приєднуються до Виявлено також, що Zsig37 інгібує опосередковану поліпептиду, пептиду або епітопу zsig37 зі спорідколагеном активацію тромбоцитів. Індуковане неністю до приєднання (Kа) 106моль-1 або більше, Zsig37 інгібування було селективним стосовно переважно 107моль-1 або більше, краще 10моль-1 активації колагену zsig37 не впливав на активовані або більше, а найкраще 109моль-1 або більше. відомими активаторами тромбоцитів ADP або Спорідненість до приєднання антитіла може легко тромбіном тромбоцити. Ці результати описано визначити пересічний фахівець, наприклад, аналідетальніше нижче у розділі Приклади. Можна чезом Скатчарда (Scatchard, Ann, NY Acad. Sci. 51: кати, що поліпептиди, фрагменти, конденсати, 660-672, 1949). агоністи чи антагоністи zsig37 будуть корисними По-друге, антитіла специфічно приєднуються для блокування приєднання тромбоцитів до покякщо вони не виявляють помітних перехресних ритих колагеном поверхонь та зменшення спряжереакцій з молекулами спорідненого поліпептиду ної індукованої колагеном агрегації тромбоцитів. Антитіла не виявляють помітних перехресних реаClq є компонентом шляху обміну комплементу кцій з молекулами спорідненого поліпептиду, ната як виявлено, стимулює захисні механізми, а приклад, якщо вони визначають поліпептид zsig37 також запускає утворення токсичних оксигенових але не відомі споріднені поліпептиди, використочастинок, що можуть викликати пошкодження ткавуючи стандартний аналіз Вестерн-блотингом нин [Tenner, Behrinq Inst Mitt 93 241-53, 1993]. Сай(Ausubel et al., вище). Приклади відомих споріднети "зв'язування Clq" виявлені на тромбоцитах. них поліпептидів включають інші члени родини Clq, що незалежний від імунного зв'язуючого білків, як-то Асrр30 (SEQ ID NO:3), поліпептиди що партнера, як виявлено, інгібує агрегацію тромбопоказані на Фіг.1 на суміщенні. Вони також вклюцитів, але не адгезію або зміну форми тромбоцичають, за потребою, ортологи та мутантні поліпептів. Аміно-кінцевий регіон Clq має гомологію з ко 15 75037 16 лагеном [Peerschke та Ghebrehiwet, J Immunol. захищає ішемічний міокард від реперфузійного 145: 2984-88, 1990]. Zsig37 приєднується до компоранення [Buerke et al., J.Pharm. Exp. Therp. 286 плементу Clq залежно від концентрації. Виявлено, 429-38, 1998]. Інгібування комплементу та активщо Zsig37 є ефективним при інгібуванні шляху ність поліпептидів zsig37 стосовно зв'язування Clq обміну комплементу, що включає Clq, з сенсибілімогли б бути корисними для такої мети. зованими та несенсибілізованими еритроцитами Потенційні можливості zsig37 стосовно зв'язувівці. вання Clq та колагену могли б бути корисними для Поліпептиди, фрагменти, конденсовані білки, відновлення пошкоджених колагенових тканин, антитіла, агоністи чи антагоністи zsig37 згідно з попередження адгезії, активації або агрегації тровинаходом можна використовувати у способах мбоцитів, та активації процесу запалення, що пристимуляції потоку крові в судинній системі ссавця зводить до вивільнення токсичних оксигенових зменшенням числа тромбоцитів, що злипаються та продуктів. Перетворенням оголеної тканини у інеє активованими, та розміру агрегатів тромбоцитів. ртну стосовно таких явищ, як діяльність комплеТаки способи включатимуть призначення потременту, тромботична активність та імунна активабуючому цього ссавцю терапевтично ефективної ція, поліпептиди, фрагменти, конденсати, антитіла, кількості поліпептидів, фрагментів, конденсатів, агоністи або антагоністи zsig37 могли б бути кориантитіл, агоністів чи антагоністів zsig37 причому сними при зменшенні шкідливої дії ішемії та репеzsig37 зменшує тромбогенічну активність та активрфузії. Зокрема, такі поранення можуть включати ність комплементу в судинній системі ссавця. Як травматичну ішемію, кишкову странгуляцію, та описано далі, поліпептиди zsig37 інгібують опосепоранення, що спряжені з попереднім та подальредковану колагеном активацію тромбоцитів та шим встановленням потоку крові Zsig37 могли б інактивують зв'язування фібронектину та колагенів бути корисними для лікування ішемії при штучному типу І, II, III, V та VI. Призначення Zisg37 зменшує кровообігу та рецесітації, інфаркті міокарду та постромбогенічну активність на ділянці поранення ттравматичному вазоспазмі, як-то приступ або судин зменшенням способів адгезії активації та крізьшкірна транслюмінальна ангіопластика, а таагрегації тромбоцитів Zsig37 також інгібує шлях кож випадковій травмі судин або травмі судин при обміну комплементу та Clq, як описано далі, змехірургічній операції. ншуючи тим активність комплементу у судинній Поліпептиди, фрагменти, конденсати, антитіл, системі. Поліпептиди, фрагменти, конденсати, агоністи чи антагоністи Zsig37 могли б також бути антитіл, агоністи чи антагоністи zsig37, що викорикорисними для обробки протезувальних біоматестовують у таких способах, можна призначати до, ріалів та хірургічного обладнання, щоб зробити протягом чи після гострого поранення судин ссавповерхню матеріалів інертною стосовно активації ця. комплементу, тромботичної активності або імунної Згідно з переважним способом поранення суактивації. Такі матеріали включають, але без обдин обумовлене реконструкцією судин, включаючи меження, покриті колагеном або фрагментом кобез обмеження, анпопластику, ендартеректомію, лагену біоматеріали, покриті желатином біоматешунтування коронарної артерії, відновлення мікріали, покриті фібрином біоматеріали, покриті росудин або анастомоз трансплантату судини. фібронектином біоматеріали, покриті гепарином Також включено поранення судин внаслідок травбіоматеріали, покриті колагеном та гелем стенти, ми, приступу або аневризми. Згідно з іншими петрансплантати артерій, синтетичні серцеві клапареважними способами поранення судин обумовни, штучні органи або будь-які протезувальні аплілене руйнуванням бляшок деградацією судинної кації, що контактують з кров'ю, які приєднують системи, спряженими з діабетом та атеросклероzsig37 зі спорідненістю більше 1 108. Покриття зом ускладненнями. Руйнування бляшок у коронатаких матеріалів можна виконати, використовуючи рній артерії індукує серцевий напад, а у церебравідомі в рівні техніки способи, дивися, [наприклад, льній артерії індукує інсульт. Використання Rubens, Патент США 5272074]. поліпептидів, фрагментів, конденсованих білків, Комплемент та Clq грають роль при запаленні. антитіл, агоністів чи антагоністів zsig37 у таких Активація комплементу ініціюється зв'язуванням способах могло б також бути корисними для полеClq з імуноглобулінами [Johnston, Pediatr. Infect. гшення всіх системних захворювань судинної сисPis. J. 12: 933-41, 1993; Ward and Ghetie, Therap. теми, що спряжені з імунною системою, як-то розImmunol. 2: 77-94, 1995] Інгібітори Clq та комплесіяну внутрішньосудинну коагуляцію (DIC) та SID. менту могли б бути корисними як анти-запальні Додатково, активність інгібування комплементу засоби Таке застосування можна здійснювати для могла б бути корисною для лікування імунних запопередження інфекції Додатково, такі інгібітори хворювань, що не мають відношення до судинної можна застосовувати до потерпаючих від запасистеми, як-то артеріосклероз. лення, що опосередковане активацією комплеменВиявлено кореляцію між наявністю Clq у локату та зв'язуванням імунних комплексів з Clq, осіб. лізованому ішемічному міокарді та накопиченням Поліпептиди, фрагменти, конденсовані білки, анлейкоцитів після коронарної оклюзм та репертитіла, агоністи чи антагоністи zsig37 могли б бути фузм. Вивільнення клітинних компонентів після корисними у способах опосередкування загоєння пошкодження тканин запускає активацію комплепоранень, посилення прогресу у загоєнні пораненменту, яка призводить до утворення токсичних ня подоланням послаблення загоєння поранення. оксигенових продуктів, які можуть бути першоприПрогрес у загоєнні поранення міг би включати, чиною пошкодження міокарду (Rossen et al., наприклад, такі елементи як зменшення запаленCirc.Res. 62: 572-84, 1998 та Tenner, вище). Виявня, відновлення фібробластів, стягування поралено, що блокування шляху обміну комплементу нення та придушення інфекції. 17 75037 18 Здатність клітин пухлин приєднуватися до кодом можна досліджувати поодинці або у комбінації лагену може сприяти метастазам пухлини Інгібітоз іншими відомими інгібіторами комплементу, що ри приєднання до колагену є також корисними для описано вище. опосередкування адгезивних взаємодій та пошиКрім того, поліпептиди, фрагменти, конденсарення метастазів пухлин [Noeske-Jungbulfc et al., ти агоністи або антагоністи zsig37 можуть бути Патент США 5723312]. терапевтично корисними для антимікробного заВиявлено, що Zsig37 індукує розширення сустосування. Наприклад, компонент комплементу дин у звужених норепінеферином кільцях аорти, Clq відіграє роль у захисті організму хазяїна від використовуючи спосіб Dainty et al, J. Pharmacol інфікуючих агентів, як-то бактерії та віруси Відомо, 100: 767, 1990 та Rhee et al., Neurotox 16: 179, що Clq виявляє кілька спеціалізованих функцій, 1995, як детальніше описано далі. наприклад, Clq запускає каскад комплементу шляАдгезію, активацію та агрегацію тромбоцитів хом взаємодії зі зв'язаним антитілом або Сможна оцінити, використовуючи описані тут або реактивним білком (CRP). Також Clq взаємодіє відомі в рівні техніки способи, як-то аналіз агрегабезпосередньо з деякими бактеріями, РНКції тромбоцитів [Chiang et al., Thrombosis Res. 37: вірусами, мікоплазмою, кристалами сечової кисло605-12, 1985] та дослідження адгезії тромбоцитів ти, ліпід-А-компонентом бактеріального ендоток[Peerschke та Ghebrehiwet, J. Immunol. 144: 221-25, сину та мембранами деяких внутрішньоклітинних 1990]. Інгібування Clq та шляху обміну комплеменорганел. Приєднання Clq до рецептору Clq, можна ту можна визначити, використовуючи розкриті тут думати, посилює фагоцитоз Clq також виявлений або відомі в рівні техніки способи, як-то описані як засіб в аспекті посилення утворення антитіло Suba та Csako, J. Immunol. 117: 304-9, 1976. Вимір системи захисту хазяїна. Дивися, [наприклад, адгезії тромбоцитів до колагену та інгібування інJohnston, Pediatr. Infect. Pis. J. 12(11): 933-41, дукованої колагеном агрегації тромбоцитів можна 1993]. Отже, розчинні подібні Clq молекули можуть здійснити, використовуючи способи, що описано бути корисними як антимікробні засоби, що посиKeller et al., J. ΒιοΙ. Chem. 26: 5450-6, 1993, люють лізис або фагоцитоз інфікуючих агентів. Waxman and Connolly, J. Biol. Chem. 268: 5445-9, Позитивно заряджені зовнішньоклітинні пот1993; Noeske-Jungblut et al., J. Biol. Chem. 269: рійно спіральні колагенові домени Clq та рецепто5050-3, 1994 або Deckmyn et al., Blood, 85: 712-9, ру сапрофіту макрофагу визначали як такі, що 1995. відіграють роль у зв'язуванні лігандів та мають, як Різні моделі in vitro та in vivo є доступними для було показано, чітку специфічність зв'язування оцінки дії поліпептидів, фрагментів, конденсованих поліаніонів [Acton et al., J. ΒiοΙ. Chem. 268: 3530білків, антитіл, агоністів та антагоністів zsig37 на 37, 1993]. Лізофосфоліпідний фактор росту (лізоішемію та реперфузію поранення. Дивися, [наприфосфатидна кислота, LPA) та інші мітогенні аніони клад, Shandelya et al., Circulation, 38: 2812-26, локалізовані на ділянці пошкодженої тканини та 1993; Weisman et al., Science 249: 146-151, 1991; допомагають у загоєнні поранення LPA викликає Buerke et al., Circulation 91: 393-402, 1995; Horstick багато біологічних ефектів, включаючи активацію et al., Circulation 95 701-8, 1997 та Burke et al, J. тромбоцитів та надрегуляцію ансамблю матриць. Phar. Exp. Therp. 286: 429-38, 1998]. Аналіз ex vivo Можна вважати, що LPA виявляє синергізм з інагрегації тромбоцитів хом'яка описаний Deckmyn шими факторами коагуляції крові i опосередковує et al., вище. Час кровотечі у хом'яків та бабуїнів загоєння поранення. можна виміряти після ін'єкції поліпептидів zsig37, Колагенові домени білків, як-то Clq та рецепвикористовуючи модель, що описано Deckmyn et тор сапрофіту макрофагу, як відомо, приєднують al., вище Утворення тромбів у відповідь на застокислотні фосфоліпіди, як-то LPA 9-мерний регіон сування білків згідно з винаходом можна виміряти колагенового домену zsig37, амінокислотні залишвикористовуючи модель тромбозу вени стегна ки 127-135 послідовності SEQ ID NO:2, приймає хом'яка, що запропоновано Deckmyn et al., вище. участь у гомологічній з колагеновим доменом посЗміни адгезії тромбоцитів в умовах протікання післідовності, яку виявлено на Clq та рецепторі сапля застосування zsig37 можна виміряти, викорисрофіту макрофагу. Взаємодія поліпептидів, фрагтовуючи спосіб що описано Harstalvi et al., Blood ментів, конденсатів, агоністів чи антагоністів zsig37 85: 705-11, 1995. з мітогенними аніонами як-то LPA, можна визначиІнгібування комплементу та загоєння пораненти, використовуючи відомі в рівні техніки досліня поліпептидами, фрагментами, конденсованими дження, дивися, наприклад, Acton et al., вище. Інгібілками, антитілами, агоністами чи антагоністами бування процесу запалення поліпептидами та zsig37 можна досліджувати поодинці або у комбіантитілами згідно з винаходом могло б також бути нації з іншими відомими інгібіторами індукованої корисним при попередженні інфекції на ділянці колагеном активації та агрегації тромбоцитів, як-то поранення. наприклад, палдипіном, моубатином або каліном. Для фармацевтичного використання білки згіПоліпептиди, фрагменти, конденсовані білки, дно з винаходом можна формувати з фармацевантитіл, агоністи або антагоністи zsig37 можна тично прийнятними носіями для парентерального, оцінити, використовуючи описані тут способи або перорального, назального, ректального, локальновідомими в рівні техніки способами, як-то загоєння го, трансдермального або подібного призначення, дермальних шарів у свиней [Lynch et al., Proc. Natl. звичайними способами. Переважно застосування Acad. Sci. USA 84: 7696-700, 1987] та поранень здійснюють на ділянці поранення судин чи поблишкіри на всю й товщину у генетично діабетичних зу. Взагалі, фармацевтичні композиції включають мишей, наприклад, [Greenhaigh et al., Am. J. Pathol. білок zsig37 у комбінації з фармацевтично прийня136: 1235-46, 1990] Поліпептиди згідно з винахотним наповнювачем, як-то фізіологічний розчин, 19 75037 20 буферований фізіологічний розчин, 5% декстроза послідовність білку на п основі, та шукаючи бази у воді, тощо. Композиції можуть також включати даних відомих послідовностей секретованого білодин чи більше ексципієнтів, консервантів, розріку, які найбільш гомологічні передбачуваному білджувачів, солюбілізаторів буферуючих засобів, ку на основі EST. EST, які потенційно кодують білальбумін для попередження втрат білку на поверки, що мають біологічно інтересну гомологію з хні склянки, тощо. Способи формування добре відомими секретованими білками, ідентифікували відомі в рівні техніки та розкриті, [наприклад, у для подальшого дослідження. Одиничну послідовRemington The Science та Practice of Pharmacy ність EST розкрили та прогнозували як гомологічну Gennaro, ed., Mack Publishing Co Easton PA, 19lh специфічному білку адипоцитів. [Дивися наприed., 1995]. Терапевтичні дози звичайно визначає клад, Scherer et al., J.ВioІ. Chem. 270 (45): 26746-9, клініцист згідно з прийнятими стандартами, врахо1995 Для ідентифікації відповідної кДНК, розглянувуючи природу та суворість стану, який підлягає тий клон, що ймовірно включає суцільну кодуючу лікуванню, особливості пацієнта тощо. Визначення послідовність, використовували для секвенсувандози знаходиться на рівні компетенції пересічного ня. Використовуючи комплект Invitrogen S.N.A.P.™ фахівця. Miniprep (Invitrogen, Corp., San Diego, CA) за інВикористаний тут термін "фармацевтично струкціями виробника, виготовляли 5мл витримаефективна кількість" поліпептиду, фрагменту, конної протягом ночі культури у LB+50(мкг/мл) ампіденсованого білку, агоністу або антагоністу zsig37 циліну. Темплат секвенсували на секвенсорі ДНК є кількістю, що достатня для індукції потрібного ABIPRISM™ модель 377 (Perkm-Elmer Cetus, біологічного результат. Результатом може бути Norwalk, Ct), використовуючи комплект АВІ полегшення симптомів чи причин захворювання, PRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready або будь-які інші потрібні зміни в біологічній сисReaction Kit (Perkm-Elmer Corp.) за інструкціями темі. Наприклад, ефективна кількість поліпептиду виробника Олігонуклеотиди ZC695 (SEQ ID NO:5), zsig37 така, що забезпечує суб'єктивне полегшенZC694 (SEQ ID NO:6) для промотерів SP6 та Т7 на ня симптомів або об'єктивно виявлюване поліпвекторі, що включає клони, використовували як шення, як відмічено клінічним чи іншим кваліфікопраймери секвенсування. Олігонуклеотиди ваним спостерігачем. Така ефективна кількість ZC13210 (SEQ ID NO:7), ZC13588 (SEQ ID NO:8), поліпептиду zsig37 могла би забезпечувати, наZC13532 (SEQ ID NO 9), ZC13641 (SEQ ID NO 10), приклад, інгібування активованої колагеном актиZC13586 (SEQ ID NO. 11), ZC13651 (SEQ ID вації тромбоцитів та шляху обміну комплементу, NO:12), ZC13622 (SEQ ID NO:13), ZC13625 (SEQ включаючи Clq, збільшення локалізованого у суID NO:14), ZC13650 (SEQ ID NO:15), ZC13589 динній системі пацієнта потоку крові та/або при(SEQ ID NO:16), ZC13624 (SEQ ID NO:17), душення шкідливої дії ішеми та реперфузи. ЕфекZC13531 (SEQ ID NO:18), ZC13587 (SEQ ID NO:19) тивна кількість поліпептидів zsig37 може дуже та ZC13623 (SEQ ID NO:20) використовували для змінюватися залежно від захворювання чи симпзавершення послідовності з клону. Реакції секвентому, які підлягають лікуванню. Кількість потрібносування проводили на системі Hybaid OmmGene го для застосування поліпептиду та його концентTemperature Cycling System (National Labnet Co., рація у композиції залежить від вибраного Woodbndge, NY). Для аналізу даних використовунаповнювачу, шляху застосування, потужності вали програмне забезпечення секвенсування певного поліпептиду, клінічного стану пацієнта, SEQUENCHER™ 3,0 (Gene Codes Corporation, Ann побічної дії та стабільності сполуки у композиції. Arbor, Ml). Утворену послідовність розміром 2769 Тому клініцист застосовуватиме прийнятний препо розкрито у послідовності SEQ ID NO:1. Порівпарат з вмістом прийнятної концентрації у компоняння послідовності EST початкового походження зиції а також кількість застосовуваної композиції в з послідовністю, яку представлено послідовністю залежності від клінічного досвіду з розглянутим чи SEQ ID NO:1, показало наявність одної невизнаподібним пацієнтом. Така кількість залежатиме, ченої пари основ (невідомий "Ν" залишок) та відзокрема від конкретного стану, який підлягає лікусутність вставок пар основ, що призвело до іденванню, віку, маси тіла, та загального здоров'я патифікації лейцину при розв'язанні невизначеності цієнта а також інших зрозумілих фахівцю факторів. та нуль змін остову між встановленими амінокисЗвичайно дози знаходитимуться в межах 0,01лотними послідовностями. 100мг/кг маси суб'єкта. При таких застосуваннях як Приклад 2 Розподіл по тканинах катетери-балони типові дози знаходитимуться в Норзерн-блотинги здійснили, використовуючи межах 0,05-5мг/кг маси суб'єкта. Дози для певних Human Multiple Tissue Blots від Clontech (Palo Alto, сполук можуть бути визначеними з дослідження in CA). Зонд ДНК розміром 30 основ (ZC12447; SEQ vitro або ex vivo разом з дослідженням експеримеID NO:4) для 5' закінчення нуклеотидної послідовнтальних тварин. Концентрації сполук, що знайденості розвиненого білку, яку показано послідовнісні ефективними in vitro або ex vivo забезпечують тю SEQ ID NO:1, мітили радіоактивним 32Р, виконаведення для дослідження тварин при цьому ристовуючи полінуклеотидну кіназу Т4 та буфер дози розраховують для забезпечення подібних прямої реакції (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) за концентрацій у місці дії. інструкціями виробника Зонд очищали, використоВинахід ілюстровано далі наступними нелімівуючи колонку під тиском NUCTRAP (Stratagene туючими прикладами. Cloning Systems, La Jolla, CA). Розчин Приклад 1 Поширення послідовності EST EXPRESSHYB (Clontech, Palo Alto, CA) використоПолінуклеотиди згідно з винаходом, що кодувували для попередньої гібридизації та як розчин ють поліпептиди zsig37, спочатку ідентифікували для гібридизації для норзерн-блотів. Гібридизацію селекцією EST з бази даних EST, передбачаючи проводили протягом ночі при 50°С, а блоти далі 21 75037 22 промивали у 2Х SSC (розчин хлориду та цитрату (Stratagene, La Jolla, 1A) та використовували у натрію) та 0,1% - SDS (додецилсульфат натрію) термоциклері "RoboCycler Gradient 96" при кімнатній температурі, з наступною промивкою [Stratagene). Кожна з 27 реакційних сумішей PCR у 1Х SSC та 0,1% SDS при 68°С (приблизно 5°С складалася з 2мкл 10Х KlenTaq PCR-реакційного нижче точки плавлення). Один розмір транскрипту буферу (Clontech Laboratories Inc , Palo Alto, CA), спостерігали приблизно при 2,8ко. Інтенсивність 1,6мкл суміші dNTP (2,5мМ each, PERKIN-ELMER, сигналу була найвищою в серці та плаценті при Foster City, CA), 1мкл сенсового праймеру (SEQ ID відносно слабких сигналах у нирках яєчнику, надNO:21), 1мкл антисенсового праймеру (SEQ ID нирковій залозі та скелетних м'язах, а у норзернNO:22), 2мкл RediLoad (Research Genetics, Inc ), блоті наявні слабші сигнали для великої різнома0,4мкл 50Х Advantage ClenTaq Polymerase Mix нітності інших тканин. (Clontech Laboratories, Inc ), 25нг ДНК з певного Додатковий Норзерн-блотинг виконали, викогібридного клону або контролю та ddH2O до загаристовуючи Gut Northern Tissue Blot Блот виготовльного об'єму 20мкл. Реакційні суміші покривали ляли, використовуючи мРНК від лінії клітин SW480 рівною кількістю мінерального масла та закупорюколоректальної аденокарциноми людини вали. Умови PCR-циклера були такі початковий 1 (Clontech, Palo Alto, CA), тканини тонкого кишечницикл 5-хвилинноі денатурації при 95°С, 35 циклів ку людини (Clontech), тканини шлунка людини по 1 хвилині денатурації при 95°С, 1 хвилині гібри(Clontech), лінії клітин гладеньких м'язів кишечнику дизації при 60°С та 1,5-хвилинного подовження людини (Hism, АТСС No CRL-1692, American Type при 72°С, з наступним кінцевим 1 циклом подовCulture Collection (Американська колекція типів ження протягом 7 хвилин при 72°С. Реакційні сукультур) 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD), норміші розділяли електрофорезом на 3% агарозному малізованої лінії клітин товстої кишки людини гелі NuSieve GTG (FMC Bioproducts, Rockland, (FHC, АТСС No CRL-1831, American Type Culture ME). Collection) та нормалізованої лінії клітин тонкого Приклад 4 Створення експресійних векторів кишечнику ембріону людини (FHs74 Int.; АТСС No ссавця zsig37NEE/pZP9 та zsig37CEE/pZP9 CCL241; American Type Culture Collection). Для поліпептиду zsig37 виготовляли два ексЗагальну РНК виділяли з Hism, FHC та FHs74 пресійних вектори, zsig37NEE/pZP9 та Int. кислотно-гуанідиновим способом zsig37CEE/pZP9, які конструювали для експресії (Cheomczynski et al., Anal. Biochem. 162:156-9, поліпептиду zsig37, що має С- або N-кінцеву мітку 1987). ПоліА+ РНК відбирали елююванням загальGlu-Glu. ної РНК через колонку, що затримує поліА+ РНК Zsig37NEE/pZP9 (Aviv et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 69:1408-12, 1972) Створений у PCR фрагмент ДНК zsig37 розмі+ 2мкг поліА РНК від кожного зразка розділяли у ром 800 по створювали, використовуючи як PCR1,5% агарозному гелі у 2,2Μ формальдегіді та фопраймери ZC15040 (SEQ ID NO:24) та ZC15033 сфатному буфері РНК переносили на мембрану (SEQ ID NO:25) та темплат, що описано вище у Nytran (Schleicher та Schuell, Keene, NH) у 20Х Прикладі 1. Реакційну суміш PCR інкубували при SSC протягом ночі Блот обробляли у DV 94°С протягом 3 хвилин, а потім проводили 5 цикStratahnker 2400 (Stratagene, La Jolla/ CA) при лів при 94°С протягом 30с, 30°С протягом 20с та 0,12Дж. Блот далі прогрівали при 80°С протягом 72°С протягом 1 хвилини, супроводжуючи 25 цикгодини. лами при 94°С протягом 30с, 64°С протягом 20с та кДНК повної довжини (показано послідовністю 72°С протягом 1 хвилини. Далі проводили 5SEQ ID NO:1) ампліфікували за допомогою PCR хвилинне подовження при 72°С. Утворений про(полімеразна ланцюгова реакція) та мітили радіоадукт PCR далі проганяли на 0,9% ТВЕ агарозному ктивним dCTP з 32Р, використовуючи комплект гелі з буфером 1 ТВЕ. Смугу передбачуваного Rediprime pellet (Amersham, Arlington Heights, IL) за розміру вирізали та ДНК очищали з гелю смолою інструкціями виробника. Блот (гібридизували у Qiaex 11 (Qiagen) за інструкціями виробника ДНК EXPRESSHYB (Clontech) при 56°С протягом ночі. розщеплювали рестрикційними ферментами Barn Блот промивали при кімнатній температурі у 2Х HI та ХЬа І, супроводжуючи екстракцією та осаSSC та 0,1% SDS, далі у 2Х SSC та 0,1% SDS при дженням. -65°С, та під кінець при 65°С в 0,1X SSC та 0,1% Вирізаний, розщеплений рестрикцією фрагSDS. Результати показали, що zsig37 гібридизував мент ДНК zsig37 субклонували у плазміду з усіма тканинами окрім лінії клітин HISM гладеньNEE/pZP9, яку було розрізано рестрикційними феких м'язів кишечнику людини. рментами Barn НІ та Хbа І. Експресійний вектор Приклад 3 Хромосомне картування гена zsig37NEE/pZP9 включає лідерну послідовність Zsiq37 ТРА та приєднує до полінуклеоти-дної послідовноГен zsig37 картували до хромосоми людини сті, яка кодує N-кінець поліпептиду zsig37, мітку L7, регіон 17q25,2, за допомогою PCR, використоGlu-Glu (SEQ ID NO:26). Плазміда NEE/pZP9 (збевуючи панель NIGMS Human/Rodent Somatic Cell рігається у American Type Culture Collection, 12301 Hybrid Mapping Panel Number 2 (National Institute of Parklawn Drive, Rockville, MD, ATCC No 98668) є General Medical Sciences, Conell Institute of Medical експресійним вектором ссавця, що включає ексResearch). Панель складається з ДНК виділеної з пресійну касету що має мишачий промотер мета24 гібридів соматичних клітин людини/гризуна колотюнеін-1, пептид з лідерною послідовністю ТРА жний з яких зберіг специфічну хромосому людини та послідовність, що кодує мітку Glu-Glu (SEQ ID та батьківську ДНК. Для картування гена zsig37, по NO:26), множинність сайтів рестрикції для інсерції 20мкл реакційних сумішей розміщали у 96кодуючої послідовності, та термінатор гормону комірковому мікротитрувальному планшеті росту людини. Плазміда також включає початок 23 75037 24 реплікації Е. соlі, експресійний елемент придатновату натрію (Gibco BRL)) Клітини далі трансфектуго для селекції маркеру ссавця, що має промотер вали з плазмідою zsig37NEE/pZP9 (N-кінцева мітка SV40, енхансер та початок реплікації, ген DHFR та Glu-Glu) або zsig37CEE/p2P9 (С-кінцева мітка Gluтермінатор SV40. Glu), використовуючи Lipofectamine™ (Gibco BRL), zsig37CEE/pZP9 у позбавленій сироватки (SF) композиції середоСтворений у PCR фрагмент ДНК zsig37 розмівища (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, ром 866 по створювали, згідно з вищеописаним Gaithersburg, MD), 2мМ L-глутаміну, 2мМ пірувату способом, використовуючи як PCR-праймери натрію, 10мкг/мл трансферину, 5мкг/мл інсуліну, ZC15721 (SEQ ID NO:27) та ZC15035 (SEQ ID 10мкг/мл фетуїну та 2нг/мл селену). Шістнадцять NO:28). Очищений PCR-фрагмент розщеплювали мікрограм zsig37NEE/pZP9 та 16мкг рестрикційними ферментами Eco RI та Ваrn НІ, zsig37CEE/pZP9 окремо розбавляли у тубах по гель очищали, використовуючи смолу Qiaex II, що 15мл до загального кінцевого об'єму 640мкл SFописано вище. середовищем. В окремих тубах 35мкл Вирізану та розщеплену рестрикцією ДНК Lipofectamine™ (Gibco BRL) змішували з 605 мкл zsig37 субклонували у плазміду CEE/pZP9, яку SF-середовища. Додавали суміш Lipofectamine™ було розрізано рестрикційними ферментами Eco до суміші ДНК та давали інкубуватися приблизно RI та Ваrn НІ. Експресійний вектор 30 хвилин при кімнатній температурі. П'ять мілілітzsig37CEE/pZP9 використовує нативний сигнальрів SF-середовища додали до суміші ДНК ний пептид zsig37, а епітоп Glu-Glu (SEQ ID NO:26) Lipofectamine™. Клітини промивали один раз 5мл приєднано до С-кінця з метою очистки Плазміда SF-середовища, відсмоктували та додали суміш CEE/pZP9 (зберігається у American Type Culture ДНК-Lipofecfcamine™ Клітини інкубували при 37°С Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, протягом 5 годин, далі додали до планшета 6,4мл ATCC No.98668) є експресійним вектором ссавця, DMEM/10% FBS, 1% середовища PSN. Планшет що включає експресійну касету, що має мишачий інкубували при 37°С протягом ночі та суміш ДНК промотер металотюнеін-1, множинність сайтів реLipofectamine™ наступної доби заміняли свіжим стрикції для інсерції кодуючої послідовності, поссередовищем FBS/DMEM. На добу 2 після транслідовність, що кодує мітку Glu-Glu (SEQ ID NO:26), фекції клітини розподіляли у селекційне середостоп-кодон та термінатор гормону росту людини. вище (ESTEP №13 1мкМ МТХ) на 150мм планшети Плазміда також має початок реплікації Ε. coli, експри співвідношеннях 1:50, 1:100 та 1:200. Планшепресійний елемент придатного для селекції марти підживлювали на добу 5 після трансфекци свікеру ссавця, що має промотер SV40, енхансер та жим селекційним середовищем. початок реплікації ген DHFR та термінатор SV40. Скринінг колоній Для Ν- та С-мічених констрактів приблизно Приблизно 10-12 діб після трансфекци, одну 30нг розщеплених рестрикцією вставок та 50нг чашку по 150мм для культури резистентної до мевідповідних векторів конденсували при кімнатній тотрексату колонії вибрали з кожної трансфекци, температурі протягом 4 годин. Один мікролітр косередовище відсмоктували, планшети промивали жної суміші реакції конденсації незалежно вводили 10мл позбавленого сироватки середовища ESTEP електропорацією у компетентні клітини DH10B 2 (668,7г/50л DMEM (Gibco), 5,5г/50л пірувинної (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) за інструкцією викислоти, натрієвої солі 96% (Mallinckrodt), робника, наносили на LB планшети, що містять 185,0г/50л NaHCO3 (Mallinkrodt), 5,0мг/мл, 50мг/мл ампіциліну та інкубували протягом ночі. 25мл/50л інсуліну, 10,0мг/мл та 25мл/50л трансКолонії скринували за допомогою PCR, що ферину). Промивальне середовище відсмоктували описано вище. Для zsig37NEE/pZP9 та та заміняли 5мл позбавленого сироватки ESTEP 2 zsig37CEE/pZP9 скринувальними праймерами буСітку Sterile Teflon (Spectrum Medical Industries, Los ли ZC13006 (SEQ ID NO:29) та ZC13007 (SEQ ID Angeles, CA), яку попередньо просочували позбаNO:20). Реакційну суміш PCR інкубували при 94°С вленим сироватки ESTEP 2 розміщали далі поверх протягом 2,5 хвилин, далі піддавали 25 циклам клітин Стерильний нітроцелюлозний фільтр, який при 94°С протягом 10с, 58°С протягом 20с та 72°С попередньо просочували позбавленим сироватки протягом 1 хвилини, супроводжуючи 5-хвилинним ESTEP 2 розміщали далі поверх сітки. Орієнтаційні подовженням при 72°С. Послідовність вставки помітки на нітроцелюлозі переносили до чашки позитивних клонів, розміром 1013 по для для культури Планшети далі інкубували протягом zsig37NEE та фрагменту розміром 950 по для 5-6 годин у інкубаторі при 37°С, 5% СО2. Після zsig37CEE підтверджували секвенсуванням. Велиінкубування фільтр видаляли, та середовище відкомасштабне виготовлення плазмід виконали, висмоктували ι заміняли середовищем DMEM/5% користовуючи комплект QIAGEN0 Maxi prep FBS IX PSN (Gibco BRL). Фільтр далі поміщали у (Qiagen) за інструкціями виробника. герметизуємий балон, що включає 50мл буферу Приклад 5 Трансфекція та експресія (25мМ Трис, 25мМ гліцин, 5мМ β-меркаптоетанол) zsig37NEE та поліпептидів СЕЕ та інкубували на водяній бані при 65°С протягом Клітини ВНК 570 cells (АТСС No. CRL-10314) 10 хвилин. Фільтри блокували у 10% знежиреному наносили на чашки на 10см для культур тканин та сухому молоці/буфері Western A (Western A 50мМ давали зростати до приблизно 50-70% конфлюєнТрис рН7,4, 5мМ ЕДТА, 0,05% NP-40, 150мМ NaCI тності протягом ночі при 37°С, 5% СО2, у середота 0,25% желатин) протягом 15 хвилин при кімнатвищі DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, ній температурі на обертовому струшувачі. Фільтр (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% сироватки кородалі інкубували кон'югатом анти-Glu-Glu-aнтитілов'ячого ембріона (Hyclone, Logan, UT), 2мкМ LHRP при розбавленні 1:1000 у 2,5% знежиреному глутаміну (JRH Biosciences Lenexa KS), 1мкМ пірусухому молоці/буфері Western (Western A 50мМ 25 75037 26 Трис рН7,4, 5мМ EDTA, 0,05% NP-40, 150мМ NaCI ня (зміну кольору фенол-червоного). Оскільки не та 0,25% желатин) протягом ночі при 4°С на оберспостерігали забруднення, супернатант з конфлютовому струшувачі Фільтр далі тричі промивали єнтних колоній виливали у невеликі контейнери при кімнатній температурі у PBS плюс 0,1% Твін для збирання, відбирали зразки та відкидали. При20, 5-15 хвилин на промивку. Фільтр проявляли кріплені клітини далі промивали один раз 400мл реагентом ECL (Amersham Corp., Arlington Heights, PBS. Для відокремлення клітин з колоній, 100мл IL) за інструкціями виробника та експонували на трипсину додали до кожної та видаляли, а клітини плівку (Hyperfilm ECL, Amersham) протягом прибдалі інкубували протягом 5-10 хвилин в залишколизно 5 хвилин. вому трипсині. Клітини збирали, супроводжуючи Плівку суміщали з планшетом, що включає кодвома промивками по 200мл середовищем лонії, використовуючи плівку як орієнтир, придатні ESTEP1. До кожного з десяти флаконів, що вклюколонії відбирали. Стерильні диски по 3мм для чають середовище ESTEP1 (1,5л кожний, при колоній (PGC Scientific Corp., Frederick, MD) просо37°С) додали 40мл зібраних клітин.Один флакон чували трипсином та поміщали на колонії. Дванана 1,5л далі використовували для заповнення оддцять колоній для кожного констракту переносили ної колонії Nunc. Кожну колонію клітин поміщали в у 200мкл селекційного середовища у 96інкубаторі з 37°С/5,0% СО2. комірковому планшеті. Для кожної колонії провоПри конфлюєнтності 80-100%, на колоніях клідили сери з семи двократних розбавлень. Клітини тин Nunc провели тест на візуальне забруднення вирощували протягом одного тижня при 37°С, за (зміну кольору фенол-червоного). Оскільки споцей час комірки, які отримували найнижче розбавстерігали забруднення супернатант з конфлюєнтлення клітин, які на той час мали оптимальну гусних колоній виливали у невеликі контейнери для тину, відбирали, трипсинізували та переносили до збирання, відбирали зразки та відкидали. Прикріп12-коміркового планшету, що включає селекційне лені клітини далі промивали один раз 400мл PBS середовище. Чашку для культури на 150мм також 1,5л середовища ESTEP2 (668,7г/50л DMEM трипсинізували та залишок клітин об'єднували та (Gibco), 5,5г/50л пірувинної кислоти, натрієвої солі піддавали вестерн-аналізу та тестуванню мікопла96% (Mallinckrodt), 185,0г/50л NaHCO3 (Mallinkrodt), зми. Об'єднання заморожували для зберігання. 5,0мг/мл, 25мл/50 л інсуліну, 10,0мг/мл та Клони розділяли безпосередньо з 1225мл/50л трансферину) додали до кожної колони коміркового планшету у дві колби Т-75. Одну колбу клітин Nunc. Колони клітин інкубували при зберігали для подовження росту клітин, другу кол37°С/5,0% СО2. бу вирощували у позбавленому сироватки ESTEP Через приблизно 48 годин на колоніях клітин 2, який збирали для аналізу Вестерн-блотингом. Nunc провели тест на візуальне забруднення (зміКлони кожного з експресійних констрактів відбирану кольору фенол-червоного). Супернатант з кожли на основі аналізу Вестерн-блотингом, об'єднуної колонії виливали у невеликі контейнери для вали та переносили до високопродуктивної кульзбирання. Свіже позбавлене сироватки середовитури. ще (1,5л) виливали у кожну колонію клітин Nunc, Приклад 7 Високопродуктивна експресія та колонії інкубували при 37°С/5,0% СО2. Одинмл zsig37CEE ссавцем збору супернатанту для кожного констракту переОдну колбу Т-162, яка містить конфлюєнтні носили на слайд мікроскопу та мікроскопічно досклітини, що експресують zsig37CEE та одну, яка ліджували на забруднення. Вміст невеликих конмістить zsig37NEE, що отримано експресією, що тейнерів для збирання для кожного констракту описано вище, розподіляли у чотири колби Т-162 об'єднували та негайно фільтрували. Далі здійскожну. Одну з чотирьох отриманих колб викориснили другий збір, як по суті описано вище на 48-й товували для заморожування чотирьох кріосклягодині та колонії клітин після цього викидали. Асенок, а інші три колби використовували для ствоптично зібрану апаратуру з набору фільтрів викорення колоній клітин Nunc. ристовували для асептичного фільтрування зібраКлітини з трьох колб Т-162 з zsig37CEE та ного супернатанту (кондиційоване середовище). zsig37NEE використовували для незалежного заЗбірка була така трубку прикріплювали дротом сівання двох колоній клітин Nunc (10 шарів, комедо фільтру Opti-Cap (Millipore Corp., Bedford, MA) рційно доступні від VWR). Коротше, клітини з вита фільтру Gelman Supercap 50, (Gelman Sciences, щеописаних колб Т-162 роз'єднували Ann Arbor Ml). Фільтр Supercap 50 приєднували використовуючи трипсин, об'єднували та додавали також до стерильного покритого контейнеру, роздо 1,5л середовища ESTEP1 (668,7г/50л DMEM ташовуючи у кришці, трубку, що розташовано ви(Gibco),), 5г/50л пірувинної кислоти, натрієвої солі ще фільтру Millipore Opti-cap вставляли у периста96% (Mallinckrodt) 185,0г/50л NaHCO3 (Mallinkrodt), льтичний насос, а вільний кінець трубки поміщали 5,0мг/мл та 25мл/50л інсуліну (JRH Biosciences), у великому контейнері для збирання. Перисталь10,0мг/мл та 25мл/50л трансферину (JRH тичний насос працював при 200-300об./хвил., доки Biosciences), 25г/50л сироватки коров'ячого ембрівсі з кондиційованих середовищ не проходили она охарактеризовано) (Нусlоnе), 1мкМ МТХ, з через кінцевий фільтр на 0,22мкм до стерильного доведеним до 7,05+/-0,05рН), що попередньо назбирального контейнеру. Фільтрат поміщали у хогрівали до 37°С. Середовища, що включають клілодне приміщення з температурою 4°С до очисттини заливали далі у колонії клітин Nunc через ки. Середовище концентрували 10Х через обмелійку. Колони клітин поміщали у інкубаторі з жувальний концентратор Millipore 5kDA (Millipore 37°С/5,0% СО2. Corp., Bedford, MA) за інструкцією виробника та При конфлюєнтності 80-100% на вмісті колоній піддавали аналізу Вестерн-блотингом, використоклітин Nunc провели тест на візуальне забрудненвуючи антитіло проти FLAG-мітки (Kodak). 27 75037 28 Zsiq37CEE: пептиду хроматографією на урівноваженій з PBS 5 колб Т-162=0,12мг/л, 38кДа, колонці 1,5 50см Sephadex G-50 (Pharmacia, 1 колонія, FBS=0,12мг/л, 38кДа, Piscataway, NJ) при швидкості потоку 1,0мл/хвил, 10 колоній, FBS=0,12мг/л, 38кДа, використовуючи BioCad Sprint HPLC (PerSeptive 10 колоній (#1), SF=1,2мг/л, 38кДа, та BioSystems, Framingham, MA). Двомілілітрові фра10 колоній (#2), SF=3,56мг/л, 38кДа кції збирали та відслідковували поглинання при Zsiq37NEE 280нм. Збирали перший викид матеріалу з погли5 колб Т-162=0,137мг/л, 35кДа, нанням при 280нм та елююючогося приблизно при 1 колонія, FBS=0,137мг/л, 35кДа, об'ємі незаповненої колонки. Ці фракції були чис10 колоній, FBS=0,137мг/л, 35кДа, тими zsig37 NEE або zsig37 CEE. Чистий матеріал 10 колоній((#1), SF=1,37мг/л, 35кДа, та концентрували, як описано вище, аналізували за 10 колоній (#2), SF=4,11мг/л, 35кДа допомогою SDS-PAGE (електрофорез на SDSПриклад 7 Очистка zsiq37 NEE та zsiq37 CEE поліакриламідному гелі) та Вестерн-блотингу з Якщо не сказано інше усі операції проводили анти-ЕЕ-антитілами, та зразки піддавали амінокипри 4°С. Наступні процедури використовували для слотному аналізу та N-кінцевому секвенсуванню. очистки zsig37, що включає N-кінцеву або СЗалишок зразку аліквотували, та зберігали при кінцеву мітку Glu-Glu (ЕЕ). Загалом 25л кондиційо80°С згідно з нашою стандартною процедурою. ваного середовища з клітин нирок дитинчати хоЕлектрофорез zsig37NEE на гелях SDS-PAGE м'яка (ВНК) послідовно фільтрували в стерильних при відсутності засобів відновлення показав одну умовах через 4-дюймовий капсульний фільтр на головну пофарбовану. Кумассі блакитним смугу 0,2мМ Millipore (Bedford, MA) OptiCap та 0,2мМ явної молекулярної маси 39000 та кілька слабших Gelman (Ann Arbor, Ml) Supercap 50. Матеріал далі компонентів з молекулярними масами 60000 та концентрували приблизно до 1,3л, використовую116000. Усі смуги показали перехресну реактивчи тангенціальний концентратор потоку Millipore ність з анти-ЕЕ-антитілами на Вестерн-блотах. У ProFlux A30, що опоряджений обмежувальною присутності засобу відновлення, спостереженою мембраною на 3000кДа Amicon (Bedford, MA) була тільки смуга білку масою 39000кДа, а інтенS10Y3. Концентрований матеріал знов фільтрувасивність забарвлення й Кумассі блакитним зросли в стерильних умовах через фільтр Gelman, як тала. Ця смуга також показала перехресну реакописано вище. Суміш інгібіторів протеази додали тивність з анти-ЕЕ-антитілом на Вестерн-блотах. до концентрованого кондиційованого середовищ Для zsig37CEE електрофорез на SDS-PAGE до кінцевих концентрацій 2,5мМ етилендіамінпоказав одну головну пофарбовану Кумассі блакитетраоцтової кислоти (ЕДТА, Sigma Chemical Co St тним смугу явної молекулярної маси 39000 та кільLouis, MO), 0,001мМ лейпептину (Boehnngerка слабших компонентів з молекулярними масами Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001мМ пепстатину 60000 та 116000. На Вестерн-блотах показали (Boehnnger-Mannheim) та 0,4мМ Pefabloc крос-реактивність з анти-ЕЕ-антитілом тільки сму(Boehnnger-Mannheim). Зразок анти-ЕЕ-сефарози ги ймовірних молекулярних мас 150000, 116000, та об'ємом 25,0мл, що виготовлено, як описано ниж60000. У присутності засобу відновлення, спостече, додали до зразка для порції адсорбції та суміш реженою була тільки смуга білку масою 39000кДа, обережно перемішували на обертовому апараті і цей матеріал показав крос-реактивність з антидля культур Wheaton (Millville, NJ) протягом ЕЕ-антитілом на Вестерн-блотах. В цих умовах 18,0годин при 4°С. невеликі кількості матеріалу, що виявляє перехреСуміш виливали далі у колонку 5,0 20,0см сні реакції спостерігали також при 150000кДа. Econo-Column (Βіο-Rad, Laboratories Hercules, CA) Виготовлення анти-ЕЕ-сефарози та промивали гель 30 об'ємами колонки буфероВихідний об'єм білку у 100мл G-Сефарози ваного фосфатом фізіологічного розчину (PBS). (Pharmacia, Piscataway, NJ) промивали тричі Незатриману пропущену фракцію відкидали. Як 100мл PBS, що включає 0,02% азиду натрію, витільки поглинання ефлюєнту при 280нм було менкористовуючи фільтрувальний елемент у 0,45 мікше 0,05, потік через колонку зменшували до нуля рон на 500мл Nalgene. Гель промивали 6,0 об'єта анти-ЕЕ-сефарозний гель промивали партіями мами 200мМ триетаноламіну, рН8,2 (TEA, Sigma, у 2,0 об’єму колонки PBS, що включають 0,4мг/мл St. Louis, МО), та додали рівний об'єм розчину ЕЕЕЕ-пептиду (AnaSpec, San Jose, CA). Пептид, що антитіла, що включає 900мг антитіла. Після інкувикористано, має послідовність (Glu-Tyr-Met-Proбування протягом ночі при 4°С, незв'язане антитіVal-Asp, SEQ ID NO:31). Через 1,0 годину при 4°С, ло видаляли промивкою смоли 5 об'ємами 200мМ потік відновлювали та збирали елюйований білок. TEA, як описано вище. Смолу ресуспен-дували у 2 Цю фракцію позначали як елюацію пептиду Антиоб'ємах TEA, переносили до придатного контейнеЕЕ-сефарозний гель далі промивали 2,0 об'ємами ру, та додали до кінцевої концентрації гелю колонки 0,1Μ гліцину, рН2,5, та гліцинову промив36мг/мл розчиненого у TEA диметилпімілімщатуку збирали окремо рН елюйованої з гліцином фра2НСІ (Pierce, Rockford, IL). Гель струшували при кції доводили до 7,0 додаванням невеликого об'єкімнатній температурі протягом 45 хвилин та рідиму 10Х PBS та зберігали при 4°С для наступного ну видаляли, використовуючи фільтрувальний аналізу, за необхідністю. елемент, що описано вище. Неспецифічні ділянки Елюацію пептиду концентрували до 5,0мл, вина гелі далі блокували інкубуванням протягом 10 користовуючи концентратор за молекулярною махвилин при кімнатній температурі з 5 об'ємами сою 15000 з обмежувальною мембраною (Millipore, 20мМ етаноламіну у 200мМ TEA. Гель промивали Bedford, MA) за інструкціями виробника. Концент5 об'ємами PBS, що включає 0,02% натрію азиду ровану елюацію пептиду відділяли від вільного та зберігали в цьому розчині при 4°С 29 75037 30 Приклад 8 Дослідження адгезії та проліферації стовували для скринування бази даних EST миші Здатність zsig37 стимулювати адгезію та покдля гомологічної послідовності миші. Одиничну риття клітин TF-1 аналізували як таку. З міченого послідовність EST розкривали та прогнозували по С-кінцю Glu-Glu zsig37 виготовляли серп розбащодо послідовності zsig37 людини. Для ідентифівлень, від 10 до 0,0625мкг/мл, у покривальному кації відповідної кДНК для секвенсування викорисбуфері (0,1Μ NaCO3) PBS або ELISA та кожне потовували клон, що як вважають, ймовірно містить міщали у 96-комірковому планшеті (Costar, суцільну кодуючу послідовність, використовуючи Pleasanton, СА) при 100мкл/комірку. Планшети комплект Invitrogen SNAP™ Mmiprep (Invitrogen інкубували при 37°С, 5% СО2, протягом 2 годин. Corp ) за інструкціями виробника, виготовляли 5мл Планшети далі промивали тричі RPM1/10% FBS нічної культури у LB+50 }мкг/мл ампіциліну. Темп(RPMI 1640, 2мМ L-глутамін, 110мкг/мл пірувату лат секвенсували на секвенсорі ДНК моделі 377 натрію, PSN та інактивованої теплом 10% сироваABIPRISM™ (Perkin-Elmer Cetus Norwalk, CT) витки коров'ячого ембріона) та блокували протягом користовуючи комплект АВІ PRISM™ Big Dye 15 хвилин. Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Клітини TF-1 (похідні з клітин гострої мієлоїд(Perkin-Elmer Corp.) за інструкціями виробника. ної лейкемії) ресуспендували у RPMI/10% FBS та Олігонуклеотиди ZC694 (SEQ ID NO:6), ZC6768 наносили при 10000 клітин/комірку на покриті (SEQ ID NО:32), ZC18297 (SEQ ID NO:33), zsig37CEE 96-коміркові планшети при кінцевому ZC18298 (SEQ ID NO:34), ZC18402 (SEQ ID об'ємі 120мкл/комірку. Планшет інкубували при NО:35), ZC18403 (SEQ ID NO:36), ZC18456 (SEQ 37°С при 5% СО2, протягом 2 годин. Планшети ID NO:37), ZC18457 (SEQ ID NO:38), ZC18560, далі промивали тричі PBS та додали (SEQ ID NO:3,9), ZC18561 (SEQ ID NO:40), 200мкл/комірку середовища росту (RPM1/10% ZC18687 (SEQ ID NO:41) та ZC18688 (SEQ ID FBS, 5нг/мл GM-CSF). Клітини інспектували мікроNO:42) використовували для доповнення послідоскопією до та після промивки. вності від клону. Реакції секвенсування проводили Аналіз забарвленням використовували також на системі Hybaid OmniGene Temperature Cycling для кількісного вимірювання числа прикріплених System (National Labnet Co., Woodbndge, NY). Для клітинна основі колориметричних змін та посиленаналізу даних використовували програмне забезня флуоресцентного сигналу. Барвник Alamar печення секвенсування SEQUENCHER™ 3,0 Blue™ (AccuMed, Chicago, IL) додали до 96(Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml). Утворену коміркових планшетів та клітини інкубували при послідовність розміром 2559 по розкрито послідо37°С та 5% СО2 протягом ночі. Планшети далі вністю SEQ ID NO:43 та похідною амінокислотною сканували, використовуючи флуориметр з довжипослідовністю SEQ ID NО:44. Накладка на нуклеоною хвилі збудження 544нм та довжиною хвилі тидну послідовність zsig37 людини (SЕQ ID NO:1) емісії 590нм. Більше прикріплених клітин було на показала 77% ідентичності на нуклеотидному рівні. покритих zsig37CEE-PBS планшетах, ніж на покриПрогнозована амінокислотна послідовність (SEQ тих zsig37CEE-0,1Μ NaCO3 планшетах. Додавання ID NO:44) має 77% ідентичності з послідовністю розчинного zsig37 не блокувало адгезію клітин до поліпептиду людини (SEQ ID NO:2). приєднаного zsig37. Приклад 10 Дослідження на основі клітин Аналіз забарвленням використовували також Поліпептиди zsig37 аналізували з високою для кількісного вимірювання числа прикріплених продуктивністю у аналізі in vitro для ідентифікації клітинна основі колориметричних змін та посиленречовин, що селективно активують клітинні реакції ня флуоресцентного сигналу. Барвник Alamar у безсмертних лініях клітин остеобластів. У аналізі Blue™ (AccuMed, Chicago, IL) додали до 96використовували розвинену лінію клітин остеоблакоміркових планшетів та клітини інкубували при стів ССС4, що походить від мишей р53-/- (дефіци37°С та 5% СО2 протягом ночі. Планшети далі тних), які трансфектовані плазмідою, яка включає сканували, використовуючи флуориметр з довжидозволяючий індукцію реакційних елементів сироною хвилі збудження 544нм та довжиною хвилі ватки (SRE), що призводить до експресії люцифеемісії 590нм. Більше прикріплених клітин було на рази. Ці клітини також експресують ендогенні репокритих zsig37CEE-PBS планшетах, ніж на покрицептори РТН, PDGF та bFGF. Стимуляція SRE, а тих zsig37CEE-0,1Μ NaCO3 планшетах. Додавання тим самим експресії люциферази у клітинах ССС4 розчинного zsig37 не блокувало адгезію клітин до свідчить, що хімічний об'єкт ймовірно стимулює приєднаного zsig37. мітогенез у остеобластах. Другий аналіз виконали, використовуючи Ліни Лінії ССС4 трипсинізували та доводили до клітин TF-1, DA-1 (залежні від IL-3 ліні клітин, що 5 104клітин/мл у висівному середовищі (альфапоходять з лімфатичного вузла миші з В-клітинною МЕМ, 1% інактивованої нагріванням сироватки лімфомою вирощуванням у середовищі з IL-3 (закоров'ячого ембріона, 1мМ пірувату Na та 2мМ Lпропоновано Dr Kenneth Kaushansky, University of глутамату) та наносили (200мкл/комірку) на Washington, Seattle, WA)), пре-В (р53-/- клітини Dynatech Mikrolite світлонепроникні білі мікротиткісткового мозку миші, залежні від IL-7, B220+, Thyl рувальні планшети (Dynatech, Chantilly, VA) і інкуlow, Sca-I+), та A7BaF-3, що описано вище, при бували протягом ночі при 37°С, 5% СО2. Середо5000клітин/комірку. Клітини SHK наносили також вище для росту далі відсмоктували та заміняли при 500клітин/комірку Zsig37 посилював ріст клітин 50мкл/комірку середовищем для аналізу (F-12 A7-BaF-3 та слабко інгібував ріст клітин DA-1. НАМ, 0,5% альбуміну коров'ячої сироватки, 20мМ Приклад 9 Послідовність мишачого ортологу ГЕПЕС, 1мМ пірувату Na та 2мМ L-глутамату). Новий поліпептид людини zsig37, що кодоваСерійні розбавлення zsig37 зробили середовищем ний полінуклеотидами згідно з винаходом викоридля аналізу (0,29-1000нг/мл кінцевої концентрації 31 75037 32 аналізу) та додали до комірок. Зразки Zsig37 анаком у 1с. Середній базальний (неіндукований) сиглізували у потрійному повторенні. Використовуванал вичитали з усіх даних що представлені у табли також сироватку (негативний) та bFGF (позитилиці 5 як процентне співвідношення з продуковавний) контролі. Кінцева концентрація bFGF ною 3нг/мл bFGF максимальною індукцією. П'ятискладала 3нг/мл. Контролі аналізували у чотирикгодинна обробка цієї лінії клітин bFGF, DDGF, EGF ратному повторенні. Планшети інкубували протяабо РМА призводить до 25-50 кратної індукції ексгом 4 годин при 37°С, 5% СО2. Середовище для пресії SRE-люциферази. аналізу далі відсмоктували та планшети промиваZsig37 не виявлений як стимулюючий експрели один раз PBS. До кожної комірки далі додали сію люциферази у цьому аналіз Zsig37 стимулює її 25мкл лізисного буферу (Luciferase Analysis при 0,2-0,1% максимального при 1000нг/мл. Reagent/ E1501, Promega Corp., Madison, Wl). Приклад 10 Призначення in vivo zsig37 шліхом Планшети інкубували протягом 15 хвилин при кімдоставки аденовірусами натній температурі. П'ятнадцять мкл/комірку субДвадцять чотири самця та 24 самки мишей страту люциферази (Luciferase Аналіз Reagent, C57B16/J, віком приблизно 12 тижнів (Jackson E1501, Promega Corp.) додали та активність люLabs, Bar Harbor, ME) зважували, вимірювали темциферази визначали, використовуючи Labsystems пературу тіла та споживання їжі відстежували кожLUMINOSKAN® при 2с/комірку з наступним проміжного дня протягом чотирьох діб до діб -4 - -1). У ком у 1с. Середній базальний (неіндукований) сигдобу 0, мишей поділяли на три групи і вони отринал вичитали з усіх даних, що представлені у табмували 0,1мл вірусу (AdV-холостих 1,8 1011 вірулиці 5 як процентне співвідношення з сних частинок/0,1мл або AdV-zsig37-CEE 5 1011 продукованою 3нг/мл bFGF максимальною індукцівірусних частинок/0,1мл) внутрішньовенною ін'єкєю. цією у хвіст, або без ін'єкції взагалі. Ін'єкція може Zsig37 стимулює експресію люциферази у призводити до інфекції печінки хазяїна, а експресія цьому аналіз, вказуючи, що вони стимулюють доставленого вірусом гена може починатися проостеобласти Zsig37 стимулює при 73 до 75% від тягом 24 годин та продовжуватися протягом 1-4 максимальної при 1000нг/мл. тижнів. Тестували три групи мишей. Група 1, необПротилежний частковий аналіз міметику факроблена, n=8 кожних з самців та самок Група 2, тору росту здійснили для визначення, чи діє zsig37 AdV- холостий (холостий вірус), n=8 кожних з самяк міметик фактору росту, зокрема, ліганди рецепців та самок. Група 3 AdV-sig37 ЕЕ n=8 кожних з торів тирозин-кінази PDGF, bFGF та EGF (інсулінсамців та самок. R-негативний). У аналізі використовували клонаМасу тіла тварин, температуру тіла та масу льну лінію клітин, що походить від мишей Swiss поглинутої їжі відстежували протягом 3 тижнів доЗТЗ, Swiss ЗТЗ, які є трансфектованими плазміслідження. Між групами не виявлено ніякої різниці. дою, яка включає дозволяючий індукцію реакційНа добу 21 самиць мишей, а на добу 22 самних елементів сироватки (SRE), що призводить до ців, умертвляли цервікальним вивихом. Тварин експресії люциферази. Ці клітини також експресуобезкровлювали та тканини збирали для автопсії. ють ендогенні рецептори РМА, EGF та bFGF. СтиСтандартну панель сироваточної хіми зробили муляція SRE та тим самим експресія люциферази під час умертвіння. Печінка, нирки та метаболічні у клітинах Swiss ЗТЗ свідчить, що хімічний об'єкт параметри всі були в нормальних межах. Однак, ймовірно імітує активність факторів росту PDGF, спостерігали відмінність між обробленою zsig37 bFGF та EGF. групою та обробленою холостим вірусом групою. Клітини Swiss ЗТЗ трипсинізували та доводили Тварини zsig37 мали вищий середній ліпемічний до 5 104клітин/мл у засівному середовищі, наноіндекс ніж контрольні з холостим вірусом. Відмінсили та інкубували, як описано вище. Середовище ність незначна, однак подальші дослідження є для росту далі відсмоктували та заміняли виправданими. Загальні вільні жирні кислоти ана50мкл/комірку середовищем для аналізу (F-12 лізували на сироватці, що залишається від кожної НАМ, 0,5% альбуміну коров'ячої сироватки, 20мМ тварин. Статистично значущу відмінність у рівні ГЕПЕС) Серійні розбавлення zsig37 зробили серевільних сироваточних жирних кислот спостерігали довищем для аналізу (0,29-1000нг/мл кінцевої між самцями мишей (р=0,0379), що отримували концентрації аналізу) та додали до комірок. Зразки холостий вірус та тими що отримували вірус, що Zsig37 аналізували у потрійному повторенні. Викокодує zsig37 миші zsig37 мали вищі рівні. Відмінристовували також сироватку (негативний) та ність хоча і не статистично значущу спостерігали bFGF (позитивний) контролі. Кінцева концентрація також у самиць (р=0,3357). Печінку, селезінку нирbFGF складала 3нг/мл. Контролі аналізували у ки, тимус серце та мозок зважували після видачотирикратному повторенні. Планшети інкубували лення. Ніякої різниці не знайдено між групами обпротягом 4 годин при 37°С, 5% СО2. Середовище робки. Гістопатологічний аналіз цих тканин та для аналізу далі відсмоктували та планшети прокісткового мозку не виявив ніякої різниці між грумивали один раз PBS. До кожної комірки далі допами обробки. дали 25мкл лізисного буферу (Luciferase Аналіз Для підтвердження вищезазначених результаReagent, E1501, Promega Corp, Madison, Wl). тів друге скринування виконали як вищезазначено, Планшети інкубували протягом 15 хвилин при кімз такими модифікаціями. Тестували три групи, що натній температурі. Сорок мкл/комірку субстрату містять 20 мишей C57B16/J. а) необроблених та люциферази (Luciferase Аналіз Reagent, E1501, голодних, b) AdV-нульових та голодних, с) AdVPromega Corp.) додали та активність люциферази zsig37-CEE та голодних, по 10 кожних самця та визначали, використовуючи Labsystems самицю. Миші голодували протягом ночі та 100мкл LUMINOSKAN® при 2с/комірку з наступним проміжсироватки збирали для визначення базального 33 75037 34 рівня таких параметрів глюкоза при голодуванні, контроль. Безпосередньо перед використанням ТР (тестостеронпропюнат), лужна фосфатаза, білки розбавляли у 2 X PBS (буферований фосфахолестерин, тригліцериди, вільні жирні кислоти та том фізіологічний розчин, Sigma Co.) до 100мкг/мл інсулін. Маси тіла визначали тричі на тиждень. У та доводили до рН7,2 0,1Η NaOH. Кожний зразок добу 0 мишей ін'єктували у бічну вену хвоста білку наносили в чотирьох повтореннях 0,1мл розчину підхожого вірусу. Кров збирали на (100мкл/комірку) на 96-комірковому планшеті. добу 17 після голодування протягом ночі. Через 3 Планшету давали сохнути протягом ночі у шафі з тижні мишей умертвляли та збирали усю кров. ламінарним режимом течи та промивали 3 рази по Частину крові змішували з ЕДТА для СВС (клініч400мкл розчину 5мг/мл BSA у 1 X PBS та промоного аналізу крові)а залишок слід знов аналізувати кали досуха. Zsig37 був FITC-міченим за інструкціта скринувати, як описано вище. Органи збирали а ями виробника (Pierce, Rockford, IL). У кожну комітушу залишали для гістопатології. рку додали 100мкл 1,8мкг/мл zsig37-FITC у 5% Приклад 11 Вазодилатація кілець аорти BSA, PBS. Планшети інкубували протягом 1,5 гоДію zsig37 на вазодилатацію кілець аорти видин при кімнатній температурі, далі промивали 3 мірювали згідно зі способами [Dainty et al., J рази 5% BSA, PBS. До кожної комірки додали далі Pharmacol 100: 767 1990 та Rhee et al, Neurotox 100мкл розбавленого 1:400 мишачого анти16:179, 1995]. Коротше, кільця аорти довжиною РІТС/біотину (Sigma Co.). Планшет інкубували 1,5 4мМ брали від щурів Sprague Dawley віком 4 місяці години при кімнатній температурі та промивали 3 та поміщали у модифікований розчин Кребса рази 5% BSA, PBS. Планшет далі інкубували з 100мкл 1:1000 розчину стрептавідин/HRP (118,5мМ NaCI, 4,6мМ KСl, 1,2мМ MgSO4 7Н2О, (Amersham, Piscataway, NJ) протягом 1 години та 1,2мМ KН2РО4, 2,5мМСаСІ2 2Н2О, 24,8мМ промивали 3 рази 5% BSA, PBS. Планшет далі NaHCO3 та 10мМ глюкози). Кільця далі приєднупроявляли, використовуючи Supersignal® Ultra вали до ізометричного датчика сили (Radnoti Inc., (Pierce, Rockford, IL) за інструкцією виробника. Monrovia, CA), а дані реєстрували на фізіологічній Після перебігу реакції протягом 1 хвилини, платформі Ponemah (Gould Instrument systems надлишок рідини видаляли з планшетів їх перевеInc., Valley View, OH) та поміщали у модифіковартанням та паттингом (patting) досуха. Планшет ний розчин Кребса в оксигенованій тканинній бані експонували на рентгенівську плівку (Kodak, на 10мл (95% О2, 5% СО2). Тканини піддавали далі Rochester, New York). натягу 1 граму в стані покою та давали стабілізуРезультати цього скринування свідчать, що ватися протягом одної години перед тестуванням. тільки фібронектин та колагени І, II, III, V та VI поКільця тестували додаванням 5мкл 1X10-7М норемітно приєднуються до zsig37-FITC. Таке зв'язупінефрину (Sigma Co., St. Louis, MO) до кінцевої -9 вання не спостерігали з ламініном, вітронектином, концентрації приблизно 1X10 Μ та карбахолу, колагеном IV або BSA-контролем. мускаринового агоністу ацетилхоліну (Sigma Со.) Приклад 13 Специфічність зв'язування zsig37 з при кінцевих 2X10-7М, для тестування цілісності колагеном типу VI кілець. Далі кожне тестоване кільце промивали Аналіз зв'язування за допомогою ELISA, що тричі свіжим буфером, з проміжками 5 хвилин між описано у прикладі 12, модифікували для кількіспромивками та давали спочити одну годину. Для ної оцінки зв'язування Zsig37-FITC у межах 0,4тестування на вазодилатацію, кільця стягували до 4мкг/мл зв'язували з 10мкг колагену типу VI двох грам та давали стабілізуватися протягом 15 (Chemicon International), як описано вище. Люмінехвилин. Далі до 1, 2 або 3 з 4 бань додали без сценцію реагенту SupersignalR зчитували на планзміщення Zsig37 та натяг на кільцях реєстрували шетному зчитувачі Wallac 1420 (Wallac, та порівнювали з контрольними кільцями. Кільця Gaithersburg MD), а інтенсивність використовували далі тестували на скорочення з норепінефрином, для кількісного вимірювання зв'язування zsig37як описано вище. Кільця тестували при 323, 162, FITC з планшетом ELISA. та 81нг/мл zsig37, але реакцію на дозу не змогли Приєднання zsig37 до колагену типу VI відповизначити. Для оцінки статистичної значущості відає типовій гіперболічній кривій зв'язування результатів виконали обмежене тестування на усіх (Фіг.3а). Зв'язаний Zsig37-FITC, який наносили при оброблених zsig37 та контрольних кільцях, вико0,4мкг/мл, може конкурувати з колагеном додаристовуючи розтягування як детермінант 10 з 12 ванням неміченого Zsig37 у межах 0,8-8мкг/мл кілець тестували з вазодилацією zsig37 як робили (Фіг.3d). Ці результати можуть свідчити, що зв'язуз 2 з 7 контролів Р-показник точності Фішера склавання для доменів на колагені типу VI є специфічдає 0,045. Зроблено висновок, що zsig37 індукує ним та залежним від концентрації. вазодилатацію у скорочених норепінефрином кіПриклад 14 Зв'язування Zsiq37 з комплеменльцях аорти. том Clq Приклад 12 Зв'язування zsiq37 з матричними Zsig37-FITC при 0,2мкг/мл, як було показано білками способом, що описано вище у Приклад 13, приєдELISA (імуносорбентний аналіз зв'язування нується до комплементу Clq (Sigma Co.) при 0,1ферментів) використовували для вимірювання 10мкг/мл (Фіг.4). Ступінь зв'язування є залежним зв'язування zsig37 з різними матричними білками від концентрації та насичуваним. та комплементом Clq. Матричні білки, що викорисПриклад 15 Інгібування комплементу за допотано, були коров'ячим колагеном типу І (Becton могою Zsiq37 Dickinson, Lincoln Park, NJ) ламініном, вітронектиДослідження комплементу здійснили у 96ном, фібронектином, колагеном людини типів II, III, коміркових круглодонних планшетах. ЖелатиноIV, V, VI (Chemicon International, Temecula, CA). вий буфер Veronal, що включає магній та кальцій BSA V (Sigma Co.) використовували як негативний 35 75037 36 (141мМ NaCI, 1,8мМ натрій-барбітол, 3,1мМ барбітромбіном активацію (Фіг.6b). Активація колагену турова кислота, 0,1% коров'ячий желатин, 0,5мМ не інгібувалася іншим спорідненим комплементу МgСІ2 та 0,15мМ СаСІ2) використовували для усіх Clq білком zsig39 [співподана патентна заявка розбавлень сироваток та інгібіторів, а також суСША 09/140804]. спензій еритроцитів. П'ятдесят мікролітрів стандаПриклад 17 Стимуляція росту фібробластів ртизованої комплементарної сироватки людини SK5 за допомогою Zsiq37 (Sigma Co.), розбавленої 1/37,5 (для кінцевого роФібронектин людини (25мкг/мл, GIBCO BRL, збавлення 1/150), додали до кожної комірки. ІнгібіGaithersburg, MD) наносили на 96-коміркові плантор додали у потроєному повторенні, шети (Costar, Pleasanton, CA) при 100мкл/комірку 50мкл/комірку. Сироватку та інгібітор інкубували та давали сохнути в ламінарній шафі протягом протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. ночі. Фібробласти людини SK5 у DMEM (Gibco), Аналіз починали додаванням 100мкл 2X10-8мл що включає 10% сироватки коров'ячого ембріона несенсибілізованих еритроцитів вівці (Colorado нижчого ендотоксину (Hyclbne, Logan, UT) наносиSerum Co., Denver, CO) сенсибілізовані еритроцили при 5000клітин/комірку на покриті фібронектити вівці, сенсибілізували, використовуючи протоном планшети та інкубували при 37°С, 5% СО2 кол виробника гемолізину (BioWhittaker Inc., протягом 2-3 діб. Число клітин на планшет довоWalkersville, MD) та кролячі еритроцити, що місдили до досягнення стану неконфлюєнтності. Клітять 16мМ ЕГТА, та 4мМ Мg+2. Серп розбавлення тини далі двічі промивали позбавленим сироватки сироватки людини від 1/50 до 1/400 також наносиDMEM з глюкозою (Gibco) та відчуваючим нестали як активний контроль. Еритроцити, лізовані ток у сироватці внаслідок зростання у позбавледистильованою водою та розбавлені до 100, 75, ному сироватки DMEM з глюкозою протягом 24 50, 25, та 12,5 процентів лізису, використовували годин Zsig37 додали до комірок у потроєному подля кількісного визначення проценту лізису комвторенні, при концентраціях від 312,2нг/мл до плементу. Планшет закупорювали та інкубували 10000нг/мл у 100мкл DMEM. Клітини далі інкубупри 37°С протягом 1 години з перемішуванням вали протягом 48 годин при 37°С, 5% СО2. Пролікожні 15 хвилин. Реакцію зупиняли додаванням ферацію клітин тестували, додаючи 15мкл розчину 220мМ ЕДТА, 20мкл/комірку, та планшети барвнику МТТ (комплект CellTiter96™, Promega) центрифугували при 1500 X G протягом 10 хвилин. до кожної комірки. Планшет інкубували 4 години Сто мікролітрів супернатанту видаляли з кожної при 37°С, 5% СО2 та реакцію зупиняли розчином комірки та переносили до 96-коміркового плоскоSolubhzation/Stop (комплект CellTiter96™, донного планшету для аналізу Планшет зчитували Promega) за інструкціями виробника. Планшет при 415нм та розраховували процент лізису. інкубували протягом 1 години до розчинення крисZsig37 був ефективним при інгібуванні класичталів формазану та поглинання вимірювали при ного шляху обміну з як сенсибілізованими, так i 570нм з віднесенням на 650нм, використовуючи несенсибілізованими еритроцитами вівці (Фіг.5). планшетний зчитувач ELISA. Не виявлено помітного інгібування тестованого Результати (Фіг.7) показують зростання залекролячими еритроцитами та ЕГТА альтернативножності від дози числа фібробластів SK5 в рамках го шляху обміну. Механізм інгібування невизначетестованих концентрацій zsig37. Ці концентрації ний, але оскільки Clq приєднується до zsig37, Clq є були в межах величин, що показані для мітогенної найімовірнішою мішенню. дії ланцюга фібриногену b (Gray, et al, Am J Respir Приклад 16 Інгібування за допомогою Zsig37 Cell Моl Biol 12, 684,1995 та Gray, et al, J. Biol. активації тромбоцитного колагену Chem. 270, 26602, 1995) та для адгезії клітин фібКров від здорових добровольців відбирали у робластів до нанесеного Clq (Bordin, та туби, що містять цитрат натрію, витримували при Ghebrehiwet, J. Immun. 145:2520, 1990) обидва кімнатній температурі та використовували протяяких, можна думати, взаємодіють з калрецитулігом чотирьох годин після відбору. Суцільну кров ном поверхні клітин. аналізували на активацію тромбоцитів, використоПриклад 18 Продукування сироватки проти вуючи люмінесцентний агрегометр суцільної крові Zsiq37 Chrono-Log 560A Lumi-Aggregometer (Chrono-Log Кролячі поліклональні анти-сироватки виготоCorp., Haverton, PA) за інструкціями виробника. вляли імунізацією двох самиць новозеландських Для кожної дослідженої точки, 500мкл крові додабілих кролів очищеним від клітин ВНК zsig37-CEE. ли до реакційної туби, що містить мішалку та Білок конденсували з білком-носієм гемоціаніном 500мкл ізотонічного фізіологічного розчину, що блюдечка (KLH) за допомогою глутарового альдевключає zsig37 при концентраціях 0-20мкг/мл. Сугіду. Кролі отримували кожний інтраперитональну міш інкубували протягом чотирьох хвилин з насту(ір) ін'єкцію 200мкг пептиду у повному ад'юванті пною активацією тромбоцитів, яку ініціювали доФрейнда, супроводжуючи посилюючими інтрапедаванням до суміші KpoB/zsig37 5мкл розчину ритональними ін'єкціями 100мкг пептиду у непов1мг/мл перехресно-зшитого колагену (Chrono-Log ному ад'юванті Фрейнда кожні три тижні. Через 7Corp.). Інгібування активації за допомогою ADP 10 діб після одержання другої посилюючої ін'єкції, (кінцева концентрація 10мкМ,), та тромбіну (кінцеу тварин відбирали кров та збирали сироватку. У ва концентрація 1U/мл) тестували у аналогічно. тварин далі відбирали кров кожні три тижні. Інгібування опосередкованої колагеном актиПриклад 19 Детектування міченого FITC білку вації тромбоцитів за допомогою zsig37 виявляє Zsiq37 зв'язуванням у тканинах залежний від дози зв'язок між 5 та 20мкг/мл Мічений FITC Zsig37 білку зв'язування у ткани(Фіг.6а). Інгібування є селективним щодо активації нах визначали так. Вмонтовані в парафін та наріколагену та не впливає на стимульовану ADP або зані на слайди тканини ембріонів людини або миші 37 75037 38 отримали з комерційних джерел (тобто DAKO оголили сонну артерію. Приблизно 5см загальної Corporation, Carpintena, CA, BioGenex, San Ramon, сонної артерії ближчої до внутрішньо/зовнішнього CA, Novagen, Madison, Wl, та Biomeda, Foster City, розгалуження оголювали тупим відділенням від CA) або самі Зрізи тканин людини включали надоточуючої тканини та будь-які видимі бічні відганиркову залозу, мозок, серце, тонкий кишечник, луження припікали. Зонд потоку (Transonic товстий кишечник, нирки, печінку, легені, яєчник, Systems Inc., Ithaca NY) поміщали дистально щодо підшлункову залозу, простату, селезінку, шлунок, передбачуваної ділянки поранення та встановлюяєчка, щитовидну залозу, та матку. Зрізи ембріонів вали базовий потік крові. Зріз судини довжиною миші були від стадії 16 доби. 2,5-3,0см далі виділяли з циркуляції, використовуЗрізи тканин депарафінували, використовуючи ючи нетравмуючі судинні затискачі. Після видалення крові з сегменту судини 0,4мл zsig37 у 0,9% стандартні умови - 3 5 хвилин у ксилолі, 4 хвилихлориді натрію або 0,04мл 0,9% хлориду натрію як ни у 100% етанолі (ЕtOН), 3 хвилини у 100%контролю, ін'єктували у холостий сегмент судини, ЕtOН, та 2 хвилини у 95% EtOH. Зрізи тканин далі використовуючи голку 30G. Судину залишали непіддавали 20-хвилинному антигенному поверненпорушеною протягом 5-хвилинноі обробки попеню при 94°С за інструкціями виробника (DAKO реднього поранення. Поранення стисканням розCorporation), супроводжуючи 20-хвилинним розміром 1,0см наносили далі на центр сегменту щепленням 0,01% пепсин/0,2Η НСl. Зрізи тканин судини, використовуючи захищений гемостат та промивали двічі у dH2O та один раз у буфері залишали непорушеним протягом 10 хвилин. СуPBS/0,05%. Твін 20 (Sigma. St. Louis, МО) та далі динні затискачі далі видаляли та знов встановлюблокували протягом 45 хвилин 1 X РВS/5%ВSА/5% вали потік крові. Потік крові безперервно відслідобезжиреним сухим молоком (Carnation, Los ковували протягом 60 хвилин, після чого кролів Angeles, CA). Це супроводжували етапом блокуумертвляли та судину вирізали для гістологічного вання авідином/біотином, який виконали за інструаналізу. кціями виробника (Vector Laboratories, Inc , При цих концентраціях не спостерігали ніякої Burlingame, CA). Зрізи тканин промивали 3 рази у залежності від дози. Мета-аналіз усіх доз zsig37 буфер 1 X PBS/0,05% Твін 20 та далі інкубували з призводив до значного зростання у часі прохідносконцентрацією міченого FITC білку Zsig37 у ті при порівнянні з контролем у непарному t-тесті PBS/5%BSA протягом 45-60 хвилин. Після промив(Р=0,019). ки зрізів тканин 3 рази у 1 X PBS/0,05% Твін 20, їх Середній процент часу прохідності для комбіінкубували з розбавленим 1:400 анти-FITC (mо) нованого 3-групового негативного контролю тваМАb з конденсатом біотину (Sigma) протягом 30-60 рин, що визначено з записів потоку крові, складав хвилин, промивали 3 рази у PBS/0,05% Твін 20 та 13,5% зі стандартною похибкою ±1,7% Середній далі інкубували протягом 30-60 хвилин з розбавпроцент часу прохідності для комбінованих обробленим 1:500 стрептавідин-FITC (NEN Life Science лених zsig37 груп тварин, що визначено з записів Products, Boston, MA), супроводжуючи 2 промивпотоку крові, складав 37,2% зі стандартною похибками у 1 X PBS/0,05% Твін 20 буфер та 1 промивку кою ±10,3%. у 1 X PBS без Твін 20. Тканини зрізи далі поміщаУ других серіях експериментів використовували на предметне скло з проти-забарвлюючим сели флуоресцейований zsig37 у моделі поранення редовищем, що включає 0,5мкг/мл пропідійсонної артерії. Самців новозеландських білих кройодиду як проти барвник. лів анестезували як вищезазначено. Через розріз Помітне зв'язування спостерігали з стінками у щоці оголювали сонну артерію та приблизно 5см судини та тонкими волокнистими сполучними ткавідділяли від оточуючої сусідньої тканини. Кров з нинами, як-то колагенові матриці у більшості досвиділеного сегменту видаляли та накладали неліджених зрізів тканин людини та ембріонів. травмуючі судини затискачі. Приблизно 0,05мл Приклад 20 Zsig37 у моделі поранення кроляфлуоресцейованого zsig37 (концентрація чої сонної артерії 100мкг/мл) ін'єктували у виділений сегмент до поZsig37 застосовували у модифікованій моделі вного заповнення судини, використовуючи голку поранення кролячої сонної артерії [Foils et al., 30g. Після витримки протягом 5 хвилин судину Circulation, 79 116-24, 1989 та Golino et al., пошкоджували та залишали ще на 110 хвилин, Thrombosis та Haemostasis 67:302-5, 1992] для після чого затискачі видаляли та знов встановлювизначення ступеню захисту, що пропонується при вали потік крові. Тварин умертвляли як описано попередженні закупорки судин після поранення вище на 1, 10, та 60 хвилинах після встановлення стисканням. потоку крові та судини збирали та фіксували у фоТридцять чотири самця новозеландських білих рмаліні для гістологічної оцінки. кролів, віком приблизно 3-6 місяців (R&R Rabbitry, Міченій zsig37 преференційно зв'язуються з Stanwood, WA) поділяли на дві групи. П'ятнадцять рецептором у середовищі поранених судин. Мічені кролів отримували дозу zsig37 від 2 до 13,5мкг/кг, zsig37 не приєднуються ділянок судини, що є неа 19 контрольних кролів ін'єктували PBS або еквіпораненими. Час потоку крові до відбору судин не валентною кількістю PBS або zsig39, іншого спорівиявлений як впливаючий на кількість zsig37, що дненого з адипоцит-комплементом білку залишається з'єднаною з тканиною, тобто, нема (W099/10492). Кролів анестезували кетаміном ніякої різниці у кількості міченого zsig37 з'єднаного (50мг/кг, lМ) та підтримували анестезію інгаляціяз тканиною у 1 хвилин у порівнянні з 60-хвилинним ми галотану протягом дослідження. Волосся з часом відбору. Це може свідчити, що zsig37 комушей та щік збривали та поміщали у невелику вупактно приєднується до пораненої судини та не шну вену анпокатетер для внутрішньовенної підтвимивається знов встановленим потоком крові. римки. Зробили розріз по середній лінії щоки та 39 75037 40 Вплив zsig37 на динаміку потоку крові після кілець скорочували додаванням 10мкМ серотоніну. поранення судин у моделі поранення стисканПісля досягнення максимального скорочення, приням/стенозом кролячої клубової артерії оцінювали близно через 15-20 хвилин після додавання серотакож. Молодих дорослих самців новозеландських тоніну будували криві кумулятивної концентраційбілих кролів анестезували як описано вище. Через ної реакції zsig37. Zsig37 додали до бань по 5мл у абдомінальний розріз оголювали розгалуження об'ємах від 5 до 150мкл до кінцевих концентрацій клубової артерії та кожну клубову звільняли від в межах від 1нг/мл до 40мкг/мл. Життєздатність оточуючої тканини та перев'язували головні відгазрізів кілець підтверджували по закінченню концелуження. Кожну клубову обладнували ультразвунтраційної реакції додаванням форсколіну (2,5мкМ ковим зондом потоку для моніторингу потоку крові або 25мкМ) або нітрогліцерину (22 мкМ). через судину. На основі даних про потік крові одну Додавання zsig37 індукувало концентраційноклубову відбирали для використання при поразалежну вазорелаксацію скорочених серотоніном ненні, а інші катетеризували для отримання тестзрізів аорти щура з непошкодженим субендотелієм зразку. Кролів поділяли на групи дозування по 6 чи без нього. Релаксацію у реакції zsig37 спершу тварин/групу. Дози тест-зразку, що включає zsig37 спостерігали при концентраціях вище 100нг/мл. збільшували з напівлогарифмічним інкрементом Релаксацію спостерігали приблизно 30-60с після від 3 до 1000мкг/кг протягом вибраного періоду додавання кожної концентрації zsig37 до бані, та вливання. Вливання тест-зразків починали, супрореакції релаксації виходили на плато протягом 3-5 воджуючи створенням критичного стенозу, що хвилин після додавання zsig37. Характер релаксазменшував потік крові через судин приблизно на ції реакції на zsig37 свідчить, що вазорелаксація є 50%. Після створення стенозу та стабілізації потоопосередкованим рецептор-додатковим месенку крові, судини пошкоджували їх стисканням між джером результатом. Додатково, здатність zsig37 захватами гладких тримачів голок. Вливання продо вазорелаксації з оголеним субендотелієм зрізів довжували після поранення протягом 10-20 хвиаорти свідчить, що zsig37 діє безпосередньо на лин. Потік крові через поранену судину відстежуклітини гладеньких м'язів для виклику реакції вавали протягом 60 хвилин після поранення. Тварин зорелаксації. умертвляли по закінченню дослідження. Нижчий Приклад 22 Ідентифікація клітин, що експрезріз черевної аорти та кожну клубову збирали та сують рецептор zsig37, використовуючи гібридифіксували у формаліні для гістологічної оцінки. зацію in situ Параметри потоку крові, що визначено за заСпецифічні тканини людини виділяли та скриписами потоку, включали середні потоки після нували на експресію zsig37 гібридизацією in situ. стенозу, середні потоки після поранення, та час, Різні людини тканини, виготовлені нарізані та підпротягом якого судини залишалися прохідними. Ці дані гібридизації in situ, включали аорту, серце результати підтверджують тенденцію zsig37 пролімфатичний вузол, плаценту, простату, слинні мотувати зростання часу розкритого стану зі збізалози, шкіру та яєчка. Тканини фіксували у 10% льшенням дози до 300мкг/кг протягом 60буферованому формаліні (Surgipath, Richmond, IL) хвилинного періоду. та умурували у парапласт X-tra (Oxford Scientific, Приклад 21 Релаксація індукованого серотоніSt. Louis, MO) і нарізали на слайди товщиною 5мкм ном скорочення кілець аорти щурів мікротомом Reichart-Jung 2050 (Leica Instruments Самців щурів Sprague-Dawley віком приблизно GmbH, Nussloch, Germany). Тканини були наріза3 місяці слабко анестезували СО2 та обезголовними товщиною 4-8мкм. Тканини виготовляли, лювали. Грудну аорту далі швидко видаляли та використовуючи стандартний протокол поміщали у модифікований буфер Кребса(Development of nono-isopotic in situ hybridization" Генселейта (NaCI, 1,18,2мМ, KСl 4,6мМ, СаСІ2, (Розробка ноно-фзопотичної гібридизації in situ), 2,5мМ MgSO4 7H2O, 1,2мМ, NaHCO3, 24,8мМ, Laboratory of Experimental Pathology, National KН2РО4, 1,2мМ, та глюкоза, 10,0мМ). З кожного Institute of Environmental Health Sciences, Research щура вирізали чотири зрізи кілець аорти по 2-3мМ Park Triangle, NC). Коротше, зрізи тканин депарапісля відкидання нерівного закінчення аорти. В фінували за допомогою HistoClear (National деяких дослідах субендотелій оголяли до вирізанDiagnostics, Atlanta, GA) та дегідратували далі ня зрізів кілець тертям порожнини аорти вздовж 21 етанолом. Потім зрізи розщеплювали протеїназою мірних голок. Оголення субендотелію підтверджуK (50мкг/мл) (Boehrsnger Mannheim, Indinanapohs вали додаванням аналогу ацетилхоліну, карбахоIN) при 37°С протягом 2-20 хвилин. Цей етап сулу, для визначення концентраційно-залежних реапроводжували ацетилуванням та регідратацією кцій zsig37. У відсутність субендотелію не тканин. викликав вазорелаксаційного скорочення зрізів Створені за допомогою PCR три зонди in situ кілець судин. конструювали щодо послідовності zsig37 людини. Кільця фіксували та приєднували до датчика Два набори олігонуклеотидних праймерів конссили зсуву у оксигенованій (95% О2, 5% СО2), обтруювали для створення зондів для розділення шитої зовні, скляної бані органів при 30°С у модирегіонів кДНК zsig37: (1) Олігонуклеотид ZC23689 фікованому буфері Кребса-Генселейта, рН7,4. (SEQ ID NO:45) та ZC23694 (SEQ ID NO:46) викоНатяг у стані покою задавали при навантаженні 1г ристовували для створення зонду розміром 414 по та безперервно підрегульовували до 1г протягом 1 для zsig37; (2) Zc23703 (SEQ ID NO:47) та години інкубування. Свіжий оксигенований модиZC23697 (SEQ ID NO:48) використовували для фікований буфер Кребса-Генселейта додавали до створення зонду розміром 896 для zsig37; (3) бані кожні 15 хвилин протягом інкубування у стані ZC24441 (SEQ ID NO:49) та ZC24442 (SEQ ID покою. По закінченню 1 години інкубування, зрізи NO:50) використовували для створення зонду ро 41 75037 42 зміром 290 по для zsig37. Анти сенсові оліго з кожпри кімнатній температурі протягом 70 хвилин. ного набору також містили робочу послідовність Шістдесят мкл відновленого zsig37 уводили у анадля промотерів РНК полімерази Т7, щоб полегшиліз SEC-MALLS, а залишок відновленого zsig37 ти транскрипцію зондів антисенсової РНК від цих діалізували у касетах по 0,5-3,0мл Slide-A-Lyzer, продуктів. Продукти PCR очищали колонками 10K MWCO (Pierce, Rockford, IL) з перемішуванням Qiagen spin (Qiagen Inc., Chatsworth, CA), супровопроти PBS, pH7,4 з трьома змінами буферу таким джуючи екстракцією фенолом/хлороформом та чином 1л PBS при кімнатній температурі протягом осадженням етанолом. Зонди далі мітили дигокси4 годин, 1л PBS при 4°С протягом ночі, та 1л PBS гніном (Boehnnger) або біотином (Boehnnger) викопри кімнатній температурі протягом 4 годин. ристовуючи in vitro систему транскрипції (Promega Після діалізу окиснення продовжували при Corp., Madison, WI) за інструкціями виробника. 4°С. Окиснення відслідковували аналізом SECIn situ гібридизацію здійснили з міченим дигокMALLS узятих у три моменти часу аліквот, Т=0 сигеніном або біотином зондом zsig37, що описано годин, Т=24 години, та Т=96 годин. Величини мовище. Зонд додали до слайдів при концентрації 1лекулярних мас визначали, використовуючи дво5пмоль/мл протягом 12-16 годин при 50-60°С. детекторний спосіб LS-RI. Слайди далі промивали у 2 Х SSC та 0,1 Χ SSC Аналіз відновленого діалізованого рекомбінанпри 50-55°С. Слайди далі промивали у 2 Х SSC та тного zsig37 спочатку показує утворення гексаме0,1 Х SSC при 50-55°С. Сигнали ампліфікували, рів та 18-мерів, як визначено SEC-MALLS що кравикористовуючи тирамідну ампліфікацію сигналу ще збігається з олігомерними станами, що (TSA in situ непрямий комплект, NEN, Boston, MA) спостерігали у гомологах. Ці форми були також та візуалізували комплектом субстратів Vector Red активними у дослідженні in vitro. (Vector Laboratories, Burlmgame, CA) за інструкціяПриклад 24 Зв'язування zsig37 з моноцитами ми виробника. Слайди далі протизабарвлювали СD14-позитивні моноцити виділяли з заморогематоксиліном (Vector Laboratories). женого продукту афаерезісу периферійної крові, Позитивні сигнали спостерігали у аорті людивикористовуючи спосіб позитивної селекції з кульни, серці, простаті, слинних залозах та яєчках. ками Miltenyi (Miltenyi Biotec Auburn, CA). Очищені Позитивно забарвлені клітини виявлені як ендотеклітин були більше ніж на 80% СD14-позитивними ліальні клітини судин невеликого діаметру у отопри FACS-проявленні. Клітини ресуспендували чуючій аорту адвентиції, мезотеліальні клітини, що при 1 106клітин/мл у RPMI+10% сироватки коропокривають епікард, ацинозні клітин слинних залоз в'ячого ембріону (FBS) та наносили на 100мМ чата розрізнені мононуклеарні клітини, трофобласти шки для культур тканин, 5мл/планшет. Рекомбінаплаценти епітеліальні клітини простати та стратинтний інтерферон γ людини додали при 100нг/мл фікованого епітелію сім'явиносних каналів яєчок. та клітини інкубували при 5% СО2, 37°С протягом Приклад 23 SEC-MALLS-аналіз Zsiq37 48 годин. Zsig37 включає N-кінцевий колагеновоКлітини видаляли з планшетів безферментним подібний домен, а також С-кінцевий глобулярний способом використовуючи ЕДТА та вискоблюванрегіон, що гомологічний родині фактору некрозу ня, концентрували центрифугуванням, ресуспенпухлин та подібно іншим таким білкам можна чекадували у FACS-проявочному буфері та аліквотути, zsig37 буде мультимеризуватися. Очищений вали при 500000 клітин/тубу для проявлення. zsig37, що аналізували, використовуючи масНеактивовані клітини отримали проведенням іншої спектрометр з пасткою ESI-іон (Finnigan Matt, San СО14-селекції того ж самого продукту афеорезису Jose, CA), показав наявність специфічних апрокпісля 48 годин витримки у γ-інтерфероні. Клітини симаційних тримерів та 9-мерів, які були неочікуінкубували у змінних концентраціях біотинілованованими результатами при порівнянні з іншими гого zsig37, супроводжуючи стрептавідином РЕ. Усі мологічними білками. Пептидне картування zsig37, блокування з "холодним" zsig37 виконали на льоді використовуючи мас-спектрометр LC-MS/MS з протягом 30 хвилин. Незв'язаний білок видаляли пасткою ESІ-іон (Finnigan Matt), виявило, що кілька промивкою один раз у FACS-буфері. Зв'язування цистеїнових залишків модифіковані Sкількісно визначали, використовуючи FACSцистеінільною групою. Може бути, що модифікація калібрований інструмент (Becton Dickinson, Lincoln ключового цистеїнового залишку у білку zsig37 Park, NJ), та експресували як тільки контроль сигпротягом ферментації з вільним цистеїном у серенального визначеного вище вторинного антитіла. довищі попереджає можливу олігомерну асоціацію Активацію моноцитів підтверджували зростанням цих молекул. приблизно на порядок у експресії ІСАМ-1 в обробДля кращого вивчення порівнювали відновлелених γ-інтерфероном клітинах. ний та невідновлений zsig37, використовуючи коЗв'язування Zsig37 визначали у активованих лонку з виключенням за розміром Biosep S-300 та неактивованих моноцитах зі зростанням зв'язупри 1,0мл/хвилину (7,8 3000мМ Phenomenex вання zsig37, що спостерігали у оброблених γTorrance, CA) на ВЕРХ HP 1050 (Hewlett Packard, інтерфероном клітинах. Зв'язування визначили до Heidleberg.-Germany)-HP 1050 сполучали з слабко 1,5мкг/мл, найнижчої тестованої концентрації. При розсіюючими детекторами за показником залом15мкг/мл, зв'язування зростало приблизно у 4 рази лення, miniDAWN та Optilab DSP, (Waytt у активованих клітин. Слабке (приблизно 10%) Technology Santa Barbara CA) для працюючого в зменшення у зв'язування спостерігали тільки у режимі онлайн SEC-MALLS. активованих клітин, що були попередньо оброблеОдин міліграм рекомбінантного zsig37 ні 70-кратним надлишком "холодного" zsig37. Збі(1,0мг/мл) додали до ТСЕР при співвідношенні льшення зв'язування zsig37 у активованих моно10:1моль/моль ТСЕР щодо zsig37 та витримували цитах підтверджує надрегуляцію зв'язуючих 43 75037 44 моноцити білків/рецепторів на zsig37 запальними ноцитів/макрофагів миші RAW 264,7 (АТСС цитокінами. Це могло би потенційно призводити до No.CRL-2278), показуючи специфічність макрозалучення zsig37 у фагоцитоз моноцитів, знищенфагів. ня мікробів та клітинної цитотоксичності. Через дві З визначеного вище ясно, що хоча конкретні доби у культурі макрофаги з'являються у культурі втілення винаходу уписані тут для ілюстрації, мота zsig37 може бути преференційно зв'язаним з жна зробити різні модифікації, не виходячи за рацією підмножинністю клітин. Нема гарних маркерів мки змісту та духу винаходу. Відповідно, винахід макрофагів, які придатні для визначення, чи відбуне обмежено нічим окрім доданої формули винавається це Zsig37 також приєднується до лінії моходу. Фіг.1 Продовження Фіг.1 45 75037 Продовження Фіг.1 46 47 75037 Продовження Фіг.1 48 49 75037 Продовження Фіг.1 50 51 75037 Продовження Фіг.1 52 53 75037 54 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601